一种小球藻高效率光自养培养方法

摘要

本发明提供一种小球藻高效率光自养培养方法，在光生物反应器中加入培养液，接入小球藻，并保证藻细胞密度≥100万/毫升，采用自然光照，白天光强度在10‑130Klx，光照周期12/12，通空气量1.0‑10.0L/min，二氧化碳气体通入量0.05‑0.5L/min，藻液温度为26‑33℃，pH保持在7.0‑9.0；本发明实现了连续培养时间长、产量高、营养盐利用率高的高效率规模化生产，整个培养期，采收的藻干基为22.131‑23.181千克，藻体蛋白质含量达到55％以上，营养盐利用率达到90％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种小球藻高效率光自养培养方法。

背景技术

小球藻为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形、椭圆形单细胞藻类，直径3～8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，世界各地均有分布，多生活于较小浅水，也有海产种类。天然条件下个体较少，人工培养大量繁殖。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可食用和作为饵料。

光合作用可简单地概括为含光合色素主要是叶绿素的植物细胞和细菌，在日光下利用无机物(CO₂、H₂O、H₂S等)合成有机物(C₆H₁₂O₆)，并释放氧气(O₂)或其他物质(如S等)的过程。同时光合作用是地球上进行的最大的有机合成反应。每天从太阳到地球的能量约为1.5×10²²KJ，其中约1％被光合生物吸收，通过光合作用转化为分子形式的化学能，并通过食物链为生物圈的其他成员所利用。因此，太阳光是地球上几乎所有生物所需能量的最终来源。

目前，根据小球藻代谢类型，小球藻的主要培养方式分为自养型、兼养型和异养型。自养培养存在培养密度低、生长周期长等缺点；兼养培养存在需要提供现成的有机碳源作为其生长的能量来源所导致能源的消耗问题，同时，异养过渡到自养阶段容易造成藻体不适，从而导致藻体出现一部分死亡现象等缺点；异养培养同样存在消耗现成有机碳源的情况，并且经过异养的小球藻细胞内积累的营养物质如蛋白质、叶绿素、维生素等普遍比自养小球藻体内积累的有关物质低。

发明内容

针对上述3种培养方式存在的问题，本发明提供一种短时间内达到连续培养时间长、高效率产出、营养盐利用率高的小球藻光自养培养方法，该培养方法包括如下步骤：

(1)在自来水中加入营养盐充分溶解得到培养液，使用紫外杀菌装置对培养液进行杀菌处理，使杀菌过后培养液中微生物含量少于100cfu/毫升；

(2)在光生物反应器中加入培养液，接入小球藻，并保证藻细胞密度≥100万/毫升，进行光自养培养；

(3)培养采用自然光照，白天光强度在10-130Klx，光照周期12/12，通空气量1.0-10.0L/min，二氧化碳气体通入量0.05-0.5L/min，藻液温度为26-33℃，pH保持在7.0-9.0；

(4)培养过程中，藻液中光照强度衰减至50％时开始采收，每次采收50％藻液，再补充新鲜培养液，这样的操作每隔1天重复一次，直到小球藻培养进入衰退期，培养结束。

所述补充培养液的方法采用匀速方式添加，一次添加完毕使用时间与藻液循环一周所需时间相同。

所述营养盐组成包括：尿素0.38-0.47g/L，MgSO₄·7H₂O>2PO₄0.095-0.12g/L，硫酸亚铁0.005-0.006g/L，CaCl₂·2H₂O>3BO₃>2·4H₂O>4·7H₂O>2MoO₄·2H₂O>4·5H₂O>3)₂·6H₂O>

对采收的小球藻进行离心、清洗、干燥获得干藻粉，测定其藻干基；藻体内蛋白质含量测定采用《食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2010)凯氏定氮法测定；培养水体中总磷测定采用在中性条件下加入过硫酸钾(或硝酸-高氯酸)氧化的国家标准方法(GB/T 11893-89)；总氮测定采用碱性过硫酸钾在120-124℃消解、紫外分光光度定量的国家标准方法(GB/T11894-1989)。

与现有的技术相比，本发明有如下优点：(1)小球藻培养用水经过灭菌处理，其质量符合现行中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》的相关规定；(2)改良了小球藻营养盐配方，使其满足小球藻生理上所需营养盐的最佳比例；(3)在光自养培养过程中，在藻液中光照强度衰减至50％时收获一部分，余下的藻液中再添加新鲜培养液，单细胞藻的生命得到延续，保证了藻细胞的活力，提高藻细胞生长速率，延长持续培养周期。本培养方法实现了高效率规模化生产，在5.5吨光生物反应器中，小球藻可以连续培养20天，从第6天起，每2天采收一次，每次采收50％藻液，对采收的藻液进行离心、清洗、干燥获得干藻粉，测定藻干基与藻体内蛋白质含量，整个培养期，采收的藻干基为25.203-25.226千克，藻体蛋白质含量达到69％以上，营养盐利用率达到90％以上。

具体实施方式

通过具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

首先在自来水中加入下表1组份营养盐，待各组份充分溶解后，经紫外灭菌加入到5吨的光生物反应器中，接种小球藻，并保证藻细胞密度为100万/毫升，开始小球藻光自养；自养培养条件为：采用自然光照，白天光强度在10-130Klx，光照周期12/12，通空气量1.0L/min，二氧化碳气体通入量0.05L/min，藻液温度为26-33℃，pH保持在7.0-9.0；在培养第6天起，每隔1天采收一次，每次采收50％的藻液，再补充新鲜培养液继续培养，直到第20天，培养结束。对采收的小球藻进行离心、清洗、干燥获得干藻粉，测定其藻干基与藻体内蛋白质含量，整个培养期，采收的藻干基为25.226千克(见表4)，藻体内蛋白质为69.2％-70.9％(见表5)；检测培养水体的总氮总磷消耗率情况，总氮总磷利用率分别达到90.05％-91.54％和90.12％-91.56％(见表6)。

表1

尿素0.38g/LMgSO₄·7H₂O0.25g/LKH₂PO₄0.095g/L硫酸亚铁0.005g/LCaCl₂·2H₂O0.02g/LA5微量元素液0.8mL

备注：生长分析，计算平均每天生物产量，公式如下：K＝(InN₂–InN₀)/(T₂–T₀)，其中K为生物产出效率，作为采收判断依据之一；T₀、T₂为对应的培养时间；N₁和N₂分别为T₀、T₂时的生物量；T₀为接种当天。

实施例2

首先在自来水中加入下表2组份营养盐，待各组份充分溶解后，经紫外灭菌加入到5吨的光生物反应器中，接种小球藻，并保证藻细胞密度为120万/毫升，开始小球藻光自养；自养培养条件为：采用自然光照，白天光强度在10-130Klx，光照周期12/12，通空气量10.0L/min，二氧化碳气体通入量0.5L/min，藻液温度为26-33℃，pH保持在7.0-9.0；在培养第6天起，每隔1天采收一次，每次采收50％的藻液，再补充新鲜培养液继续培养，直到第20天，培养结束。对采收的小球藻进行离心、清洗、干燥获得干藻粉，测定其藻干基与藻体内蛋白质含量，整个培养期，采收的藻干基为25.203千克(见表4)，藻体内蛋白质为69.2％-70.9％(见表5)；检测培养水体的总氮总磷消耗率情况，总氮总磷利用率分别达到90.12％-91.9％和90.22％-91.89％(见表6)。

表2

实施例3

首先在自来水中加入下表3组份营养盐，待各组份充分溶解后，经紫外灭菌加入到5吨的光生物反应器中，接种小球藻，并保证藻细胞密度为140万/毫升，开始小球藻光自养；自养培养条件为：采用自然光照，白天光强度在10-130Klx，光照周期12/12，通空气量5.0L/min，二氧化碳气体通入量0.2L/min，藻液温度为26-33℃，pH保持在7.0-9.0；在培养第6天起，每隔1天采收一次，每次采收50％的藻液，再补充新鲜培养液继续培养，直到第20天，培养结束。对采收的小球藻进行离心、清洗、干燥获得干藻粉，测定其藻干基与藻体内蛋白质含量，整个培养期，采收的藻干基为25.216千克(见表4)，藻体内蛋白质为69.2％-70.9％(见表5)；检测培养水体的总氮总磷消耗率情况，总氮总磷利用率分别达到91.21％-92.01％和

91.24％-92.09％(见表6)。

表3

尿素0.40g/LMgSO₄·7H₂O0.50g/LKH₂PO₄0.10g/L硫酸亚铁0.005g/LCaCl₂·2H₂O0.025g/LA5微量元素液0.9mL

表4采收藻干基情况

表5采收后检测藻体蛋白质含量

表6培养水体的总氮总磷情况