番茄红素与α‑硫辛酸作为哺乳动物精液冷冻保存剂的应用

摘要

本发明涉及番茄红素与α‑硫辛酸配伍作为哺乳动物精液冷冻保存液的应用。本发明采用了番茄红素和α‑硫辛酸，能够在哺乳动物精液的冷冻‑解冻过程中很好地保护哺乳动物精子的生理活性。

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物精液冷冻保存剂，具体涉及番茄红素与α-硫辛酸配伍作为哺乳动物精液冷冻保存剂的应用。

背景技术

哺乳动物精液的冷冻保存技术被广泛应用于动物生产，成为优良家畜品种高效繁育、加快杂交改良的重要手段；同时也为动物胚胎移植、体外受精等提供了不受时间和空间限制的材料。但是，目前精液冷冻过程中普遍存在的对精子的物理性损伤、化学性损伤和氧化应激损伤等，大大降低了精液冷冻保存效果。在精液的冷冻保存过程中，有必要在冷冻稀释液中添加外源的抗氧化保护剂，以减少ROS对精子质膜的氧化损伤。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于哺乳动物精子低损伤冷冻保存的稀释液。

本发明以番茄红素和α-硫辛酸作为哺乳动物精液的冷冻稀释液的组分，以冷冻保存后山羊精子活率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性以及SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性等作为评定指标，并探究番茄红素和α-硫辛酸的最佳配伍浓度，以保持哺乳动物精子在冷冻-解冻后具有良好的生理活性。

本发明同时还提供了包含番茄红素与α-硫辛酸的哺乳动物精液的冷冻稀释液。

进一步，本发明的哺乳动物精液的冷冻稀释液组分为：每100mL所述哺乳动物精液的冷冻稀释液的配方为：Tris 3.25g，柠檬酸1.74g，果糖1.14g，青霉素200000IU，链霉素100000IU，卵黄15mL，甘油5mL，番茄红素100mg，α-硫辛酸0.5mg,其余为水。

另一种方案中，本发明的哺乳动物精液的冷冻稀释液组分为：每100mL所述哺乳动物精液的冷冻稀释液的配方为：Tris 3.25g，柠檬酸1.74g，果糖1.14g，青霉素200000IU，链霉素100000IU，卵黄15mL，番茄红素100mg，α-硫辛酸0.5mg,其余为水。

本发明的哺乳动物精液的冷冻稀释液配方，由于采用了番茄红素和α-硫辛酸，能够在哺乳动物精液的冷冻-解冻过程中很好地保护哺乳动物精子的生理活性。

附图说明

图1为番茄红素和α-硫辛酸配伍对山羊精液冻后SOD(A图)、CAT(B图)及GSH-Px(C图)活性的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

实施例：

按照本发明的技术方案，本实施例给出六组用于哺乳动物精液冷冻保存的番茄红素与α-硫辛酸配伍的稀释液配方，分别称取0mg、50mg、100mg番茄红素和0mg、0.5mg、1mgα-硫辛酸，两者按照表1所示进行配伍，其他成分根据表2其所占的比例称取。

表1番茄红素与α-硫辛酸配伍方案

表2番茄红素与α-硫辛酸配伍稀释液配方(每100ml)

注：青链霉素双抗在冷冻保护前单独添加。

上述实施例中哺乳动物精液的冷冻保存稀释液用于哺乳动物精液的冷冻-解冻的方法，按下列步骤实施：

(1)检测合格后，按照精液：冷冻稀释I液为1:2的比例将精液稀释，加入含有不同浓度番茄红素和α-硫辛酸的冷冻稀释I液，放置于4℃冰箱中降温平衡2h；

(2)将第一次稀释和平衡后的精液按照1:2的比例加入等温(4℃)的冷冻稀释II液进一步稀释，4℃冰箱中平衡1.5h；

(3)以1℃/min的速率从5℃降至-5℃，将细管置于液氮面上方2～3cm处达6～8min，然后将细管投入液氮中冷冻保存；

(4)冷冻14d后，在37℃水浴锅中解冻30s，测定冻后精子活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性及抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性值。

番茄红素与α-硫辛酸按照表2配伍方案添加，同一配方下，除甘油之外的其他试剂的混合液为冷冻稀释I液，所有试剂(包含甘油)的混合液为冷冻稀释II液。

试验冷冻所用的山羊精液来自榆林陕北白绒山羊试验基地。采用假阴道法采集种公羊精液，进行常规品质检查，精子活力达到0.8以上方可用于冷冻保存，在lh内运回实验室。

将检测合格后的精液按照1:2的比例加入冷冻稀释I液，经多层纱布包裹后，放置于4℃冰箱中降温平衡2h。然后将第一次稀释和平衡后的精液按照1:2的比例加入等温的(4℃)的冷冻稀释II液进一步稀释，使精液与稀释液的最终比例为1:4，经多层纱布包裹后，4℃冰箱中平衡1.5h。装管后，将细管放入程序冷冻仪中控制其以1℃/min的速率从5℃降至-5℃，再将其置于液氮面上方2～3cm熏蒸6～8min，最后将细管投入液氮中冷冻保存。

保存14d后将冷冻细管投入37℃水浴中解冻30s。常温环境下，在400×光学显微镜下观察并统计呈直线运动的精子数，计算精子活率(表3)。

采用异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)染色的方法检测精子顶体完整率，即将30μL精液样品均匀涂抹于载玻片上，待自然干燥后，甲醇固定10min，然后加入10μL FITC-PNA染液，37℃潮湿环境下避光孵育30min，PBS冲洗2次，空气干燥，用无色指甲油封片，在荧光显微镜下观察并计算精子顶体完整率(表3)。

采用低渗肿胀试验(HOST)检测精子质膜完整率，即取20μL解冻孵育后的精液样品加入等温HOST低渗溶液200μL混匀，37℃孵育1h后取10μL均匀涂抹于载玻片上，在400×倒置显微镜下观察5个视野，计算精子弯尾率(表3)。

精子线粒体活性的检测，即将1μL碘化丙啶(PI)贮存液和1μL罗丹明123(Rh123)贮存液混合后避光培养10min，将解冻后的精液用精液稀释I液稀释，吸取50μL加入上述避光培养的PI和Rh123混合液，培养30min，取10μL样品制片，然后在400×倒置显微镜下观察并计算精子线粒体活性(表3)。

按照南京建成生物科技公司所提供的试剂盒说明书对精液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等酶的活性进行检测(图1)，并将测得数据代入相关公式准确计算，所有结果均用平均值±标准差表示。

表3联合添加番茄红素和α-硫辛酸对山羊精液冷冻效果的影响

根据以上操作步骤，测定得到冻存14d后的山羊精子活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性及抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。