T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途

摘要

本发明涉及包含原核细胞的表达系统，所述原核细胞含有多核苷酸构建物，该多核苷酸构建物编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶。本发明还涉及含有基因的表达载体，所述基因编码在T7启动子控制下的待表达蛋白，特征在于所述表达载体包含质粒稳定系统。

说明书

本发明涉及T7表达系统、其生产方法以及其用于无抗生素生产重组蛋白的用途。

T7表达系统用于重组蛋白的表达。通常T7启动子序列位于载体上并且重组蛋白的编码区在其下游核糖体结合位点之后。由于表达生物体并不产生T7聚合酶，此种表达系统仅在T7聚合酶已被人工引入系统时才会发挥作用。对于此，最常见的方法是在生产生物体中对T7表达盒进行基因组锚定(genomic anchoring)。用于在BL21(DE3)大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中表达蛋白的基于T7聚合酶的原核系统很早就已知了。在此系统中，将T7聚合酶整合至大肠杆菌(E.coli)基因组中是在DE3λ噬菌体进入大肠杆菌的λ附着位点的辅助下发生的。在此系统中，T7噬菌体聚合酶识别T7噬菌体启动子。然而，此系统具有的缺点是目标基因表达期间的质粒稳定性低。许多研究曾经尝试使T7表达系统的表达水平稳定，但是目前还未有明显的成功。此外，大肠杆菌含有大约40kb的λ噬菌体DNA。此噬菌体DNA是不期望的，至少在用于药物蛋白的表达系统中是不期望的。另外，在T7表达系统中，迄今为止总是会使用含有抗生素抗性基因作为表达期间用于克隆和筛选的选择标记物的表达载体。

然而，使用抗生素用于质粒的筛选是种关键的不足之处，特别是在生产治疗性蛋白时。监管机构更加接受无抗生素的方法，因为产物对于患者会更安全，以及由于较少的终产物分析(消除产物中的抗生素)从而可以构建明显更加经济的方法。使得无抗生素蛋白生产成为可能的表达载体例如在EP1697523B1中已知。然而，此表达载体并不适宜于T7表达系统。

本发明目的是提供T7表达系统用于无抗生素生产重组蛋白，其由原核细胞和表达载体构成，相比已知T7表达系统展现出提升的表达载体稳定性。

此问题通过包含原核细胞的表达系统而解决，所述原核细胞含有编码在T7启动子控制下以及在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶的核苷酸构建物，以及含有编码待表达重组蛋白的基因(在T7启动子的控制下)的表达载体，特征在于所述表达载体含有质粒稳定系统。

质粒稳定系统例如在Sengupta和Austin,Infection and Immunity,July 2011,p.2502-2509中已知。优选其是来自以下组的质粒稳定系统：多聚体分辨系统(multimerresolution system,mrs)、分离系统(partitioning system,par)、和解离后致死系统(postsegregational killing system,PSK)。特别优选所述质粒稳定系统含有来自多聚体分辨系统的组的序列，且尤其优选此为cer序列。

所述可诱导启动子优选为来自以下组的启动子：tac、lac、trp、和phoA。特别优选其是可诱导启动子lacUV5。

所述核苷酸构建物优选是由以下所构成的核苷酸构建物：编码T7 RNA聚合酶的核苷酸序列，lacUV5启动子的核苷酸序列(包括来自大肠杆菌的lacZ基因的5’末端和T7启动子序列)。此种核苷酸构建物在SEQ ID NO:1中再现。特别优选地，所述核苷酸构建物被整合至本发明表达系统原核细胞的基因组中。

所述原核细胞优选是在基因组中具有T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌菌株的细胞。此类菌株可以通过本身已知的方式从野生型菌株(如可得自菌株保藏)产生。此类菌株的实例有大肠杆菌菌株BL21(可以从Stratagene,La Jolla USA商业购买)HMS174(DSM5932)、或C600(DSM426)(可以说是DSM编号而得自Deutschen Sammlung für Mikroorganismen andZellkulturen GmbH(DSMZ)[德国微生物和细胞培养保藏中心],38124 Brauschweig,Inhoffenstraβe 7B)。

优选地，通过将本发明背景下开发的T7表达载体引入至这些菌株中来产生本发明的T7表达系统。

本发明的此种表达载体优选以功能性的连接而具有以下组分：

复制起点(ori),

作为调控序列的T7启动子,

编码要表达的重组蛋白的序列，

抗生素抗性基因作为克隆的选择标记物，

终止子，

阻遏基因，

适宜于所述阻遏基因的操纵基因序列，和

质粒稳定系统。

优选其是已经提到过的一种质粒稳定系统。特别优选所述质粒稳定系统含有cer序列。

优选复制起点是pBR322-ori、pUC19-ori或p15A-ori，特别优选pBR322-ori。

特别优选终止子为t₀、rrnB或T7终止子。

阻遏基因是编码这样的蛋白的任何基因，所述蛋白在结合至启动子区域时启动子阻止基因的转录。特别优选地，所述阻遏基因是lacI基因。

优选地，抗生素抗性基因是kan、tet、bla、cm^R、或tetA，特别优选kan。

本发明的T7表达系统可像已知T7表达系统那样产生，区别在于本发明的表达载体被引入至在基因组中具有T7 RNA聚合酶基因的原核细胞中。

本发明另外的目的是提供用于产生原核细胞(作为本发明T7表达系统的一部分，其实现T7 RNA聚合酶(包括控制区)整合至原核细胞内)的优选实施方案的方法，过程中没有发生噬菌体DNA整合至细胞内。

此方法的特征在于通过“位点特异性”重组的手段将T7 RNA聚合酶(包括控制区)的编码序列整合至原核细胞的基因组中.

此种“位点特异性”重组是例如通过来自噬菌体P1的Cre-lox系统和来自酵母的FLP-FRT系统而得以实现的。使用“位点特异性”重组用于染色体细菌DNA的改造例如在Datsenko和Wanner,PNAS,June 6,2000no.12,p.6640-6645中有描述。

优选地，在可诱导启动子的控制下实现T7 RNA聚合酶的靶向整合至大肠杆菌基因组中的指定位置，优选大肠杆菌的proBA序列。此类方法例如从Datsenko和Wanner,PNAS,June 6,2000no.12,p.6640-6645中已知。

此方法所产生的含有整合至基因组的核苷酸构建物(编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶)的原核细胞，与含有此种构建物的已知原核细胞的区别在于，其不含有λ噬菌体DNA。完全出乎意料的是，据发现在此种细胞中常规表达载体也展现出提升的稳定性，而本发明的表达载体还可以实现进一步提升的稳定性。

本发明因而涉及原核细胞，优选大肠杆菌细胞，其含有整合至基因组的核苷酸构建物(编码在T7启动子控制下以及在可诱导启动子控制下的T7RNA聚合酶)，特征在于其不含有λ噬菌体DNA。

除此之外，本发明的优点是其利用在复合培养基中的无抗生素发酵，其中待生产蛋白通常可实现更高的表达效力(相较于EP1697523B1中描述的表达系统中使用的无机盐培养基)。本发明因而还涉及通过本发明表达系统的手段来产生重组蛋白的方法。

此方法的特征在于本发明的表达载体被引入至含有核苷酸构建物的原核细胞内，所述核苷酸构建物编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶，这些细胞在无抗生素的条件(其适宜于T7 RNA聚合酶和从多核苷酸序列开始的重组蛋白的表达)下进行发酵，由此表达重组多肽并分离重组的多肽。

在本发明中，发酵过程(也即蛋白表达的实际过程)，在完全无抗生素的环境中进行。结果，避免了开始所提到的与使用抗生素筛选质粒相关联的问题，例如监管机构的保留意见、产物安全性、终产物分析(消除产物中的抗生素)以及与之相关联的风险和代价。

在本发明的意义上，蛋白也理解为是指肽和多肽。

本发明的方法优选在生物反应器中进行。

附图简述

图1示意性地显示出在BL21(DE3)(现有技术)和BL21ΔproBA-T7lacZ(根据本发明)的基因组中的T7核苷酸构建物相互比较；

a)DE3:通过改造的λ噬菌体的手段整合至λ附着位点中(现有技术)；

b)Scil-T7:通过proBA的同步缺失来靶向整合(根据本发明)。

图2示意性地显示出T7核苷酸构建物，其由lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、T7噬菌体(T7聚合酶)的T7启动子和基因1以及卡那霉素抗性基因kan(两侧有FRT位点)构成。

图3示意性地显示出表达载体pSCIL006c，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、kan和lacI构成。

图4示意性地显示出表达载体pSCIL122和pSCIL123，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、kan、lacI和cer构成。

图5示意性地显示出表达载体pSCIL124和pSCIL125，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、tetA、lacI和cer构成。

图6示意性地显示出表达载体pSCIL129，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、kan、lacI和cer构成。

以下实施例用于进一步说明本发明。

实施例1:本发明的表达载体和质粒的产生

表达质粒pSCIL006c的产生

下文中更详细地描述了表达载体pSCIL006c(图3)的产生。

1.将t0终止子插入至pUC19＝pSCIL001

商业可购买的载体pUC19(SD0061,MBI Fermentas)被用作产生表达载体的基础。用限制性内切酶HindIII和AflIII切割pUC19，其导致359bp的载体序列的缺失。通过引物t0-OD-MCS-HindIII(SEQ ID NO:2)和t0-UU-MCS-AflIII(SEQ ID NO:3)的手段从噬菌体λ(SD0011,MBI Fermentas)的DNA扩增t0转录终止子。继而用限制性内切酶HindIII和AflIII切割所形成的片段并在纯化后(Minielute Kit,Qiagen)克隆至pUC19^{HindIII/AflIII}片段。所得的质粒pSCIL101通过限制性内切分析以及测序来进行检查。

2.pSCIL001中抗生素抗性盒的取代＝pSCIL002

通过用引物Km-OD-ApaI(SEQ ID NO:4)和Km-UU-NheI(SEQ ID NO:5)进行PCR来从pACYC177(E4151S,NEB)扩增卡那霉素抗性盒。用凝胶提取试剂盒(Qiagen)来纯化该片段并克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)中。通过引物pUC2541-OD-NheI(SEQ ID NO:6)和pUC1496-UU-ApaI(SEQ ID NO:7)的手段将质粒pSCIL101进行了无氨苄青霉素抗性盒扩增，并用限制性内切酶ApaI和NheI切割。用限制性内切酶ApaI和NheI从pGEMT-T easy切割卡那霉素抗性盒，并克隆至pSCIL001(ΔAmp)^ApaI/NheI。所得的质粒pSCIL002通过限制性内切分析来进行检查。

3.卡那霉素抗性盒朝向的改变＝pSCIL002b

卡那霉素抗性盒在pSCL载体中的朝向对于卡那霉素抗性基因的背景表达具有决定性的作用，因此在第二载体生成中，该抗性盒的朝向相较于例如pSCIL008(EP1697523B1)发生了改变。为此，首先通过引物MunI-Km term(SEQ ID NO:8)和ApaI-pSCIL002(SEQ IDNO:9)的手段将pSCIL002的构架进行了无卡那霉素抗性盒得扩增，并继而用核酸酶MunI(MfeI)和ApaI进行了切割。使用引物Km 5’-MunI(SEQ ID NO:10)和Km 3’ApaI(SEQ ID NO:11)从pSCIL002扩增了卡那霉素抗性盒，并同样地用限制性内切酶MunI(MfeI)和ApaI进行了切割。继而将两个片段都进行连接，这导致了质粒pSCIL002b。通过测序来检查了正确的整合。

4.第二选择标记物插入至pSCIL002b内＝pSCIL003b

继而将大肠杆菌的脯氨酸合成通路的基因，proBA，整合至pSCIL002b内作为第二选择标记物。为此，首先通过proBA-OD-ApaI(SEQ ID NO:12)和proBA-UU-ApaI(SEQ ID NO:13)的手段从事先制备的来自大肠杆菌K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikro-organismen and Zellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的基因组DNA来扩增proBA操纵子。用限制性内切酶ApaI切割PCR产物，并克隆至载体pSCIL002b(同样经ApaI切割)之中。所得的质粒pSCIL003b经测序检查。

5.将阻遏基因lacI插入至pSCIL003b中＝pSCIL004b

通过引物lacI OD NheI(SEQ ID NO:14)和lacI UU NheI(SEQ ID NO:15)的手段从大肠杆菌菌株K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikroorganismen andZellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的染色体DNA扩增lacI基因(包括天然启动子区)。将PCR产物克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)并通过测序检查。在用限制性内切酶NheI限制性内切后，lacI被连接至pSCIL003b中。

6.将T7启动子插入至pSCIL004b中＝pSCIL006b

通过引物PrT7-MunI5’(SEQ ID No:16)和PrT7-EcoRI3’(SEQ ID NO:17)的手段从质粒pSCIL006(源自pTYB2,#6710,NEB)扩增T7启动子(包括lac操纵基因序列)。另外，通过引物PrT7-EcoRI3’的手段将后来的核糖体结合位点(AGGAGA)整合至PCR产物。用限制性内切酶EcoRI和MunI(MfeI)切割PCR产物，并克隆至载体pSCIL004b(经EcoRI切割)。所得的质粒pSCIL006b经测序检查。

7.通过替换pSCIL006b中的一个核苷酸而改变复制起点(复制的起点)＝pSCIL006c

作为pUC19的后代，表达质粒pSCIL006b在37℃显示出比在30℃高很多的拷贝数。其原因是原始质粒pBR322的复制起点中的点突变(G→A)。为了在pSCIL006b中保留此突变，使用了Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。为此，用引物ori_mut_fwd(SEQ ID NO:18)和ori_rev(SEQ ID NO:19)扩增了整个质粒并再连接。所得的质粒(其拷贝数无论何种温度均在大约60拷贝/细胞)经测序检查并命名为pSCIL006c(参见图3，SEQ ID NO:20)。

表达载体pSCIL122和pSCIL123的产生

1.将cer插入至pSCIL006c中＝pSCIL122和pSCIL123

使用引物5’cer_NdeI(SEQ ID NO:21)和3’cer_NdeI(SEQ ID NO:22)经PCR从质粒ColE1(分离自大肠杆菌JC411(DSM3877),DSMZ,通过QIAprep Spin Miniprep的手段,Qiagen)扩增了cer元件，并整合至pSCIL006c中独特的NdeI切割位点。其中，两种朝向(前向和反向)都是可能的。所得的具有前向朝向cer的质粒命名为pSCIL122，而具有反向朝向cer的质粒命名为pSCIL123，并经测序检查(参见图4，SEQ ID NO:23)。

表达载体pSCIL124和pSCIL125的产生

1.在pSCIL006c中缺失kan＝pSCIL112

为了缺失卡那霉素抗性盒，使用了Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。为此，使用引物pSCIL_Nco_P(SEQ ID No:24)和pSCIL_Spe_P(SEQ ID No:25)扩增了pSCIL006c的构架并重连接，其导致卡那霉素抗性盒的缺失。所得的质粒经测序检查并命名为pSCIL112。

2.将tetA插入至pSCIL112中＝pSCIL105

使用引物tetA_5’promo_NcoI(SEQ ID No:26)和tetA_3’_SpeI(SEQ ID No:27)从pBR322(D1511,Promega)扩增了四环素抗性盒。用限制性内切酶NcoI和SpeI切割PCR产物并克隆至载体pSCIL112(同样经NcoI和SpeI切割)。由于所得的质粒具有两个拷贝而不是一个拷贝的四环素抗性盒，通过Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)的手段去除了一个拷贝。为此，使用引物105_fwd_P(SEQ ID No:28)和105_rev_P(SEQ IDNo:29)扩增了质粒并重连接。所得的质粒经测序检查并命名为pSCIL105。

3.将cer插入至pSCIL105中＝pSCIL124和pSCIL125

使用引物5’cer_NdeI(SEQ ID NO:21)和3’cer_NdeI(SEQ ID NO:22)经PCR从质粒ColE1(分离自大肠杆菌JC411(DSM3877),DSMZ,通过QIAprep Spin Miniprep的手段,Qiagen)扩增了cer元件，并整合至pSCIL105中独特的NdeI切割位点。其中，两种朝向(前向和反向)都是可能的。所得的具有前向朝向cer的质粒命名为pSCIL124，而具有反向朝向cer的质粒命名为pSCIL125，并经测序检查(参见图5，SEQ ID NO:30)。

表达载体pSCIL129的产生

1.pSCIL123中proBA的缺失＝pSCIL129

为了减小表达载体的质粒大小，又再去除proBA盒。为此，使用Phusion SiteDirected Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。通过引物pSCIL-proBA_rev-P(SEQ IDNO:31)和pSCIL-proBA_fwd-P(SEQ ID NO:32)的手段扩增质粒pSCIL123，从而在随后重连接之后将proBA操纵子缺失。所得的表达载体命名为pSCIL129并经测序检查(参见图6，SEQID NO:33)。实施例2:本发明表达系统的产生

大肠杆菌菌株BL21(Stratagene)、HMS174(DSM5932)和C600’(DSM426)得自Stratagene或者DSMZ(Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Braunschweig)。菌株BL21、HMS174和C600’每个均转化有质粒pKD46(CGSC,E.coli Genetic Stock Center,Yale University,New Haven,USA)，其编码λ噬菌体的Red重组酶。由此，可以将T7构建物靶向整合至大肠杆菌基因组。从所得的菌株BL21pKD46、HMS174pKD46和C600’pKD46，又再产生了感受态细胞。用琼脂平板上的氨苄青霉素或液体培养中的羧苄青霉素来实现pKD46的筛选。

图2中所示的DNA构建物(由lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、T7噬菌体(T7聚合酶)的T7启动子和基因1以及两侧有FRT位点的卡那霉素抗性基因kan构成)经如下产生。

首先，将所述组分分别扩增并一起克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)。使用引物T7 5’_BamHI_Xho(SEQ ID NO:34)和T7 3’_Hind(SEQ ID NO:35)从T7噬菌体(310005,Bioron GmbH)的DNA扩增了T7 RNA聚合酶的基因(基因1)。通过Qiaquick PCRPurification(Qiagen)纯化了PCR产物，并通过悬垂腺嘌呤残基(overhanging adenineresidue)的手段克隆至载体pGEM-T easy(A1360,Promega)。所形成的质粒pGEM::T7经测序检查。通过引物lacI 5’_BamHI_coli(SEQ ID NO:36)和lacI 3’_UV5_Xho(SEQ ID NO:37)的手段从大肠杆菌菌株K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的基因组DNA扩增了lacI基因。还有，借助于引物lacI 3’_UV5_Xho(SEQ ID NO:37)而将lacUV5启动子的序列整合至PCR产物中。通过Qiaquick PCR Purification(Qiagen)纯化了PCR产物，并通过悬垂腺嘌呤残基的手段克隆至载体pGEM-T easy(A1360,Promega)。所形成的质粒pGEM::lacI-lacUV5经测序检查，并继而用限制性内切酶BamHI和XhoI切割。所形成的片段通过QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化，并克隆至经同样切割和纯化的质粒pGEM::T7中。所形成的质粒pGEM::lacI-lacUV5-T7经测序检查。使用引物Hind_pKD45’(SEQ ID NO:38)和pKD43’_Hind_coli(SEQID NO:39)从质粒pKD4(CGSC,E.coli Genetic Stock Center,Yale University,NewHaven,USA)扩增了两侧有FRT位点的卡那霉素抗性基因。用限制性内切酶HindIII切割PCR产物，并克隆至同样经HindIII切割的质粒pGEM::lacI-lacUV5-T7中。最终的质粒pGEM-Teasy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT经限制性内切酶EcoRI和HindIII的限制性消化来检查。

为了产生类似于DE3的T7核苷酸构建物，首先通过引物T7_neu_BamHI_for01(SEQID NO:40)和T7_neu_MfeI_rev02(SEQ ID NO:41)的手段，从事先分离自BL21(DE3)[Novagen 69387-3]的基因组DNA(Genomic DNA Purification Kit,Fermentas)，扩增了由以下所构成的区域：lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、和T7噬菌体的基因1的前2574bp(直至内部的MfeI切割位点)。在纯化后( SV Gel and PCR,Promega)，用限制性内切酶BamHI和MfeI切割此PCR产物，并在纯化后( SV Gel and PCR,Promega)克隆至质粒pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT^BamHI/MfeI的4647bp片段。在转化至TOP10F’(Life>

接着，通过限制性内切酶EcoRI的手段将整个构建物从质粒pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(SEQ ID NO:42)中切除下来。由此形成的6026bp片段通过SV Gel and PCR-Kit(Promega)的手段进行纯化。继而用此DNA片段转化菌株BL21pKD46、HMS174pKD46和C600’pKD46，并在室温温育过夜以便使得可以整合至大肠杆菌基因组。

由于选择了与proBA操纵子的侧翼区匹配的DNA构建物的侧翼区(SEQ ID NO:43:rec位点1和SEQ ID NO:44:rec位点2)，在整合期间proBA操纵子同时被缺失掉。对图2中所示的T7 RNA聚合酶构建物的筛选，是通过培养基中卡那霉素的手段来实现的。通过在含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的培养基中生长能力的丢失，而检测出辅助质粒pKD46的丢失。

从所得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ::kan、HMS174ΔproBA-T7lacZ::kan、和C600’ΔproBA-T7lacZ::kan制备感受态细胞，并用辅助质粒pCP20(CGSC,E.coli Genetic StockCenter,Yale University,New Haven,USA)进行转化。此步骤用于去除卡那霉素抗性(其通过pCP20上编码的FLP重组酶在第一步中也被整合至基因组中)。对于具有pCP20的菌株的筛选，在含有氨苄青霉素的平板上实现。

通过在43℃将细胞温育过夜，辅助质粒pCP20丢失。所得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ、HMS174ΔproBA-T7lacZ、和C600’ΔproBA-T7lacZ不具有抗生素抗性，且含有如图1所示的T7构建物(而非基因组中的proBA操纵子)。保留在基因组中作为此方法“痕迹”的那一个FRT位点，是由FLP重组酶去除卡那霉素抗性盒时所造成的。通过Southern杂交来验证菌株。在该过程中，检测到T7 RNA聚合酶的编码序列的整合以及proBA的缺失。

通过电穿孔将来自实施例1的表达质粒引入至由此获得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ和HMS174ΔproBA-T7lacZ中。

实施例3:本发明T7表达系统与现有技术的T7表达系统对于质粒稳定性的比较

为了研究现有技术的T7表达质粒和本发明的T7表达质粒在BL21(DE3)(来自现有技术的菌株)和BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的菌株)中的稳定性，在摇瓶和分批补料发酵中进行了实验。为此，通过限制性内切酶EcoRI和PstI的手段，将得自基因合成(Geneart,Regensburg)的人生长因子proNGF克隆至表达载体。对于摇瓶中质粒稳定性的研究，程序如下。首先，将待研究表达菌株的预培养物：具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF(现有技术)的BL21(DE3)、具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF(本发明的表达质粒)的BL21(DE3)、具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(具有不含质粒稳定系统的表达质粒的本发明表达菌株)、和具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的表达系统)，在具有50μg/ml卡那霉素的复合培养基[34.5g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)、2.475mM MgSO₄、9.347mM>4Cl、62mMK₂HPO₄、15g/l>600＝0.2-0.3是必须的)。由此接种的主培养物(在100ml的锥形瓶中，20ml复合培养基，无抗生素)在37℃以210rpm摇摆直至达到OD₆₀₀＝0.8。此时，通过添加1mM>

表1:摇瓶中现有技术标准表达质粒的(pSCIL006cΔproBA::proNGF)和本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)在BL21(DE3)(现有技术的菌株)和BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的菌株)内的质粒稳定性

据发现，现有技术的表达系统展现出很低的质粒稳定性：诱导后3小时86％以及诱导后24小时仅有5％。通过本发明的cer手段的表达质粒来进行稳定化，在BL21(DE3)中可以将质粒稳定性提高至诱导后3小时100％3h以及诱导后24小时88％。质粒稳定性提升至诱导后24小时大约100％，仅能通过使用本发明的T7表达系统来实现，该表达系统由具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ构成。然而出乎意料的是，在BL21ΔproBA-T7lacZ中的标准表达质粒也显示出高质粒稳定性：诱导后3小时90％3h以及诱导后24小时84％，而同时同样的质粒在BL21(DE3)中已经基本上丢失了(5％24h pi)。作为这些实验中的目标基因，表达出了人生长因子proNGF。proNGF的表达是通过SDS-PAGE来检查的.

除此之外，还在分批补料发酵中将本发明的表达系统与现有技术进行了比较。首先，将待研究表达菌株的预培养物：具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF(现有技术)的BL21(DE3)、具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF(本发明的表达质粒)的BL21(DE3)、具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(具有不含质粒稳定系统的表达质粒的本发明表达菌株)、和具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的表达系统)，在具有50μg/ml卡那霉素的复合培养基[34.5g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)、2.475mM MgSO₄、9.347mM>4Cl、62mM>2HPO₄、15g/l葡萄糖]中培养过夜(37℃，摇摆)。在发酵中，对每种情形，将2l的无抗生素复合培养基[50g/l酵母提取物(Biospringer>4、9.347mM>4Cl、62mM>2HPO₄、10g/l葡萄糖、0.2ml/l消泡剂Synperonic(Croda>600(600nm光吸收)。6.5h后，在已消耗掉葡萄糖后，通过添加底物而起始分批补料阶段。此处的底物补料流根据指数函数的形式进行：补料流＝const*exp(μ₁*t)。其中μ是适用μ₁＝const<μ_max的比生长速率，也即即时可用的葡萄糖浓度总是低于微生物的最大即时需求，其结果是实现次最大生长率并防止葡萄糖的累积。例如，设定值μ₁＝0.25h^-1。在指定的光吸收，例如OD₆₀₀＝50±5，通过添加IPTG(例如1mM)来诱导蛋白的表达。此时，底物补料流在6小时线性减少70％并继而保持恒定。该过程在指定的诱导期(例如24h)之后结束。

在达到OD₆₀₀＝50±5时，通过添加1mM>

(PS:质粒稳定性)

表2标准表达质粒(pSCIL006cΔproBA::proNGF)和本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)在分批补料发酵中的BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ内的质粒稳定性

据发现，在分批补料发酵中，现有技术的表达系统在诱导后6小时已经丢失了89％的表达质粒(PS 11％)，而本发明的表达系统即使在诱导后24小时依然展现出100％的质粒稳定性。此处具有质粒稳定系统cer的本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)和以及还有本发明的表达菌株BL21ΔproBA-T7lacZ相对于现有技术的表达系统都具有明显优势，因为诱导后24小时质粒稳定性分别为100％和95％，显著高于现有技术的表达系统(2％)。

为了进一步研究本发明T7表达质粒在BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ中的稳定性，在摇瓶中进行了进一步的实验。为此，通过限制性内切酶EcoRI和PstI的手段，将得自基因合成的人凝血酶原基因(Geneart,Regensburg)克隆至表达载体pSCIL006c(常规表达质粒)和pSCIL123(稳定表达质粒)。对于在摇瓶中的质粒稳定性研究，使用了上文所述的程序。结果在表3中示出。

表3:标准表达质粒(pSCIL006c::凝血酶原)和本发明的表达质粒(pSCIL123::prethrombin)在BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ中的质粒稳定性。

据发现，现有技术的表达系统展现出极低的质粒稳定性。在诱导后3小时，就已经仅存在5％的携质粒菌株，而24小时后几乎所有细胞都是无质粒的。

通过使用表达质粒pSCIL123::preThrombin，在表达菌株BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ都可以实现诱导后3小时100％的质粒稳定性。在诱导后24小时的时间，本发明的表达系统(具有pSCIL123::preThrombin的BL21ΔproBA-T7lacZ)的质粒稳定性，为78％，几乎是现有技术表达菌株(BL21(DE3)pSCIL123::preThrombin)中(41％)的两倍。人凝血酶原的表达通过SDS-PAGE检查。

序列表

<110> 瓦克化学股份公司

<120> T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途

<130> Wa11363F

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5990

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chromosomal T7 RNA polymerase construct

<400> 1

acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga atggcgcaaa 60

acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 120

aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 180

cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 240

atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 300

ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 360

gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 420

agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 480

ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 540

aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 600

tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 660

atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 720

cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 780

gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 840

atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 900

ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 960

tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 1020

gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 1080

tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 1140

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 1200

gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 1260

gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 1320

ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 1500

gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 1560

ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 1620

tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 1680

cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 1740

cgcgaattat ttttgatggc gtcgggatct gatccggatt tactaactgg aagaggcact 1800

aaatgaacac gattaacatc gctaagaacg acttctctga catcgaactg gctgctatcc 1860

cgttcaacac tctggctgac cattacggtg agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg 1920

agcatgagtc ttacgagatg ggtgaagcac gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta 1980

aagctggtga ggttgcggat aacgctgccg ccaagcctct catcactacc ctactcccta 2040

agatgattgc acgcatcaac gactggtttg aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc 2100

cgacagcctt ccagttcctg caagaaatca agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta 2160

agaccactct ggcttgccta accagtgctg acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg 2220

caatcggtcg ggccattgag gacgaggctc gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta 2280

agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga 2340

aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg 2400

cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc 2460

tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag 2520

actctgagac tatcgaactc gcacctgaat acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg 2580

cgctggctgg catctctccg atgttccaac cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg 2640

gcattactgg tggtggctat tgggctaacg gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc 2700

acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga 2760

ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg 2820

taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac 2880

tcccgatgaa accggaagac atcgacatga atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg 2940

ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt 3000

tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta accataaggc catctggttc ccttacaaca 3060

tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga 3120

ccaaaggact gcttacgctg gcgaaaggta aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc 3180

tgaaaatcca cggtgcaaac tgtgcgggtg tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca 3240

agttcattga ggaaaaccac gagaacatca tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca 3300

cttggtgggc tgagcaagat tctccgttct gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg 3360

gggtacagca ccacggcctg agctataact gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt 3420

gctctggcat ccagcacttc tccgcgatgc tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta 3480

acttgcttcc tagtgaaacc gttcaggaca tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg 3540

agattctaca agcagacgca atcaatggga ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg 3600

agaacactgg tgaaatctct gagaaagtca agctgggcac taaggcactg gctggtcaat 3660

ggctggctta cggtgttact cgcagtgtga ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg 3720

ggtccaaaga gttcggcttc cgtcaacaag tgctggaaga taccattcag ccagctattg 3780

attccggcaa gggtctgatg ttcactcagc cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc 3840

tgatttggga atctgtgagc gtgacggtgg tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta 3900

agtctgctgc taagctgctg gctgctgagg tcaaagataa gaagactgga gagattcttc 3960

gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca 4020

agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta 4080

ccattaacac caacaaagat agcgagattg atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc 4140

ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg 4200

agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga ttcacgactc cttcggtacc attccggctg 4260

acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg 4320

atgtactggc tgatttctac gaccagttcg ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca 4380

aaatgccagc acttccggct aaaggtaact tgaacctccg tgacatctta gagtcggact 4440

tcgcgttcgc gtaaaagctt gcgattgtgt aggctggagc tgcttcgaag ttcctatact 4500

ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcaagatc ccctcacgct gccgcaagca 4560

ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg 4620

gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc 4680

aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt 4740

atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 4800

ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 4860

atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4920

aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4980

cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 5040

caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5100

gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5160

ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5220

tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 5280

tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 5340

agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 5400

actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 5460

cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 5520

tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 5580

tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 5640

cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 5700

gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc 5760

gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc 5820

ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccagcttcaa aagcgctctg 5880

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaactaagga ggatattcat 5940

atggaccatg ggattcacaa ggccattgac gcatcgcccg gttagtttta 5990

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 2

taaaaagctt gactcctgtt gatagatcca gtaa 34

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 3

aaaacatgta ttctcaccaa taaaaaacgc c 31

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 4

aagggcccgc cacgttgtgt gtctc 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 5

aaagctagcg atatcgccgt cccgtcaagt c 31

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 6

aaagctagcg ggaataaggg cgacacgg 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 7

aaagggccca cgtgagtttt cgttccactg 30

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 8

caatggtcag aaattggtta attggttgta acactggca 39

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 9

gggcccacgt gagttttcgt tcc 23

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 10

caattggcca cgttgtgtgt ctcaaaatct c 31

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 11

gggcccgata tcgccgtccc gtcaagtc 28

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 12

aaagggcccg caaccgacga cagtcctgc 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 13

aaagggcccc ggtggacaaa ggttaaaac 29

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 14

aaagctagcg acaccatcga atggcgc 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 15

aaagctagct cactgcccgc tttcc 25

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 16

aaacaattgg aaattaatac gactcactat agg 33

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 17

aaagaattct ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 40

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 18

acggctacac tagaaggaca gtatttg 27

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 19

agttaggcca ccacttcaag 20

<210> 20

<211> 6357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Expression vector

<400> 20

gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120

ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180

agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240

gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggccgggc 960

ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020

tggcagagaa tcatgagtga cagccagacg ctggtggtaa aactcggcac cagtgtgcta 1080

acaggcggat cgcgccgtct gaaccgtgcc catatcgttg aacttgttcg ccagtgcgcg 1140

cagttacatg ccgccgggca tcggattgtt attgtgacgt cgggcgcgat cgccgccgga 1200

cgtgagcacc tgggttaccc ggaactgcca gcgaccatcg cctcgaaaca actgctggcg 1260

gcggtagggc agagtcgact gattcaactg tgggaacagc tgttttcgat ttatggcatt 1320

cacgtcgggc aaatgctgct gacccgtgct gatatggaag accgtgaacg cttcctgaac 1380

gcccgcgaca ccctgcgagc gttgctcgat aacaatatcg ttccggtaat caatgagaac 1440

gatgctgtcg ctacggcaga gattaaggtc ggcgataacg ataacctttc tgcgctggcg 1500

gcgattcttg cgggtgccga taaactgttg ctgctgaccg atcaaaaagg tttgtatacc 1560

gctgacccgc gcagcaatcc gcaggcagaa ctgattaaag atgtttacgg cattgatgac 1620

gcactgcgcg cgattgccgg tgacagcgtt tcaggcctcg gaactggcgg catgagtacc 1680

aaattgcagg ccgctgacgt ggcttgccgt gcgggtatcg acaccattat tgccgcgggc 1740

agcaagccgg gcgttattgg tgatgtgatg gaaggcattt ccgtcggtac gctgttccat 1800

gcccaggcga ctccgcttga aaaccgtaaa cgctggattt tcggtgcgcc gccggcgggt 1860

gaaatcacgg tagatgaagg ggcaactgcc gccattctgg aacgcggcag ctccctgttg 1920

ccgaaaggca ttaaaagcgt gactggcaat ttctcgcgtg gtgaagtcat ccgcatttgc 1980

aacctcgaag gccgcgatat cgcccacggc gtcagtcgtt acaacagcga tgcattacgc 2040

cgtattgccg gacaccactc gcaagaaatt gatgcaatac tgggatatga atacggcccg 2100

gttgccgttc accgtgatga catgattacc cgttaaggag caggctgatg ctggaacaaa 2160

tgggcattgc cgcgaagcaa gcctcgtata aattagcgca actctccagc cgcgaaaaaa 2220

atcgcgtgct ggaaaaaatc gccgatgaac tggaagcaca aagcgaaatc atcctcaacg 2280

ctaacgccca ggatgttgct gacgcgcgag ccaatggcct tagcgaagcg atgcttgacc 2340

gtctggcact gacgcccgca cggctgaaag gcattgccga cgatgtacgt caggtgtgca 2400

acctcgccga tccggtgggg caggtaatcg atggcggcgt actggacagc ggcctgcgtc 2460

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<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 21

aaacatatgg tgaaaccatg aaaaatggca gc 32

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 22

aaacatatgc tcgatggcta cgagggca 28

<210> 23

<211> 6604

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Expression vector

<400> 23

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cagt 6604

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<223> Expression vector

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cgtattgccg gacaccactc gcaagaaatt gatgcaatac tgggatatga atacggcccg 2100

gttgccgttc accgtgatga catgattacc cgttaaggag caggctgatg ctggaacaaa 2160

tgggcattgc cgcgaagcaa gcctcgtata aattagcgca actctccagc cgcgaaaaaa 2220

atcgcgtgct ggaaaaaatc gccgatgaac tggaagcaca aagcgaaatc atcctcaacg 2280

ctaacgccca ggatgttgct gacgcgcgag ccaatggcct tagcgaagcg atgcttgacc 2340

gtctggcact gacgcccgca cggctgaaag gcattgccga cgatgtacgt caggtgtgca 2400

acctcgccga tccggtgggg caggtaatcg atggcggcgt actggacagc ggcctgcgtc 2460

ttgagcgtcg tcgcgtaccg ctgggggtta ttggcgtgat ttatgaagcg cgcccgaacg 2520

tgacggttga tgtcgcttcg ctgtgcctga aaaccggtaa tgcggtgatc ctgcgcggtg 2580

gcaaagaaac gtgtcgcact aacgctgcaa cggtggcggt gattcaggac gccctgaaat 2640

cctgcggctt accggcgggt gccgtgcagg cgattgataa tcctgaccgt gcgctggtca 2700

gtgaaatgct gcgtatggat aaatacatcg acatgctgat cccgcgtggt ggcgctggtt 2760

tgcataaact gtgccgtgaa cagtcgacaa tcccggtgat cacaggtggt ataggcgtat 2820

gccatattta cgttgatgaa agtgtagaga tcgctgaagc attaaaagtg atcgtcaacg 2880

cgaaaactca gcgtccgagc acatgtaata cggttgaaac gttgctggtg aataaaaaca 2940

tcgccgatag cttcctgccc gcattaagca aacaaatggc ggaaagcggc gtgacattac 3000

acgcagatgc agctgcactg gcgcagttgc aggcaggccc tgcgaaggtg gttgctgtta 3060

aagccgaaga gtatgacgat gagtttctgt cattagattt gaacgtcaaa atcgtcagcg 3120

atcttgacga tgccatcgcc catattcgtg aacacggcac acaacactcc gatgcgatcc 3180

tgacccgcga tatgcgcaac gcccagcgtt ttgttaacga agtggattcg tccgctgttt 3240

acgttaacgc ctctacgcgt tttaccgacg gcggccagtt tggtctgggt gcggaagtgg 3300

cggtaagcac acaaaaactc cacgcgcgtg gcccaatggg gctggaagca ctgaccactt 3360

acaagtggat cggcattggt gattacacca ttcgtgcgta aataaaaccg ggtgatgcaa 3420

aagtagccat ttgattcaca aggccattga cgcatcgccc ggttagtttt aaccttgtcc 3480

accgactagt gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc 3540

ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg 3600

gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat 3660

ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg 3720

tccaatgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg 3780

gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 3840

agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac 3900

gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 3960

ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 4020

cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 4080

cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 4140

gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 4200

cggtcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag 4260

gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc ccaacagtcc 4320

cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg 4380

gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt 4440

ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atccacagga cgggtgtggt 4500

cgccatgatc gcgtagtcga tagtggctcc aagtagcgaa gcgagcagga ctgggcggcg 4560

gccaaagcgg tcggacagtg ctccgagaac gggtgcgcat agaaattgca tcaacgcata 4620

tagcgctagc agcacgccat agtgactggc gatgctgtcg gaatggacga tatcccgcaa 4680

gaggcccggc agtaccggca taaccaagcc tatgcctaca gcatccaggg tgacggtgcc 4740

gaggatgacg atgagcgcat tgttagattt catacacggt gcctgactgc gttagcaatt 4800

taactgtgat aaactaccgc attaaagctt atcgatgata agctgtcaaa catgagacca 4860

tgggatatcg ctagcgacac catcgaatgg cgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag 4920

cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc 4980

gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac 5040

gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc 5100

aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc 5160

agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa 5220

ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg 5280

gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat 5340

gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat 5400

gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg 5460

ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta 5520

agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa 5580

attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc 5640

atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg 5700

gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg 5760

gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc 5820

aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag 5880

ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc 5940

ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 6000

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcta gcgggaataa gggcgacacg 6060

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6120

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6180

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 6240

aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 6300

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 6360

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 6420

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgctcg atggctacga 6480

gggcagacag taagtggatt taccataatc ccttaattgt acgcaccgct aaaacgcgtt 6540

cagcgcgatc acggcagcag acaggtaaaa atggcaacaa accacccgaa aaactgcgcc 6600

gatcgcgcct gataaatttt aaccgtatga atacctatgc aaccagaggg tacaggccac 6660

attaccccca cttaatccac tgaagctgcc atttttcatg gtttcaccat atgcggtgtg 6720

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc 6780

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 6840

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 6900

gttgtaaaac gacggccagt 6920

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 31

acgtgagttt tcgttccact gagcg 25

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 32

gggcccgata tcgccgtccc 20

<210> 33

<211> 4071

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Expression vector

<400> 33

gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120

ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180

agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240

gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggcccgat 960

atcgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc 1020

tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 1080

aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 1140

ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 1200

acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 1260

gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 1320

ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 1380

ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 1440

cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg 1500

atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc 1560

atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca 1620

gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 1680

aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc 1740

gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg 1800

cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 1860

tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 1920

tcagagattt tgagacacac aacgtggcca attgtcagaa ttggttaatt ggttgtaaca 1980

ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcgatatc gctagcgaca ccatcgaatg 2040

gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt 2100

gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac 2160

cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga 2220

agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa 2280

acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat 2340

tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt 2400

agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt 2460

cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc 2520

ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat 2580

tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca 2640

ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc 2700

tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga 2760

ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc 2820

cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga 2880

gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag 2940

ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac 3000

cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt 3060

gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3120

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3180

gcagtgagct agcgggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 3240

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 3300

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 3360

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 3420

cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 3480

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 3540

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 3600

tgagagtgca ccatatgctc gatggctacg agggcagaca gtaagtggat ttaccataat 3660

cccttaattg tacgcaccgc taaaacgcgt tcagcgcgat cacggcagca gacaggtaaa 3720

aatggcaaca aaccacccga aaaactgccg cgatcgcgcc tgataaattt taaccgtatg 3780

aatacctatg caaccagagg gtacaggcca cattaccccc acttaatcca ctgaagctgc 3840

catttttcat ggtttcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 3900

taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 3960

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 4020

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag t 4071

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 34

aaaggatcca aactcgagag gtacgattta ctaactggaa gaggcactaa 50

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 35

aaaaagcttt acgcgaacgc gaagtc 26

<210> 36

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 36

aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60

tggcgc 66

<210> 37

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 37

aaactcgagt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg 60

tcactgcccg ctttcca 77

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 38

aaaaagcttg cgattgtgta ggctggagct 30

<210> 39

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 39

aaaaagcttt aaaactaacc gggcgatgcg tcaatggcct tgtgaatccc atggtccata 60

tgaatatcct cc 72

<210> 40

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 40

aattggatcc acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga 60

atggcgcaaa acc 73

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 41

aattcaattg agactcgtgc aactggtcag cg 32

<210> 42

<211> 9023

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA plasmid with T7 expression construct

<400> 42

aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60

tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg 120

gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag 180

accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg 240

gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc 300

aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa 360

attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg 420

gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc 480

gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 540

gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt 600

attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt 660

caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg 720

gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc 780

gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt 840

cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 900

gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 960

agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 1020

accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 1080

ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct 1140

ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 1200

gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt 1260

acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 1320

aggaaacagc tatgaccatg attacggatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 1380

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 1440

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 1500

gcgaatggcg ctttgcctgg tttccggcac cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt 1560

gcgatcttcc tgaggccgat actgtcgtcg tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg 1620

atgcgcccat ctacaccaac gtgacctatc ccattacggt caatccgccg tttgttccca 1680

cggagaatcc gacgggttgt tactcgctca catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg 1740

aaggccagac gcgaattatt tttgatggcg tcgggatctg atccggattt actaactgga 1800

agaggcacta aatgaacacg attaacatcg ctaagaacga cttctctgac atcgaactgg 1860

ctgctatccc gttcaacact ctggctgacc attacggtga gcgtttagct cgcgaacagt 1920

tggcccttga gcatgagtct tacgagatgg gtgaagcacg cttccgcaag atgtttgagc 1980

gtcaacttaa agctggtgag gttgcggata acgctgccgc caagcctctc atcactaccc 2040

tactccctaa gatgattgca cgcatcaacg actggtttga ggaagtgaaa gctaagcgcg 2100

gcaagcgccc gacagccttc cagttcctgc aagaaatcaa gccggaagcc gtagcgtaca 2160

tcaccattaa gaccactctg gcttgcctaa ccagtgctga caatacaacc gttcaggctg 2220

tagcaagcgc aatcggtcgg gccattgagg acgaggctcg cttcggtcgt atccgtgacc 2280

ttgaagctaa gcacttcaag aaaaacgttg aggaacaact caacaagcgc gtagggcacg 2340

tctacaagaa agcatttatg caagttgtcg aggctgacat gctctctaag ggtctactcg 2400

gtggcgaggc gtggtcttcg tggcataagg aagactctat tcatgtagga gtacgctgca 2460

tcgagatgct cattgagtca accggaatgg ttagcttaca ccgccaaaat gctggcgtag 2520

taggtcaaga ctctgagact atcgaactcg cacctgaata cgctgaggct atcgcaaccc 2580

gtgcaggtgc gctggctggc atctctccga tgttccaacc ttgcgtagtt cctcctaagc 2640

cgtggactgg cattactggt ggtggctatt gggctaacgg tcgtcgtcct ctggcgctgg 2700

tgcgtactca cagtaagaaa gcactgatgc gctacgaaga cgtttacatg cctgaggtgt 2760

acaaagcgat taacattgcg caaaacaccg catggaaaat caacaagaaa gtcctagcgg 2820

tcgccaacgt aatcaccaag tggaagcatt gtccggtcga ggacatccct gcgattgagc 2880

gtgaagaact cccgatgaaa ccggaagaca tcgacatgaa tcctgaggct ctcaccgcgt 2940

ggaaacgtgc tgccgctgct gtgtaccgca aggacaaggc tcgcaagtct cgccgtatca 3000

gccttgagtt catgcttgag caagccaata agtttgctaa ccataaggcc atctggttcc 3060

cttacaacat ggactggcgc ggtcgtgttt acgctgtgtc aatgttcaac ccgcaaggta 3120

acgatatgac caaaggactg cttacgctgg cgaaaggtaa accaatcggt aaggaaggtt 3180

actactggct gaaaatccac ggtgcaaact gtgcgggtgt cgataaggtt ccgttccctg 3240

agcgcatcaa gttcattgag gaaaaccacg agaacatcat ggcttgcgct aagtctccac 3300

tggagaacac ttggtgggct gagcaagatt ctccgttctg cttccttgcg ttctgctttg 3360

agtacgctgg ggtacagcac cacggcctga gctataactg ctcccttccg ctggcgtttg 3420

acgggtcttg ctctggcatc cagcacttct ccgcgatgct ccgagatgag gtaggtggtc 3480

gcgcggttaa cttgcttcct agtgaaaccg ttcaggacat ctacgggatt gttgctaaga 3540

aagtcaacga gattctacaa gcagacgcaa tcaatgggac cgataacgaa gtagttaccg 3600

tgaccgatga gaacactggt gaaatctctg agaaagtcaa gctgggcact aaggcactgg 3660

ctggtcaatg gctggcttac ggtgttactc gcagtgtgac taagcgttca gtcatgacgc 3720

tggcttacgg gtccaaagag ttcggcttcc gtcaacaagt gctggaagat accattcagc 3780

cagctattga ttccggcaag ggtctgatgt tcactcagcc gaatcaggct gctggataca 3840

tggctaagct gatttgggaa tctgtgagcg tgacggtggt agctgcggtt gaagcaatga 3900

actggcttaa gtctgctgct aagctgctgg ctgctgaggt caaagataag aagactggag 3960

agattcttcg caagcgttgc gctgtgcatt gggtaactcc tgatggtttc cctgtgtggc 4020

aggaatacaa gaagcctatt cagacgcgct tgaacctgat gttcctcggt cagttccgct 4080

tacagcctac cattaacacc aacaaagata gcgagattga tgcacacaaa caggagtctg 4140

gtatcgctcc taactttgta cacagccaag acggtagcca ccttcgtaag actgtagtgt 4200

gggcacacga gaagtacgga atcgaatctt ttgcactgat tcacgactcc ttcggtacca 4260

ttccggctga cgctgcgaac ctgttcaaag cagtgcgcga aactatggtt gacacatatg 4320

agtcttgtga tgtactggct gatttctacg accagttcgc tgaccagttg cacgagtctc 4380

aattggacaa aatgccagca cttccggcta aaggtaactt gaacctccgt gacatcttag 4440

agtcggactt cgcgttcgcg taaaagcttg cgattgtgta ggctggagct gcttcgaagt 4500

tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaagatcc cctcacgctg 4560

ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc 4620

gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa 4680

cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg 4740

ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt 4800

tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag 4860

gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 4920

attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 4980

acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 5040

tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg 5100

gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 5160

agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 5220

ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 5280

tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 5340

tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 5400

gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 5460

gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 5520

catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 5580

tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 5640

cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 5700

gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 5760

gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 5820

tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc cagcttcaaa 5880

agcgctctga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aactaaggag 5940

gatattcata tggaccatgg gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagttttaa 6000

agctttttat cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc 6060

aacgcgttgg atgcatagct tgagtattct atagtgtcac ctaaatagct tggcgtaatc 6120

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 6180

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 6240

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 6300

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 6360

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 6420

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 6480

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 6540

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6600

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6660

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6720

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6780

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caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6900

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6960

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atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 7320

gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 7380

acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 7440

ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 7500

tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 7560

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taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7800

catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7860

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gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggcccga cgtcgcatgc tcccggccgc 9000

catggcggcc gcgggaattc gat 9023

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