一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用，所述模具包括玻璃片、梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层，所述梯形水凝胶层通过梯形槽定形为梯形，所述含神经元细胞的水凝胶层位于梯形水凝胶层的头端（H），梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层凝固于玻璃片上。本发明通过两次光聚合，制备得到“头高尾低”的梯形轴突生长水凝胶，并将神经元细胞固定于轴突生长凝胶的头端（H），在垂直轴突生长凝胶方向加载固定大小的外力，利用凝胶受力后形变程度不同所形成梯度应力，模拟神经元长轴突所感受到的压力梯度。

说明书

技术领域

本发明属于细胞损伤研究领域，特别涉及一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用。

背景技术

机体内的细胞随着所处的位置不同，感受着各种不同的应力（剪切力、压力、牵张力等）。当细胞受力超出承受范围后，就会出现损伤，研究这一损伤过程对细胞行为的影响是生物医学领域的一个重要课题。为了研究力对细胞的损伤，各种力学加载系统已经被开发，其中美国的flexcell系统，可以完成对细胞流体剪切力、压力、拉力等的加载。这些加载系统大都是针对细胞整体进行力学加载，即单个细胞在同一时间受到的力是相同的，可以满足大多数的研究。但在神经元受力研究中存在不足。神经系统中的部分神经元会长出超长的轴突（厘米级），这样单个细胞的受力就从点变成了线，即单个细胞不同部位受到不同的力。最为典型的例子就是视网膜神经节细胞（RGC），其胞体部分位于眼球内，受到眼内压；而其轴突位于与脑室联通的密闭管腔内，受到脑脊液的压力，而眼压与颅内压是不同的，会形成一个压力梯度，当眼压与颅压发生重大改变时，会发生不可逆的视神经损伤，严重可造成失明。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在建立一个用于研究压力梯度损伤的单神经元培养体系，提供了一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具及其制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具，包括玻璃片、梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层，所述梯形水凝胶层通过梯形槽定形为梯形，所述含神经元细胞的水凝胶层位于梯形水凝胶层的梯形头端H，梯形水凝胶层和含神经元细胞的水凝胶层凝固于玻璃片上。

进一步的，所述玻璃片是经由3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯处理过的盖玻片。

进一步的，所述水凝胶层（3）和含神经元细胞的水凝胶层（5）均由水凝胶溶液制备得到，所述水凝胶溶液为浓度5%~8%的GelMA水凝胶，且其中含有0.1%~1%的光敏剂。

进一步的，所述GelMA水凝胶由磷酸盐缓冲溶液制备得到。

所述的用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具的制备方法，包括以下步骤：

1）光掩模的制备

制备轴突生长光掩模（1-1）和细胞捕获点光掩模（1-2）；

2）水凝胶溶液的制备

将GelMA溶解到磷酸盐缓冲溶液中，配置5%~8%终浓度的GelMA水凝胶溶液，并加入0.1%~1%光敏剂，得到水凝胶溶液；

3）梯形GelMA水凝胶的制备

将步骤2）制备得到的水凝胶溶液灌入到由多聚赖氨酸包被过的梯形槽中，上面依次覆盖玻璃片、轴突生长光掩模，再用紫外光进行光聚合，得到轴突生长的梯形水凝胶层；

4）GelMA水凝胶单细胞悬液的制备

按照1×10⁴个/ml>6个/ml浓度将体外培养的神经元重悬到浓度为3%~8%>

5）神经元单细胞捕获

将步骤4）所制备的含神经元的GelMA悬液灌注到矩形多聚赖氨酸基底槽中，将步骤3）得到的轴突生长的水凝胶层置于矩形槽中，使梯形水凝胶层浸于含神经元的GelMA悬液中，将轴突生长光掩模更换为细胞捕获点光掩模，再用紫外光进行光聚合，完成神经元单细胞捕获，即得到所述的用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具。

进一步的，所述光掩模为菲林材料，所述轴突生长光掩模（1-1）的透光处呈矩形，所述细胞捕获点光掩模（1-2）的透光处呈圆形。

进一步的，轴突生长光掩模（1-1）的矩形透光处的长宽分别为1cm、20μm，细胞捕获点光掩模（1-2）的圆形透光处的直径为150μm。

所述的模具用于研究压力梯度损伤的单神经元培养的方法，包括以下步骤：

1）神经元单细胞的培养

将如上文所述的模具置于水平培养环境中，加入神经元条件培养基，位于细胞捕获点的神经元轴突会沿着轴突生长凝胶的方向生长，培养3-4周后轴突长出；

2）压力梯度加载

制备不同高度差（4mm~20mm）的梯形水凝胶层培养神经元单细胞，将长有神经元的梯形水凝胶置于水平培养环境中，在上方加载垂直方向的作用力，利用凝胶自身的形变不同所产生的差异应力，提供长轴突神经元轴突部分的压力梯度，研究在该压力梯度作用下，长轴突神经元轴浆流运输的改变及相关作用机制。

进一步的，所述神经元条件培养基为含1%B₂₇、10%血清的神经元培养基。

进一步的，所述方法适用于包括视网膜神经节细胞、神经胶质细胞在内的神经元细胞。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明使用明胶-甲基丙烯酸酯（GelMA）材料，通过添加光敏剂，使其具有光聚合能力，通过第一次光聚合，制备得到“头高尾低”的梯形轴突生长水凝胶，通过第二次光聚合，将神经元细胞固定于轴突生长凝胶的头端（H），经过体外培养后得到长轴突神经元细胞，在垂直轴突生长凝胶方向加载固定大小的外力，利用凝胶受力后形变程度不同所形成梯度应力，模拟神经元长轴突所感受到的压力梯度；

2、该方法可用于体外疾病模型的制备，通过设计不同刚度压力梯度分布，调控视神经细胞的功能并与体内疾病模型相匹配，为药物筛选提供有效工具。

附图说明

图1为轴突生长光掩模（1-1）结构示意图；

图2为细胞捕获点光掩模（1-2）结构示意图；

图3为梯形水凝胶制备示意图；

图4为单细胞捕获示意图；

图5为制备得到的用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具结构示意图；

图6为压力梯度对长轴突神经元的作用示意图；

图7为压力梯度对长轴突神经元的作用详情示意图；

图8为不同压力梯度对长轴突神经元的作用示意图。

具体实施方式

本实施例提供了一种用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具，其制备方法为：

1）光掩模的制备

制备轴突生长光掩模1-1和细胞捕获点光掩模1-2，所述光掩模如图1、图2所示，轴突生长光掩模1-1的透光处呈矩形，长宽分别为1cm、20μm；细胞捕获点光掩模1-2的透光处呈圆形，直径为150μm；所述光掩模为菲林材料；

所述光掩模由深圳光溢有限公司制备；

2）水凝胶溶液的制备

将GelMA溶解到磷酸盐缓冲溶液（DPBS）中，配置5%终浓度的GelMA水凝胶溶液，并加入0.5%光敏剂，得到水凝胶溶液；

所述光敏剂为Irgacure 2959；

3）梯形GelMA水凝胶的制备

如图3所示，将步骤2）制备得到的水凝胶溶液灌入到由多聚赖氨酸4-1包被过的梯形槽中，上面依次覆盖玻璃片2、轴突生长光掩模1-1，再用2.95mW/cm²能量的紫外光进行光聚合，得到轴突生长的梯形水凝胶层3；

所述玻璃片为3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯（TMSPMA）处理过的盖玻片；

4）GelMA水凝胶单细胞悬液的制备

按照1×10⁴个/ml浓度将体外神经元重悬到浓度为5%>

5）神经元单细胞捕获

如图4所示，将步骤4）所制备的含神经元的GelMA悬液灌注到矩形多聚赖氨酸基底4-2槽中，将步骤3）得到的轴突生长的水凝胶层置于矩形槽中，使梯形水凝胶层浸于含神经元的GelMA悬液中，将轴突生长光掩模更换为细胞捕获点光掩模，再用2.95mW/cm²能量的紫外光进行光聚合，完成神经元单细胞捕获，形成含神经元细胞的水凝胶层5，即得到所述的用于研究压力梯度损伤的单神经元培养模具。

将所述模具用于研究压力梯度损伤的单神经元培养的方法，包括以下步骤：

1）RGC细胞的培养

如图5所示，将上述制备得到的模具置于水平培养环境中，加入神经元条件培养基（含1%B₂₇、10%血清的神经元培养基），位于细胞捕获点的神经元轴突会沿着轴突生长凝胶的方向生长，培养3-4周后轴突长出，待下一步进行压力加载；

2）压力梯度加载

如图6所示，制备不同高度差的梯形水凝胶层培养神经元单细胞，将长有神经元的梯形水凝胶置于水平培养环境中，在上方加载垂直方向的作用力，利用凝胶自身的形变不同所产生的差异应力，提供长轴突神经元轴突部分的压力梯度，研究在该压力梯度作用下，长轴突神经元轴浆流运输的改变及相关作用机制。

具体的，利用材料的压缩比例不同来形成不同的压力。在图7中，交界线标注的位置前后，RGC细胞承受了不同的压力。图中的h4标注为成型后材料的高度。因为胞体受到的力在通过交界线位置后会突然下降，所以设计为h1大于h2。h2和h3的差值即为梯形凝胶的高度差，用来形成压力梯度，而且这一差值为固定的16mm。

为了更好的模拟压力梯度，通过调节图7中各个h的大小来模拟不同情况下的压力梯度。

如上表和图8所示，我们将神经元胞体和轴突感受到的压力用高、中、低来进行描述，对应的凝胶压缩的比例也为高、中、低。引入图7中的h，在压缩后的h4固定的情况下，对于加载前的材料，受力与h差值呈正相关。

（1）正常梯度情况：分别为hn1，hn2，hn3，其他情况的数值与正常情况进行比较；

（2）H压力升高的情况：hh1大于hn1，其它各值相等，在受力压缩后hh1的变化增大，即胞体受力增加，而轴突受力不变；

（3）T压力降低的情况：hl1等于hn1； hl2，hl3小于hn2和hn3，在受力压缩后，hl2/hl3的变化减小，即轴突受力减小，而胞体受力不变。

通过调节h1-4的数值，可以对细胞施加不同的压力并调节压力梯度，切适用于各种神经元的培养。