一种包埋凝胶中生物量的测定方法

摘要

本发明公开一种包埋凝胶中生物量的测定方法，通过测定包埋凝胶中蛋白质浓度间接测得其生物量的方法，包括样品前处理及细菌全蛋白提取、蛋白质浓度测定、数据处理步骤，蛋白质浓度测定采用的是BCA法，将测得的活性污泥中蛋白浓度与MLVSS含量进行拟合，得到生物量标准曲线，之后将测得的包埋颗粒中蛋白浓度数据代入标准曲线中得到包埋颗粒中生物量。采用本发明的技术方法，操作简便，测量结果可靠，具有高度可重复性，可广泛应用于污水处理领域包埋颗粒中生物量的测定。

说明书

技术领域

本发明属于污水处理领域，尤其涉及一种包埋凝胶中生物量的测定方法，进一步涉及一种通过测定包埋凝胶中蛋白质浓度间接测得其生物量的方法。

背景技术

包埋固定化技术是一种新型微生物固定化技术，它是利用聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)、水性聚氨酯(WPU)等材料将微生物包埋在聚物膜或凝胶小格中,载体的网格结构可以将微生物活细胞固定在特定的位置不至于渗漏，同时允许小分子底物及反应代谢产物自由扩散，以达到提高反应器中生物量的目的。

生物处理系统中微生物群体对有机物的降解能力取决于系统中生物量。普通活性污泥法的生物量一般用MLSS(悬浮固体浓度)或MLVSS(挥发性悬浮固体浓度)度量。MLSS的测定需要将泥样在105℃反复烘干之后称取悬浮固体的干重，而MLVSS的测定也需要将泥样在600℃的马弗炉中灼烧2h后称取灰分的重量。活性污泥经过不同材料进行包埋固定化以后，一般会被制成包埋小球或正方体包埋颗粒。包埋小球或颗粒一般呈胶状固体，由于包埋材料性质和包埋颗粒形态的限制使得包埋颗粒无法像普通活性污泥那样通过烘干、灼烧的方式来测定MLSS或MLVSS。

发明内容

为了解决上述技术的不足之处，本发明利用超声波法提取包埋颗粒中的蛋白质，之后利用BCA试剂盒(Beyotime)测定其蛋白浓度，通过蛋白浓度来确定包埋颗粒中的生物量，以解决包埋颗粒中生物量难以测定的问题。

为了达到上述目的，本发明通过以下方案来实现：

一种包埋凝胶中生物量的测定方法包括以下步骤：

步骤(1)、样品前处理及细菌全蛋白提取：首先按MLVSS(以mg计)计：10、30、50、70、90、110、130、150，分别取活性污泥，经用50mlPBS冲洗后倒入第一三角烧杯中；然后取20ml体积活性污泥包埋颗粒样品，经碾碎后用50mlPBS冲洗后倒入第二三角烧杯中；在第一三角烧杯和第二三角烧杯中分别加入1ml裂解液，通过超声波分别提取活性污泥和包埋颗粒样品中的蛋白样品；

步骤(2)、蛋白质浓度测定：利用采用BCA试剂盒测定步骤(1)中所制备的细菌蛋白浓度，所述试剂盒包括BCA试剂A液、B液、5mg/mlBSA溶液，将A液和B液按照50:1混合，制备BCA工作液；完全溶解BSA溶液20ul稀释至100ul，使其终浓度1.0mg/ml，将稀释后的BSA溶液按0、0.5、2.5、5.0、10、15、20ul体积加到96孔酶标板中，将未稀释BSA溶液按6、8ul体积加到96孔酶标板中；分别取20ul步骤(1)中待测蛋白样品加入到96孔酶标板中；向酶标板中各加入200ulBCA工作液，混匀，且37℃孵育30min；测定562nm处的吸光值，并记录读数，以A₅₆₂为纵坐标，BSA溶液含量为横坐标，绘制标准曲线，分别计算活性污泥及包埋颗粒样品中的蛋白浓度；

步骤(3)、数据处理：以步骤(2)中测得的活性污泥中蛋白浓度为(ug/ml)横坐标，以MLVSS(mg)为纵坐标拟合后得到样品中生物量的标准曲线，最后由步骤(2)中测得的包埋颗粒样品中蛋白浓度代入生物量标准曲线得到包埋样品的生物量。

作为优选，步骤(1)通过超声波分别提取活性污泥和包埋颗粒样品中的蛋白样品的工作条件为：超声(11kHz，10s×84个循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30s，间隔1min，冰浴)，将处理后的悬液4℃、14000rpm离心30min。

本发明采用测定包埋颗粒中蛋白质含量的方式间接测得包埋凝胶中生物量，通过测得普通活性污泥中蛋白浓度，将活性污泥中蛋白浓度与MLVSS进行拟合得到反映蛋白浓度与MLVSS关系的标准曲线，再根据测得的包埋颗粒样品中蛋白浓度代入生物量标准曲线得到包埋样品的生物量。

本发明和现有技术相比，具有如下优点和效果：

(1)此发明解决了包埋颗粒中生物量难以用普通方法测定的问题，且方法操作简单，数据可靠，重复性高。

(2)此发明中采用的BCA法测定蛋白浓度已经比较成熟，且根据此方法制成的BCA试剂盒已经被广泛使用。采用试剂盒测定蛋白质浓度的优点是，操作简单，灵敏度高，能够快速准确的测定蛋白浓度。

(3)此发明中采用蛋白质浓度代替MLVSS表征生物处理系统中的生物量。蛋白质在正常生理条件下含量相对恒定，并且与传统的生物量测定方法测量结果成正比例。故此发明测量结果相对可靠，且测量结果具有可重复性。

附图说明

图1为本发明测定方法的流程示意图；

图2是厌氧氨氧化包埋颗粒生物量标准曲线；

图3是反硝化包埋颗粒生物量标准曲线。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明做进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。

如图1所示，本发明实施例提供一种包埋凝胶中生物量的测定方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理及细菌全蛋白提取：分别取一定体积具有稳定处理效果的活性污泥，按MLVSS(以mg计)计：10、30、50、70、90、110、130、150。分别用50mlPBS冲洗后倒入第一三角烧杯中。另取20ml体积活性污泥包埋颗粒样品，经碾碎后用50mlPBS冲洗后倒入第二三角烧杯中。在第一三角烧杯和第一三角烧杯中分别加入1ml裂解液(按照每10⁷个细胞加入1ml细胞裂解液的比例)，通过超声波分别提取活性污泥和包埋颗粒样品中的蛋白样品。工作条件：超声(11kHz，10s×84个循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30s，间隔1min，冰浴)。将处理后的悬液4℃、14000rpm离心30min，弃沉淀留上清液分装保存，备用；同时处理三份平行样。

(2)蛋白质浓度测定：利用BCA法测定(1)中所制备的细菌蛋白浓度。采用BCA试剂盒(Beyotime)进行蛋白浓度的测定。试剂盒包括BCA试剂A液、B液、5mg/mlBSA。其中，试剂A为采用1％BCA二钠盐、2％无水碳酸钠、0.16％酒石酸钠、0.4％氢氧化钠、0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25制得，试剂B为4％硫酸铜，BSA为采用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。测定之前，将A液和B液按照50:1混合，制备BCA工作液；完全溶解BSA溶液20ul稀释至100ul，使其终浓度1.0mg/ml。将稀释后的BSA溶液按0、0.5、2.5、5.0、10、15、20ul体积加到96孔酶标板中，将未稀释BSA溶液按6、8ul体积加到96孔酶标板中。分别取20ul(1)中待测蛋白样品加入到96孔酶标板中。向酶标板中各加入200ulBCA工作液，混匀，37℃孵育30min。测定562nm处的吸光值，并记录读数。以A₅₆₂为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，分别计算活性污泥及包埋颗粒样品中的蛋白浓度。

(3)数据处理：以(2)中测得的活性污泥中蛋白浓度为(ug/ml)横坐标，以MLVSS(mg)为纵坐标拟合后得到样品中生物量的标准曲线。最后由(2)中测得的包埋颗粒样品中蛋白浓度代入生物量标准曲线得到包埋样品的生物量。

本发明的作用原理是：活性污泥法是污水生物处理方法中最为成熟，因而也是最为常用的方法。生物处理系统中微生物群体对有机物的降解能力取决于系统中生物量Ma(即活性污泥中活细胞的量，或活性物质的量)。通常情况下，活性污泥中的生物量无法通过直接测量方法得到，因而大多数情况下生物量都以MLVSS(挥发性悬浮固体)来度量。

MLVSS的测定方法需要将测定MLSS后烘干的滤纸和活性污泥一起放入600℃的马弗炉中灼烧120分钟，称取其灰分的质量。而一般情况下，包埋固定化后的活性污泥会被制成凝胶状的小球，因而无法直接测得其MLVSS值。本发明是将包埋颗粒在PBS中反复冲洗三次以后，在清洁无菌的研钵中将其碾碎，尽可能的将包埋颗粒中的活细胞暴露出来，讲碾碎后的混合物用PBS冲洗到烧杯中，之后向混合液中加入裂解液(按照每10⁷个细胞加入1ml细胞裂解液的比例)。为了使混合液中活细胞完全裂解释放蛋白，将混合液进行超声处理，工作条件：超声(11kHz，10s×84个循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30s，间隔1min，冰浴)。将处理后的悬液4℃、14000rpm离心30min,弃沉淀留上清液分装保存，备用。同时处理三份平行样。超声过程中要进行冰浴处理，以免在超声处理过程中因为混合液温度过高造成蛋白质变性，影响测试结果。

BCA法测定蛋白浓度是国际上已发展相对较为成熟的一种蛋白浓度测定方法。其工作原理是：在碱性条件下，在碱性环境下，蛋白质与Cu²⁺络合，并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。本发明中采用根据BCA法制成的BCA试剂盒(Beyotime)测定包埋颗粒中蛋白浓度。

蛋白质含量在各生物体内相对恒定。以活性污泥为标准样品，测定其蛋白含量，经过拟合后发现，活性污泥中蛋白质浓度与MLVSS成正相关。可知，本发明中提出的以蛋白含量反应包埋颗粒中生物量是切实可行的。

实施例1：

利用本发明测定厌氧氨氧化包埋颗粒中的生物量，具体过程如下：

分别取一定体积具有稳定处理效果的厌氧氨氧化污泥，按MLVSS(以mg计)计：10、30、50、70、90、110、130、150.将分别用50mlPBS冲洗后倒入第一三角烧杯中。另取20ml体积厌氧氨氧化包埋颗粒，经碾碎后用50mlPBS冲洗后倒入第二三角烧杯中。在第一三角烧杯和第一三角烧杯中分别加入1ml裂解液(按照每10⁷个细胞加入1ml细胞裂解液的比例)，通过超声波分别提取厌氧氨氧化污泥和包埋颗粒样品中的蛋白样品。工作条件：超声(11kHz，10s×84个循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30s，间隔1min，冰浴)。将处理后的悬液4℃、14000rpm离心30min,弃沉淀留上清液分装保存，备用。同时处理三份平行样。

采用BCA试剂盒(Beyotime)进行蛋白浓度的测定。试剂盒包括BCA试剂A液、B液、5mg/mlBSA。测定之前，将A液和B液按照50:1混合，制备BCA工作液；完全溶解BSA溶液20ul稀释至100ul，使其终浓度1.0mg/ml。将稀释后的BSA溶液按0、0.5、2.5、5.0、10、15、20ul体积加到96孔酶标板中，将未稀释BSA溶液按6、8ul体积加到96孔酶标板中。分别取20ul待测蛋白样品加入到96孔酶标板中。向酶标板中各加入200ulBCA工作液，混匀，37℃孵育30min。测定562nm处的吸光值，并记录读数。以A₅₆₂为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算厌氧氨氧化污泥及包埋颗粒样品中的蛋白浓度。

以上述测得的厌氧氨氧化活性污泥中蛋白浓度为(ug/ml)横坐标，以MLVSS(mg)为纵坐标拟合后得到样品中生物量的标准曲线。最后将测得的包埋样品中蛋白浓度代入生物量标准曲线得到包埋样品的生物量。

利用上述方法测得的厌氧氨氧化污泥中MLVSS与蛋白浓度数据，经过拟合后得到一条相关系数R₁＝0.9878的直线，说明厌氧氨氧化污泥中MLVSS与蛋白浓度之间有较高的线性正相关关系。以该直线为标准曲线，测得3个不同时期厌氧氨氧化包埋颗粒中MLVSS分别为143.20mg、103.70mg、178.98mg。

实施例2：

利用本发明测定反硝化包埋颗粒中的生物量，具体过程如下：

分别取一定体积具有稳定处理效果的反硝化污泥，按MLVSS(以mg计)计：10、30、50、70、90、110、130、150.将分别用50mlPBS冲洗后倒入三角烧杯中。另取20ml体积反硝化包埋颗粒，经碾碎后用50mlPBS冲洗后倒入三角烧杯中。在第一三角烧杯和第一三角烧杯中分别加入1ml裂解液(按照每10⁷个细胞加入1ml细胞裂解液的比例)，通过超声波分别提取反硝化污泥和包埋颗粒样品中的蛋白样品。工作条件：超声(11kHz，10s×84个循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30s，间隔1min，冰浴)。将处理后的悬液4℃、14000rpm离心30min,弃沉淀留上清液分装保存，备用。同时处理三份平行样。

采用BCA试剂盒(Beyotime)进行蛋白浓度的测定。试剂盒包括BCA试剂A液、B液、5mg/mlBSA。测定之前，将A液和B液按照50:1混合，制备BCA工作液；完全溶解BSA溶液20ul稀释至100ul，使其终浓度1.0mg/ml。将稀释后的BSA溶液按0、0.5、2.5、5.0、10、15、20ul体积加到96孔酶标板中，将未稀释BSA溶液按6、8ul体积加到96孔酶标板中。分别取20ul待测蛋白样品加入到96孔酶标板中。向酶标板中各加入200ulBCA工作液，混匀，37℃孵育30min。测定562nm处的吸光值，并记录读数。以A₅₆₂为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算反硝化污泥及包埋颗粒样品中的蛋白浓度。

以上述测得的反硝化活性污泥中蛋白浓度为(ug/ml)横坐标，以MLVSS(mg)为纵坐标拟合后得到样品中生物量的标准曲线。最后将测得的包埋样品中蛋白浓度代入生物量标准曲线得到包埋样品的生物量。

利用上述方法测得的反硝化污泥中MLVSS与蛋白浓度数据，经过拟合后得到一条相关系数R₂＝0.9907的直线，说明反硝化污泥中MLVSS与蛋白浓度之间有高度线性正相关关系。以该直线为标准曲线，测得某反硝化包埋颗粒样品中MLVSS分别为207.34mg。

图2和图3分别是实验测得的厌氧氨氧化包埋颗粒生物量标准曲线和反硝化包埋颗粒生物量标准曲线。从图中可以看出活性污泥中MLVSS与蛋白浓度具有较高线性正相关关系。表明该发明具有可靠性和重复性，是一种简单可行的生物量测定方法。