沙米愈伤组织及其诱导增殖方法

摘要

本发明提供了一种沙米愈伤组织及其诱导增殖方法，涉及植物细胞培养技术领域。本发明提供的沙米愈伤组织的诱导增殖方法中，诱导培养基为MS培养基，补充0.2～0.5mg/L 6‑BA，2.0～4.0mg/L 2,4‑D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.8～6.0；增殖培养基为MS培养基，补充0.1mg/L 6‑BA，1.0mg/L 2,4‑D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖。本发明提供的沙米愈伤组织的诱导增殖方法，能够以沙米的根、茎、叶等作为外植体，成功诱导出愈伤组织，且具有较高的诱导率。另外，本发明还提供了一种按照所述诱导增殖方法获得的沙米愈伤组织，弥补了现有技术中的不足。

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术领域，尤其是涉及一种沙米愈伤组织及其诱导增殖方法。

背景技术

沙米，又称沙蓬、登相子，是藜科一年生草本植物，广泛分布于我国西北、华北和东北各省区的沙漠地区，以及河南、河北、山西和西藏的部分地区，蒙古、前苏联西伯利亚和中亚地区也有分布。沙米具有耐寒、耐寒、耐贫瘠、耐风蚀沙埋、喜沙质土壤的基本特性。常见于流动沙丘或者半流动沙丘及河岸沙堤，为我国北部常见的沙生植物，是固定流动沙丘的先锋镇植物。

沙米能够起到防风固沙的作用；其种子含丰富的营养成分，是很好的功能食物；其植株也可作为牲畜饲料。因此，对于沙米的研究，具有重要的意义。

已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化。来自于植物各种器宫的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。

理论上讲，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。但是在实践中，愈伤组织的诱导受外植体种类、培养基、激素、培养条件等多种因素的影响，能否成功地诱导出愈伤组织是研究者们面临的一个重要问题。

对于相关研究人员来说，不能成功地诱导出愈伤组织，就无法开展后续的针对植物细胞生理、代谢等相关研究工作。因此，成功诱导出愈伤组织是研究的基础。然而，目前针对沙米，仍然没有能够高效诱导改植物愈伤组织的方法，因此，提出一种沙米愈伤组织的诱导方法，具有重要意义。

因此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沙米愈伤组织的诱导增殖方法，以解决现有技术中尚未存在能够有效诱导沙米愈伤组织的方法的问题。

本发明提供的一种沙米愈伤组织的诱导增殖方法，包括如下步骤：

(1)剪取沙米无菌实生苗，接种于诱导培养基中进行沙米愈伤组织的诱导培养，所述诱导培养基为：MS培养基，补充0.2～0.5mg/L 6-BA，2.0～4.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖，pH值为5.8～6.0；

(2)取步骤(1)中的所述愈伤组织，接种于增殖培养基中进行沙米愈伤组织的增殖培养，所述增殖培养基为：MS培养基，补充0.1mg/L 6-BA，1.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖。

进一步的，步骤(1)中，所述沙米无菌实生苗的获取方法为：将沙米种子用次氯酸钠溶液漂洗，用水冲洗，然后接种于1/2的MS培养基上进行育苗培养。

进一步的，步骤(1)中，所述育苗培养温度为20～25℃，所述育苗培养时间为1～2周。

进一步的，步骤(1)中，所述次氯酸钠溶液的浓度为1～5％，所述漂洗时间为10～15min，所述用水清洗的时间为1～2h。

进一步的，所述沙米无菌实生苗的苗龄为10天。

进一步的，步骤(1)中，所述诱导培养基为：MS培养基，补充0.2mg/L 6-BA，4.0mg/L2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖，pH值为5.8～6.0。

进一步的，步骤(1)中，所述剪取沙米无菌实生苗，具体为剪取沙米无菌实生苗的茎或者叶。

进一步的，步骤(1)中，所述诱导培养的时间为20～40天，优选30天。

进一步的，步骤(2)中，所述增殖培养的时间为20～40天，优选30天。

另外，本发明的另一目的在于提供一种沙米愈伤组织，以弥补现有技术中的不足。

本发明提供了一种沙米愈伤组织，所述沙米愈伤组织按照所述沙米愈伤组织的诱导增殖方法获得。

本发明提供的沙米愈伤组织的诱导增殖方法，经过诱导培养和增殖培养步骤，通过对培养基中不同组分合理的选取、科学的配比，能够以沙米的根、茎、叶等作为外植体，成功诱导出愈伤组织，且具有较高的诱导率。另外，本发明还提供了一种按照所述诱导增殖方法获得的沙米愈伤组织，弥补了现有技术中尚未获得稳定的沙米愈伤组织的不足。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1愈伤组织诱导结果；

图2为本发明实施例1愈伤组织增殖结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种沙米愈伤组织的诱导增殖方法，包括如下步骤：

(1)剪取沙米无菌实生苗，接种于诱导培养基中进行沙米愈伤组织的诱导培养，诱导培养基为：MS培养基，补充0.2～0.5mg/L 6-BA，2.0～4.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.8～6.0；

(2)取步骤(1)中的愈伤组织，接种于增殖培养基中进行沙米愈伤组织的增殖培养，增殖培养基为：MS培养基，补充0.1mg/L 6-BA，1.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖。

在一个优选的实施方式中，步骤(1)中，诱导培养基中6-BA的浓度为0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L或者0.5mg/L。

在另一个优选的实施方式中，步骤(1)中，诱导培养基中2,4-D的浓度为2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、3.5mg/L或者4mg/L。

在另一个优选的实施方式中，步骤(1)中，诱导培养基的pH值为5.8、5.9或者6.0。

在另一个优选的实施方式中，步骤(1)中，沙米无菌实生苗的获取方法为：将沙米种子用次氯酸钠溶液漂洗，用水冲洗，然后接种于1/2的MS培养基上进行育苗培养。

在另一个优选的实施方式中，次氯酸钠溶液的浓度为1％、2％、3％、4％或者5％，次氯酸钠溶液漂洗时间为10min、11min、12min、13min、14min或者15min。

在另一个优选的实施方式中，用水冲洗具体为用流动的水冲洗，并且最后用无菌水冲洗。

在另一个优选的实施方式中，育苗培养的温度为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或者25℃。育苗时间为7、8、9、10、11、12、13或者14天。

在另一个优选的实施方式中，步骤(1)中，剪取沙米无菌实生苗，具体为剪取沙米无菌实生苗的根、茎或者叶。

在另一个优选的实施方式中，步骤(1)中，诱导培养的时间为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或者40天。

在另一个优选的实施方式中，步骤(2)中，增殖培养的时间为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或者40天。

其中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素；2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，是一种除草剂；MS培养基的组分及浓度如表1所示，1/2MS培养基为MS培养基稀释一倍：

表1 MS培养基配方

为了有助于更清楚的理解本发明，现结合具体实施例详细介绍如下：

如未明确指出，实施例中所用到的方法为常规方法，所用到的试剂购自于市场。

实施例1

(1)选取健康的沙米种子，将沙米种子置于三角瓶内，加入浓度为3％的次氯酸钠溶液，采用透气瓶塞封住瓶口，置于摇床上振荡漂洗15min后，置于流水下冲洗1h，然后用无菌水清洗2～3次，将种子接种于1/2MS培养基上进行培养，12天后获取沙米无菌实生苗。培养间温度25℃，普通荧光灯光照强度。

剪取苗龄为10天的沙米无菌实生苗的茎，接种于诱导培养基中进行沙米愈伤组织的诱导培养，其中诱导培养基为：MS培养基，补充0.2mg/L 6-BA，2.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。诱导时间为30天，诱导结果如图1所示，由图1可以看出，该方法成功诱导出了愈伤组织。

(2)取步骤(1)中诱导形成的愈伤组织，切成小块后转接于增殖培养基中进行沙米愈伤组织的增殖培养，其中增殖培养基为：MS培养基，补充0.1mg/L 6-BA，1.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖。增值时间为30天。愈伤组织增殖结果如图2所示。

实施例2

实施例2是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

实施例2与实施例1的不同之处在于，实施例2中的诱导培养基为：MS培养基，补充0.3mg/L 6-BA，3.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

实施例3

实施例3是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

实施例3与实施例1的不同之处在于，实施例3中的诱导培养基为：MS培养基，补充0.5mg/L 6-BA，4.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

实施例4

实施例4是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

实施例4与实施例1的不同之处在于，实施例4中的外植体为苗龄为10天的沙米无菌实生苗的叶。其余步骤与实施例1相同。

实施例5

实施例5是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

实施例5与实施例1的不同之处在于，实施例5中的外植体为苗龄为10天的沙米无菌实生苗的根。其余步骤与实施例1相同。

为了有助于更好的体现本发明的有益效果，现结合对比例解释如下：

对比例1

对比例1是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

对比例1与实施例1的不同之处在于，对比例1中的诱导培养基为：MS培养基，补充0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

对比例2

对比例2是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

对比例2与实施例1的不同之处在于，对比例2中的诱导培养基为：MS培养基，补充2.0mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

对比例3

对比例3是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

对比例3与实施例1的不同之处在于，对比例3中的诱导培养基为：MS培养基，补充0.2mg/L 6-BA，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

对比例4

对比例4是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

对比例4与实施例1的不同之处在于，对比例4中的诱导培养基为：MS培养基，补充0.05mg/L 6-BA，1mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

对比例5

对比例5是在实施例1基础上的改变，实施例1中提到的内容，在本实施例中不再详述。

对比例5与实施例1的不同之处在于，对比例5中的诱导培养基为：MS培养基，补充1mg/L 6-BA，10mg/L 2,4-D，0.70％琼脂以及2.0％蔗糖组成，pH值为5.9。其余步骤与实施例1相同。

实施例1～5及对比例1～5的愈伤组织诱导率结果如表2所示，其中诱导率表示成功诱导出愈伤组织的样本量与总样本量的比值。

表2实施例1～5及对比例1～5的诱导率

6-BA含量(mg/L)2,4-D含量(mg/L)外植体诱导率(％)实施例10.22茎100实施例20.54茎100实施例30.33茎100实施例40.22叶70实施例50.22根50对比例100茎0对比例202茎0对比例30.20茎0对比例40.051茎20对比例5110茎10

发明人，通过科学、合理的筛选，经过大量实验的验证，确定了本发明中诱导培养基和增殖培养基的组分和配比。由表2可知，本发明提供的沙米愈伤组织的诱导增殖方法能够有效的诱导出沙米愈伤组织，具有较高的诱导率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。