一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解柴油的方法

摘要

本发明涉及石油烃类污染的生物修复技术领域，公开了一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其在降解柴油中的应用和一种降解柴油的方法，其中，所述嗜麦芽寡养单胞菌的保藏号为CGMCC NO：10846。本发明的降解柴油的方法包括：将保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的菌剂与柴油污染样品接触，以降解柴油污染样品中的柴油。本发明的嗜麦芽寡养单胞菌能够有效地在液相和土壤相中耐受并降解高浓度的柴油组分，而且无需外加碳源，对氮、磷等其他元素需求亦较低，可适用于贫瘠的土壤及贫营养的工业废水的高浓度柴油生物修复过程。

说明书

技术领域

本发明涉及石油烃类污染的生物修复技术领域，具体地，涉及一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种降解柴油的方法。

背景技术

柴油为一种主要成分为C10-C24的轻质石油烃产品，广泛应用为车辆、船舶、发电机等的燃料。其成分复杂，包括烷烃、烯烃、芳香烃和多环芳烃等等，并可能含有少量的硫、氮化合物。这些组分很多具有致癌、致畸、致突变的性质。

柴油进入土壤中，会导致土壤理化性质发生改变、破坏土壤结构；同时，柴油组分会损害植物根系，阻碍植物根部的呼吸作用，从而抑制植物的生长或导致植物的死亡；土壤中的微生物会被柴油中的部分组分杀死，导致土壤微生态环境改变，最终影响土壤的生态循环能力。进入环境中的柴油可能通过地下水、食物链及直接接触进入人体内环境，可能导致人体的呼吸系统、神经系统、循环系统、内分泌系统等发生病变。有研究者发现，土壤中柴油浓度超过0.1g/kg土壤时，即会对生态环境造成危害。

而柴油的低挥发度和高黏附性使得受到柴油污染的土壤危害较大，难以修复。物理、化学方法对于土壤的修复费用高昂、工作量大、可能导致二次污染，故具有安全、经济、环保性质的生物修复技术成为柴油污染土壤的较好选择。而进行柴油污染降解菌株的筛选是柴油污染土壤生物修复的重要一步。

微生物降解柴油的主要机理是通过P₄₅₀酶等酶和酶系降解多环芳烃，通过烷烃脱氢酶、单加氧酶、双加氧酶等酶和酶系降解链烃，最终产物为CO₂ 和水，并利用此过程提供能量进行生长增殖。

目前，人们已经筛选获得了一些可以降解柴油的微生物，包括细菌、真菌等。假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、不动杆菌属等细菌菌属和酵母属等真菌菌属的一些微生物都被报道具有柴油降解能力。然而，国内外在实际生物修复过程中具有较高柴油耐受能力以及高降解能力，并能够以柴油为单一碳源的菌株报道较少。

发明内容

本发明的目的是为了克服柴油污染生物修复中存在的上述缺陷，提供一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和一种降解柴油的方法。本发明的嗜麦芽寡养单胞菌，能够在较高柴油浓度下生长、以柴油为单一碳源生长并高效降解柴油。

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一种具有较好的柴油耐受能力以及高降解能力，并能够以柴油为单一碳源的嗜麦芽寡养单胞菌。因此，第一方面，本发明提供了一种嗜麦芽寡养单胞菌(又称嗜麦芽寡养单胞菌，Stenotrophomonas maltophilia)，该嗜麦芽寡养单胞菌的保藏号为CGMCC NO：10846。

第二方面，本发明提供了一种含有上述嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的菌剂。

第三方面，本发明提供了上述嗜麦芽寡养单胞菌和/或菌剂在降解柴油中的应用。

第四方面，本发明提供了一种降解柴油的方法，所述方法包括：将上述嗜麦芽寡养单胞菌和/或上述菌剂与柴油污染样品接触，以降解柴油污染样品中的柴油。

本发明的嗜麦芽寡养单胞菌，能够有效地在液相和土壤相中耐受并降解 高浓度柴油组分，而且该菌能够以柴油为单一碳源，无需外加碳源，对氮、磷等其他元素需求亦较低，可适用于贫瘠的土壤及贫营养的工业废水的高浓度柴油生物修复过程。

本发明的嗜麦芽寡养单胞菌在以柴油为单一碳源时能够正常生长繁殖，且在含有高达2.5重量％柴油的基本无机盐培养基中可在12d内降解51.8％的柴油组分，在含有高达2.5重量％柴油的土壤中能够正常生长并在16d内降解60.8％的柴油组分。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC：10846。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，该嗜麦芽寡养单胞菌的保藏号为CGMCC NO：10846。

本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌，为革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌门寡养单胞菌属嗜麦芽寡养单胞菌。该菌株来自贵州省一处输油管道破裂导致柴油污染的受污染土壤，经由液相富集法分离纯化获得。生物学特性为：革兰氏阴性菌，短杆状，具鞭毛，在LB琼脂培养基上菌落呈淡黄色针状，具有明胶水解酶活性，有强解脂性，可利用葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇生长。

其中，本发明的嗜麦芽寡养单胞菌的分离过程可以包括：采集10g贵州省一处输油管道破裂导致柴油污染的受污染土壤样本，加入100mL基本无机盐液体培养基，将该柴油污染土壤样品振荡分散，离心取1mL上清液并加入到200mL含有0.5重量％柴油的基本无机盐液体培养基(基本无机盐液体培养基的配方为：1.0g/L KH₂PO₄；5.0g/L>2HPO₄；1.0g/L(NH₄)₂SO₄；20mg/L>4·7H₂O；10mg/L>2·2H₂O；1mg/L>3；pH＝6.0-7.5)中，在37℃，170rpm摇床中培养3d。吸取1mL培养液并加入到200mL含有1.0重量％柴油的基本无机盐液体培养基中，在37℃，170rpm摇床中培养3d。重复此过程，在基本无机盐液体培养基中每次提高0.5重量％的柴油含量，直至基本无机盐液体培养基中柴油含量为2.5重量％。吸取200μL培养液，涂布于含有2.5重量％柴油的基本无机盐琼脂培养基，37℃培养3d。划取菌落，并在LB琼脂培养基上划线分离获得单菌落，得到多株纯菌株，选择其中六株菌，分别命名为GZ-1、W-5、GZ-3、GZ-4、GZ-5和GZ-6，该六株菌的菌落特点如表1所示。

表1

编号GZ-1W-5GZ-3GZ-4GZ-5GZ-6大小中等小中等小中等中等颜色白色淡黄色白色黄色白色淡黄色

由上可知，分离所得的六株菌均能够耐受高浓度(2.5重量％)柴油，并能够以其为单一碳源进行生长繁殖。

分别将前述六株菌接入200mL LB液体培养基中37℃培养16h，离心，取适量沉淀，用基本无机盐液体培养基分别洗涤沉淀并将沉淀稀释至OD₆₀₀＝2.5，然后向稀释液中加入柴油，控制柴油的含量为2.5重量％，同时 设置空白对照(在基本无机盐液体培养基中加入柴油，并控制柴油的含量为2.5重量％)，然后在37℃，170rpm摇床中培养12d，使用气相色谱(气相色谱仪型号为GC-2010，购自SHIMADZU公司，色谱柱为安捷伦ZORBAX>2SO₄，流速为1.0ml/min，柱温箱为65℃)检测柴油含量，计算柴油移除率，其中柴油移除率＝(降解前柴油的量-降解后柴油的量)/降解前柴油的量，前述六株菌的柴油移除率的结果如表2所示。

表2

编号GZ-1W-5GZ-3GZ-4GZ-5GZ-6空白对照柴油移除率45.5％51.8％32.0％8.3％14.8％30.0％1.1％

由表2可知，菌株W-5在液相中具有明显较好的柴油耐受及降解能力。

对菌株W-5进行生理生化鉴定分析，其生物学特性为：革兰氏阴性菌，短杆状，具鞭毛，在LB琼脂培养基上菌落呈淡黄色针状，具有明胶水解酶活性，有强解脂性，可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇生长。

同时提取菌株W-5的总DNA，进行16S rDNA基因序列分析，其16s rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，结果表明该菌为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。将该嗜麦芽寡养单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：10846。

本发明提供的嗜麦芽寡养单胞菌经过培养能够产生大量嗜麦芽寡养单胞菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述嗜麦芽寡养单胞菌增殖即可，例如，可以按照10⁷CFU/mL的接种量将嗜麦芽寡养单胞菌的活菌体接种于LB培养基中，在30-38℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。

本发明中，对于嗜麦芽寡养单胞菌的培养条件没有特别的限定，可以为 本领域常用的各种培养条件，例如，培养时所用的LB液体培养基的组成可以为：0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠，pH＝6.8-7.0。固体LB培养基中还含有2.5-3.0重量％的琼脂。培养时所用的无机盐培养基的组成可以为：1.0g/L KH₂PO₄；5.0g/L>2HPO₄；1.0g/L(NH₄)₂SO₄；20mg/L>4·7H₂O；10mg/L>2·2H₂O；1mg/L>3；pH＝6.0-7.5。

本发明可以进一步分离上述培养液中的嗜麦芽寡养单胞菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了含有保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的菌剂。

优选情况下，该菌剂含有所述嗜麦芽寡养单胞菌的活菌体。

本发明中，对菌剂中所述嗜麦芽寡养单胞菌的浓度没有特别的限定，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

第三方面，本发明提供了上述嗜麦芽寡养单胞菌和/或菌剂在降解柴油中的应用。优选情况下，柴油源为柴油污染的土壤或含柴油的废水。

第四方面，本发明提供了一种降解柴油的方法，该方法包括：将保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的菌剂与柴油污染样品接触，以降解柴油污染样品中的柴油。

本发明方法中，对于接触的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的 各种的方法，例如可以在柴油污染样品中加入保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌和/或含有保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的菌剂，混合均匀。优选情况下，所述样品为土壤或含柴油的废水。

本发明方法中，对于加入至柴油污染样品中的嗜麦芽寡养单胞菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述嗜麦芽寡养单胞菌能够在所述柴油污染样品中起作用并且对柴油有效降解即可，加入的所述嗜麦芽寡养单胞菌的形式，例如，可以为培养至对数期的菌体或菌液，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉。

本发明对加入的嗜麦芽寡养单胞菌的数量和菌剂的量也没有特别的限制，这可以根据所述柴油污染样品中的柴油的含量以及降解难易程度来决定，例如，当所述样品中的柴油含量较高或较难降解或对于所述嗜麦芽寡养单胞菌的生存较不利时，可以提高所述嗜麦芽寡养单胞菌的接种量和菌剂的加入量；当所述样品中的柴油含量较低或较易降解或对所述嗜麦芽寡养单胞菌的生存的影响较小时，可以减少所述嗜麦芽寡养单胞菌的接种量和菌剂的加入量。

根据本发明，当柴油污染样品为土壤时，为了进一步促进本发明提供的嗜麦芽寡养单胞菌对柴油的降解效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。

实施例

以下将通过实施例和对比例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。

以下实施例和对比例中的实验方法中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

基本无机盐液体培养基配方为：1.0g/L KH₂PO₄；5.0g/L>2HPO₄；1.0g/L(NH₄)₂SO₄；20mg/L>4·7H₂O；10mg/L>2·2H₂O；1mg/L>3；pH＝7.0。

气相色谱法测定柴油含量的方法包括：气相色谱仪型号为GC-2010，购自SHIMADZU公司，色谱柱为安捷伦ZORBAX>2SO₄，流速为1.0ml/min，柱温箱为65℃。

为提取土壤样品中的柴油以测定其含量(g/g)，根据美国EPA 3546方法[123]，采用微波萃取法从土壤样品中分离柴油组分，具体操作如下：

1)取2.0g(湿重)土壤样品，加入微波萃取罐中；

2)向微波萃取罐中加入25.0mL丙酮-正己烷混合溶液(丙酮与正己烷体积比为1：1)；

3)将微波萃取罐妥善密封后对称放入微波萃取仪中，温度探测器连接至微波萃取罐；

4)设定微波萃取功率为1200W，10min内匀速升温至120℃，保持120℃恒温萃取30min；

5)萃取结束后，待温度降至40℃，断开温度探测器，取出微波萃取罐关闭微波萃取仪；

6)使用已称重滤纸过滤萃取液，将萃取液收集于试管中；

7)使用丙酮-正己烷混合溶液(丙酮与正己烷体积比为1：1)清洗微波萃取罐，用同一张滤纸过滤清洗液并收集滤液于试管中用以测定柴油含量；

8)将滤纸和全部土样转移至已称重三角瓶内，置于通风橱，待溶剂完全挥发，称重用以计算土壤样品重量(干重)，并计算土壤样品中的柴油含量(g/g)。

柴油移除率＝(降解前柴油的量-降解后柴油的量)/降解前柴油的量

制备例

将本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌在LB液体培养基中活化2次，每次活化均在170rpm、37±1℃下进行12小时，得到菌液，将得到的菌液以3体积％的接种量接种于300ml LB液体培养基中，在170rpm、37±1℃的培养条件下培养12小时，得到菌液。

实施例1

本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的液相柴油降解能力。

将制备例得到的菌液进行离心，得到菌体，然后用生理盐水洗涤菌体并重悬制得OD₆₀₀为1的生理盐水菌液，分别将前述得到的1mL的本发明的保藏号为CGMCC>

实验结果表明，在含有2.5重量％柴油的基本无机盐液体培养基中，该菌在12d内能够降解51.8％的柴油组分，因此表明本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌不仅能够以柴油为单一碳源进行生长，而且具有较好的耐受和降解高浓度柴油组分的能力。在含有2.5重量％柴油的LB液体培养基中，该菌在12d内能够降解32.3％的柴油组分，即在存在两种以上碳源的液相中该菌也具有较好的耐受和降解高浓度柴油组分的能力。

实施例2

本实施例用于说明本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的土壤相柴油降解能力。

将500g未污染土壤样品分别做如下处理：

CK组：加入去离子水至土壤含水量为20重量％；

NTC组：将土壤样品在121℃下灭菌20min，共灭菌3次，冷却后向土壤中加入1重量％的NaN₃抑菌，然后加入去离子水至土壤含水量为20重量％，混合均匀；

B1组：按照制备例的方法得到前述分离得到的GZ-1菌株的菌液，进行离心，得到菌体，然后用生理盐水洗涤菌体并重悬制得OD₆₀₀为2.5的生理盐水菌液，在土壤样品中加入50mL的前述得到的GZ-1菌株的生理盐水菌液，然后加入去离子水至土壤含水量为20重量％，混合均匀；

B2组：将制备例得到的菌液进行离心，得到菌体，然后用生理盐水洗涤菌体并重悬制得OD₆₀₀为2.5的生理盐水菌液，在土壤样品中加入50mL前述本发明的保藏号为CGMCC>

B1+B2组：在土壤样品中加入25mL前述本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌的生理盐水菌液和25mL前述得到的GZ-1菌株的生理盐水菌液，然后加入去离子水至土壤含水量为20重量％，混合均匀。

以上各组均加入过滤除菌的柴油(-20#)至柴油含量为2.5重量％。

在25℃下培养，每日补加去离子水至土壤含水量为20重量％，进行16d的培养，并使用微波萃取分离柴油组分，气相色谱法测定最终柴油含量，计算柴油移除率，结果表3所示。

表3

编号NTC组CK组B1组B2组B1+B2组柴油移除率15.8％28.4％52.0％60.8％50.2％

由表3可以看出，本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌在含有高达2.5重量％柴油的土壤中能够正常生长并能够在16d内降解60.8％的柴油成分，即本发明的保藏号为CGMCC NO：10846的嗜麦芽寡养单胞菌在土壤相中具有较好的柴油耐受及降解能力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。