溶菌酶纳米晶溶胶及采用其制备的蛋白质多晶水凝胶和制备方法

摘要

本发明公开了一种溶菌酶纳米晶溶胶及采用其制备的蛋白质多晶水凝胶和制备方法，该溶菌酶纳米晶溶胶是在pH为6.0～6.9、温度为30～50℃下用三(2‑羧乙基)膦还原溶菌酶形成，溶菌酶纳米晶溶胶在氨水作用和加热条件下，溶菌酶纳米片晶自组装形成三维网络结构的蛋白质多晶水凝胶。本发明的蛋白质多晶水凝胶是纯粹的蛋白质水凝胶材料，具有良好的生物相容性和抗菌性，同时由于该水凝胶是由溶菌酶纳米片晶组成，具有各项异性，是一种新型的各相异性软材料和良好的化学软模板。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质超分子自组装材料的制备技术领域，具体涉及一种溶菌酶纳米晶溶胶，以及完全基于溶菌酶蛋白质分子的水凝胶制备，特别是由于该蛋白质水凝胶是由蛋白质纳米晶组成，制备的是一种具有抗菌性能各向异性的软材料。

背景技术

蛋白质水凝胶是由蛋白质分子相互作用形成的三维网络和大量水构成的软材料，能够在水中溶胀而不溶解，在生物医学领域，尤其是在药物的缓释、组织工程支架、生物传感、柔性促动器以及人工细胞外基质等方面具有广泛的应用前景。同时，蛋白质水凝胶材料是一种理想的化学软模板，可应用于合成具有特殊结构的有机无机复合材料。

目前，一般的蛋白质水凝胶材料都是由具有结合位点的蛋白质和一些大分子如PEG相互作用，或者和金属离子之间存在络合作用从而发生凝胶化形成水凝胶材料。因此一般的蛋白质水凝胶材料配方都是基于蛋白质的复配方，即使水凝胶中含有非蛋白质物质如PEG、金属离子等。这些都限制了蛋白质水凝胶的实际医用。再者，过多杂质的引入也会影响蛋白质水凝胶作为一类理想的化学软模板应用于合成具有一定分级结构的复合材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种溶菌酶纳米晶溶胶，以及基于该蛋白质纳米晶自主装制备的生物相容性好、具有良好抗菌能力的纯蛋白质多晶水凝胶。

本发明的溶菌酶纳米晶溶胶由下述方法制备得到：

将溶菌酶和三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入pH值为7.3～7.4的tris-HCl缓冲液中，控制tris-HCl缓冲液中溶菌酶的浓度为0.1～5mg/mL、TCEP的浓度为1～10mmol/L，然后用tris水溶液或盐酸调节pH至6.0～6.9，30～50℃密封静置6～24小时，用超纯水进行透析，得到蛋白质纳米晶溶胶。

上述溶菌酶纳米晶溶胶的制备方法中，优选控制tris-HCl缓冲液中溶菌酶的浓度为0.5～1mg/mL、TCEP的浓度为2.5～5mmol/L。

上述溶菌酶纳米晶溶胶的制备方法中，进一步优选用tris水溶液或盐酸调节pH至6.5～6.6，35～40℃密封静置8～12小时。

本发明的蛋白质多晶水凝胶由下述方法制备得到：

将溶菌酶纳米晶溶胶与氨水按体积比为1:0.002～0.01混合，在50～80℃下加热2～10分钟，溶菌酶纳米晶在溶液表面自组装形成蛋白质多晶水凝胶。

上述蛋白质多晶水凝胶的制备方法中，优选将溶菌酶纳米晶溶胶与氨水按体积比为1:0.005～0.008混合，在60～70℃下加热2～5分钟。

本发明在较温和条件下用TCEP还原溶菌酶中的二硫键，使溶菌酶分子发生相转变，即溶菌酶分子中的多肽链发生解折叠，溶菌酶由富含α螺旋结构的天然蛋白质结构转变为富含β片层结构的蛋白聚集体，β片层结构进一步有序堆积形成密实结晶核，解折叠的多肽链形成连续相作为壳，形成具有核壳结构的溶菌酶纳米晶溶胶。

本发明基于溶菌酶纳米晶超分子自组装形成蛋白质多晶水凝胶，由于制备蛋白质纳米晶溶胶时引入的TCEP小分子在透析过程中完全除掉，所以获得的是纯粹的蛋白质水凝胶材料，更有利于其进一步加工和应用。

本发明的蛋白质多晶水凝胶是三维网络结构，具有良好的生物相容性和抗菌性。同时由于该水凝胶是由溶菌酶纳米片晶组成，使其具有各项异性，表现在水分逐渐挥发的过程中会形成多层有序结构，因此，其是一种新型的各相异性软材料和良好化学软模板。另外，本发明蛋白质多晶水凝胶还具有一定的力学强度，能够用作细胞培养基。

附图说明

图1是实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶的数码照片。

图2是天然溶菌酶和溶菌酶纳米晶溶胶的圆二色谱图。

图3是实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶的透射电子显微镜图。

图4是实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶的X-射线衍射图。

图5是实施例4制备的蛋白质多晶水凝胶的照片。

图6是实施例4制备的蛋白质多晶水凝胶的储能模量G＇和损耗模量G＇＇随应变的变化图。

图7是实施例4制备的蛋白质多晶水凝胶的储能模量G＇和损耗模量G＇＇随频率的变化图。

图8是实施例4制备的蛋白质多晶水凝胶的断面扫描电镜图。

图9是实施例4制备的蛋白质多晶水凝胶干燥后的断面扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

制备溶菌酶纳米晶溶胶

将50mg溶菌酶和58.6mg(0.25mmol)TCEP加入100mL pH值为7.4的tris-HCl缓冲液中，tris-HCl缓冲液中溶菌酶的浓度为0.5mg/mL、TCEP的浓度为2.5mmol/L，然后用10mmol/L tris水溶液调节pH至6.5，37℃密封静置8小时，用超纯水进行透析处理，透析袋的截留分子量为2000，得到纯净的溶菌酶纳米晶溶胶，见图1。由图2可见，溶菌酶发生相转变后由双峰变成216nm处的单峰，说明溶菌酶由富含α螺旋结构的天然蛋白质结构转变成富含β片层结构的蛋白聚集体。由图3可见，β片层结构有序堆叠，形成具有核壳结构的溶菌酶纳米晶，其中β片层结构有序堆积形成密实结晶核，解折叠的多肽链形成连续相作为壳。由图4可见，所得溶菌酶纳米晶溶胶含有结晶相。

实施例2

制备溶菌酶纳米晶溶胶

将100mg溶菌酶和117.2mg(0.5mmol)TCEP加入100mL pH值为7.4的tris-HCl缓冲液中，tris-HCl缓冲液中溶菌酶的浓度为1mg/mL、TCEP的浓度为5mmol/L，然后用tris水溶液调节pH至6.9，47℃密封静置6小时，用超纯水进行透析处理，透析袋的截留分子量为2000，得到纯净的溶菌酶纳米晶溶胶。

实施例3

制备溶菌酶纳米晶溶胶

将500mg溶菌酶和234.4mg(10mmol)三(2-羧乙基)膦加入100mL pH值为7.4的tris-HCl缓冲液中，tris-HCl缓冲液中溶菌酶的浓度为5mg/mL、三(2-羧乙基)膦的浓度为10mmol/L，然后用tris水溶液调节pH至6.0，30℃密封静置24小时，用超纯水进行透析处理，透析袋的截留分子量为2000，得到纯净的溶菌酶纳米晶溶胶。

实施例4

制备蛋白质多晶水凝胶

将4mL实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶与30μL氨水混合均匀，在65℃下加热3分钟，在溶液表面形成蛋白质多晶水凝胶(见图5)，其固含量为4.5％左右。由图6和图7可见，所得蛋白质多晶水凝胶具备一定的力学性能，由于水凝胶是由溶菌酶纳米片晶自组装而成，所以水凝胶的储能模量G＇总是大于损耗模量G＇＇。

室温下将所得蛋白质多晶水凝胶在密闭干燥器中静置2周，缓慢挥发水溶剂形成蛋白质薄膜。由图8和图9可见，干燥前蛋白质多晶水凝胶为三维网络结构，干燥后所得蛋白质薄膜具有有序多层结构，说明本发明的蛋白质多晶水凝胶是一种各向异性材料。

实施例5

制备蛋白质多晶水凝胶

将4mL实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶与40μL氨水混合均匀，在50℃下加热10分钟，在溶液表面形成蛋白质多晶水凝胶。

实施例6

制备蛋白质多晶水凝胶

将4mL实施例1制备的溶菌酶纳米晶溶胶与20μL氨水混合均匀，在70℃下加热3分钟，在溶液表面形成蛋白质多晶水凝胶。