一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒

摘要

本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该方法包括：将P815细胞接种于培养基中；在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。本发明提供的检测方法结果准确可靠，与传统的β‑氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，但灵敏度比β‑氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；本发明的检测方法简便易行、快速，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。

背景技术

过敏反应即变态反应，是外源性抗原物质与体内抗体间所发生的一种非正常的免疫反应，为常见的不良反应之一。可以诱发过敏反应的物质很多，如具有完全抗原性的蛋白质、多肽、多糖等大分子物质；另一些分子较小的化合物可作为半抗原与体内蛋白质结合成完全抗原，从而引起过敏反应。目前涉及到过敏反应的过敏物质很多，发生频率较高的有药品(中药及西药)、食品、花粉、螨虫等。急性过敏反应包括I型超敏反应和类过敏反应。最新调查研究表明，77％的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于I型超敏反应。类过敏反应无需IgE介导，首次接触药物即可出现过敏症状，给人类的生活带来极大的危害。

鉴于类过敏反应的危害性，尤其在医药领域中的频繁发生，如中药注射液的过敏反应，使人们越来越意识到早期预防的重要性。其中，致敏原物质的早期快速检测是降低类过敏反应的重要手段。

肥大细胞是诱发类过敏反应的中心枢纽，它在受抗原刺激后脱颗粒直接导致一系列过敏症状的产生。目前，常用的体外检测肥大细胞脱颗粒的方法主要有β-氨基己糖苷酶法、类胰蛋白酶法、组胺法、扫描及透射电镜等。这些方法经典稳定，但都有各自的局限性。为了检测相应指标，肥大细胞经过各种化学固定及显色处理，失去了活体状态下脱颗粒的一系列生物信息，由此也引起很多检测误差，也无法进行精确定量及动态观察。因此，如何准确检测类过敏原成为了新的研究方向。

研究发现在肥大细胞脱颗粒的过程中，钙离子和环磷腺苷的升高是活性介质释放的前提条件，这种现象在1973年就被发现，但真正将钙离子和环磷腺苷的活体动态监测作为评价指标，应用于类过敏原的早期快速评估尚没有人尝试。

专利号为CN102154434B的专利中提出，用钙流检测方法确认物质的过敏性，可以对致敏原进行筛选。但钙流方法只适用于贴壁细胞的检测，若使用悬浮或半悬浮细胞，会使得检测数据不真实，不稳定。同时，钙流检测只能针对与受体快速结合并发挥作用的化合物，不适合反应较慢的化合物。因此，需要提供一种新型的检测引起类过敏反应的物质的方法及试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该检测方法结果准确可靠，与传统的β-氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，但灵敏度比β-氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；本发明的检测方法简便易行、快速，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法，包括如下步骤：

步骤a：将P815细胞接种于培养基中；

步骤b：在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；

步骤c：根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。

在本发明中，应用P815细胞进行实验，使用1-磷酸肌醇(IP1)来替代钙流的检测来确认物质的过敏性。IP1检测反映的是第二信使1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)的含量，当样品中加入LiCl后，IP1不再代谢，而是蓄积在细胞内。随着细胞内产生的IP1增多，游离的IP1与抗体结合增多，信号逐渐减弱。本发明建立了一种简便易行、可靠的、通过检测肥大细胞内IP1和cAMP变化来反映其脱颗粒状况的方法，并通过与传统方法对应比较，以C48/80为阳性药物，对临床不同种类的中药注射液进行了实际应用，充分说明了本方法的快速、灵敏性及可靠性。该方法克服了传统方法的不足，可应用于类过敏原的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值。

在本发明提供的实施例中，步骤b中生物分子为抗体。

作为优选，步骤b中检测IP1和/或cAMP的浓度采用的试剂为基于HTRF技术的IP1检测试剂和/或cAMP检测试剂。

作为优选，P815细胞为对数生长期的P815细胞。

作为优选，待测物为药物或螨。

在本发明提供的实施例中，待测物为药物注射剂。

在本发明提供的实施例中，待测物为中药注射剂。

在本发明提供的实施例中，待测物选自参麦注射液、注射用血塞通、脉络宁注射液、舒血宁、痰热清注射液或热毒宁注射液。

本发明还提供了一种检测引起类过敏反应的物质的试剂盒，包括：与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子。

作为优选，生物分子为抗体。

在本发明提供的实施例中，与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子为IP1抗体和/或cAMP抗体。

作为优选，与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子为经过标记的生物分子。通过标记读取信号获得目标物质的浓度。

在本发明的实施例中，检测IP1和/或cAMP的浓度的试剂为基于HTRF技术的IP1检测试剂或cAMP检测试剂。

在本发明中，应用HTRF技术的IP1和cAMP检测试剂盒，在活体状态下动态监测在致敏原物质刺激下P815细胞内IP1和cAMP的变化，以变化程度作为类过敏反应判定的标准。该方法在活细胞状态下，灵敏、快速对致敏原进行筛选，克服了原有方法的不足，在类过敏反应发生的早期即可发现潜在威胁，将为过敏原过敏性筛查、过敏原检测、环境安全性监测等领域提供新的方法。

本发明提供了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒。该方法包括：将P815细胞接种于培养基中；在培养基中加入待测物及与IP1和/或cAMP特异性结合的生物分子，检测IP1和/或cAMP的浓度；根据IP1和/或cAMP的浓度，确认待测物是否为引起类过敏反应的物质。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明提供的检测方法结果准确可靠，与传统的β-氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，克服了传统方法的不足，可应用于引起类过敏反应的物质的早期快速筛查及鉴定，具有广泛的应用价值；

2、本发明提供的检测方法的灵敏度比β-氨基己糖苷酶释放率检测方法要高；

3、本发明的检测方法简便易行、快速；

4、本发明检测方法适用于贴壁细胞的检测，也适用于悬浮或半悬浮细胞的检测；

5、本发明检测方法适合于类过敏反应较慢的化合物的检测。

附图说明

图1示IP1的标准曲线；

图2示cAMP的标准曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的检测引起类过敏反应的物质的方法及其试剂盒中所用生物材料、试剂、仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

实验方法：

1.材料

试剂：RPMI1640培养基(GIBCO)；胎牛血清(Gibco)，cAMP dynamic2kit(cisbio)，IP1Tb kit(cisbio)，384孔板(Corning)，Compound48/80(Sigma，美国)，β-D-氨基葡萄糖胺(Sigma)，参麦注射液(河北神威药业有限公司，批号：1401192)，注射用血塞通(黑龙江省珍宝岛药业股份有限公司，批号：14ka222)，脉络宁注射液(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号：20140403)，舒血宁(黑龙江省珍宝岛药业股份有限公司，批号：B20140707)，痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司，批号：1502204)，热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号：20140722)。

细胞：小鼠肥大细胞瘤细胞P815细胞购自国家实验细胞资源共享平台。

仪器：二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，超净工作台(苏州净化，中国)，钙流检测工作站(FlexStation3，Molecular Devices)。

机体发生类过敏反应时，会有肥大细胞脱颗粒而释放炎症介质的现象。P815细胞是小鼠肥大细胞瘤细胞，具有在体肥大细胞的反应特性，常作为类过敏反应的研究对象。Compound 48/80(C48/80)是N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物，具有促进肥大细胞脱颗粒的作用，常将它作为类过敏实验的阳性药。

2.方法

2.1细胞培养

P815细胞用RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)，于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养，3d传代一次，传代比例为1:3。

2.2HTRF检测IP1

取对数期生长的P815细胞，按照检测试剂盒方法，用Stimulate Buffer调节细胞浓度，接种于384孔板中，4900个/孔，分设标准品组(无细胞)、阴性对照组(无细胞)、阳性药组、注射剂组和空白对照组。其中标准品组按照试剂盒说明设置0、10.74、42.97、171.875、687.5、2750、11000nM 7个浓度做标曲；阴性对照组加入同体积的Stimulate Buffer。阳性药组以终浓度为0、10、20、40、80、160、320、640μg/mL的C48/80；注射剂组，分别设置临床剂量和2倍临床剂量孔，参麦注射液SMZSY(终浓度分别为13.33ml/L、26.66ml/L)、血塞通注射液XSTZSY(2.22ml/L、4.44ml/L)、脉络宁注射液MLNZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)、舒血宁注射液SXNZSY(5.56ml/L、11.12ml/L)、痰热清注射液TRQZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)、热毒宁注射液RDNZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)；空白对照孔加入同体积的Stimulate Buffer，培养箱孵育1h后，阴性对照孔加入3μL的lysis solution，其余各孔加入3μL IP1试剂工作液，之后，各孔加入3μL IP1cryptate，室温孵育1h后，按照试剂盒要求设置检测参数，上机检测。

制作标准曲线，拟出公式，按照公式，计算各孔的IP1浓度。

2.3HTRF检测cAMP

收集处于对数生长期的P815细胞，调节细胞浓度，接种于384孔板中，4900个/孔，分设标准品组(无细胞)、阴性对照组(无细胞)、阳性药组、注射液组合空白对照组。阳性药组分别加入C48/80溶液(终浓度为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.63μg/mL、7.81μg/mL)，注射液组，SMZSY(终浓度分别为13.33ml/L、26.66ml/L)、XSTZSY(2.22ml/L、4.44ml/L)、MLNZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)、SXNZSY(5.56ml/L、11.12ml/L)、TRQZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)、RDNZSY(4.44ml/L、8.88ml/L)，对照孔加入等体积PBS溶液，标准孔加入等体积cAMP标准品，置培养箱中孵育30min，按照说明书进行检测。

制作标准曲线，拟出公式，按照公式，计算各孔的cAMP浓度。

2.4β-氨基己糖苷酶释放率检测

取对数期生长的P815细胞，按5×10⁵/ml接种于96孔板中，每孔200μl，置37℃、5％CO₂培养箱中孵育过夜。300g、5min离心，弃上清，加入100μl无血清培养基配制的不同浓度的C48/80溶液，使其终浓度分别为200μg/ml、100μg/ml，50μg/ml；各注射液组按照以上浓度加入注射液，空白对照组加入等体积的培养液，总酶孔加入等体积0.5％的Triton>2培养箱孵育1h，再加入0.1mol/L>2CO₃/NaHCO₃缓冲液200μl终止反应，检测OD>

β-氨基己糖苷酶释放率(％)＝(样品孔OD-调零孔OD)/(总酶孔OD-调零孔OD)×100％。

3.数据处理

结果用表示，组间显著性差异用t检验方法进行比较。

4.结果

4.1 IP1检测结果

4.1.1标准曲线

IP1的标准曲线见图1。

4.1.2 C48/80和不同种类中药注射液对P815细胞胞内IP1浓度的影响

表1 C48/80和不同种类中药注射液对P815细胞胞内IP1浓度的影响

注：*与Control比较，p≤0.05，**与Control比较，p≤0.01；

结果显示，40μg/mL～640μg/mL的C48/80，可以增大P815细胞胞内IP1的浓度，与Control组比较，差异具有统计学意义(p≤0.05或p≤0.01)。各注射液组，2倍临床剂量的脉络宁注射液显著增大了P815细胞胞内IP1浓度的浓度，与Control组比较，差异具有统计学意义(p≤0.05)。

4.2 cAMP检测结果

4.2.1标准曲线

cAMP的标准曲线见图2。

4.2.2 C48/80和不同种类中药注射液对P815细胞胞内cAMP浓度的影响

表2 C48/80和不同种类中药注射液对P815细胞胞内cAMP浓度的影响

注：*与Control比较，P≤0.05，**与Control比较，P≤0.01；

结果显示，7.81μg/mL～500μg/mL的C48/80，可以增大P815细胞胞内cAMP的浓度，与Control组比较，差异具有统计学意义(p≤0.05或p≤0.01)。各注射液组，2倍临床剂量的参麦注射液显著增大了P815细胞胞内IP1浓度的浓度，与Control组比较，差异具有统计学意义(p≤0.05)。

4.3β-氨基己糖苷酶释放率检测结果

表3不同种类中药注射液对P815细胞β-氨基己糖苷酶释放率的影响

注：*与Control比较，p≤0.05，**与Control比较，p≤0.01。

结果显示，不同浓度的各中药注射液对P815细胞β-氨基己糖苷酶释放率均无明显影响。

在应用实例中，本申请用不同的检测方法对临床6种中药注射液致肥大细胞脱颗粒作用进行比较性研究。在剂量选择上，按照给药剂量与人体血容量的比例，分临床给药剂量和2倍临床剂量。结果发现细胞内IP1和cAMP检测方法与传统的β-氨基己糖苷酶释放率实验检测结果基本一致，但是灵敏度比β-氨基己糖苷酶释放率检测方法要高。猜测可能是由于β-氨基己糖苷酶检测法是一种生化检测法，最后通过比色来确定结果，其检测限可能比较高，较少量的脱颗粒反应不会被其检测到。而细胞内IP1和cAMP的检测由于直接检测单个细胞的变化，且HTRF检测的是目的产物累加的结果，故灵敏度更高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。