海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA的测定方法

摘要

本发明公开一种通过测定海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3‑甲基喹噁啉‑2‑羧酸）从而间接体现生物体药物残留指标的测定方法，包括仪器与试剂的选择和调配、样品提取与净化、具体的色谱条件和质谱条件。与现有技术相比，本发明可通过测定海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3‑甲基喹噁啉‑2‑羧酸）的含量从而间接体现生物体药物残留指标，具有速度快、成本低、对养殖海产品无伤害的特点，进而对目前养殖行业滥用抗生素的情况提供快速准确的数据支持，有利于促进养殖行业的健康发展。

说明书

技术领域

本发明涉及海水养殖技术领域，具体是一种海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的测定方法。

背景技术

现代养殖业日益趋向于规模化、集约化，使用抗生素、维生素、激素、金属微量元素等，更成为保障海水养殖业发展必不可少的一环。然而不幸的是，由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，在养殖中滥用药物的现象普遍存在。在我国情况尤为严重。滥用兽药的直接后果是导致兽药在动物性食品中的残留，摄入人体后，影响人类的健康。动物性食品中的兽药残留对人的潜在危害愈来愈引起人们的重视。只有建立起一套简便高效的药物残留测定方法，是有效地控制药物残留发生的基础。

喹乙醇（Olaquindox）又称喹酰胺醇、快育灵，是20世纪70年代初由西德拜尔药厂研制合成的饲料添加剂，因其具有广谱抗菌效果和促生长作用，被广泛用于畜禽养殖、抗菌治疗和水产动物的疫病防控。然而大量生物毒性试验表明：过量的喹乙醇会在动物体内残留，具有明显的蓄积毒性，致癌、致畸变作用和DNA损伤等毒副作用。鉴于对人类健康造成的危害，欧盟委员会EC2788/98决议将喹乙醇列为禁用药，国内NY5070-2002准则中也规定喹乙醇禁用渔药。但喹乙醇本身不稳定，在动物体内能够短时间内代谢成十多种产物，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是主要代谢物之一，其在体内相对稳定，是国际食品法典委员会认定的残留标识物之一，因此通常将喹乙醇代谢物MQCA作为残留标示物。2003年我国农业部规定了肌肉和肝脏组织中MQCA的最大残留量分别为4μg/kg和50μg/kg。

乙酰甲喹（Mequindox，MEQ）又称痢菌净，属喹噁啉类化合物，是我国自行研制的具有自主知识产权的一类新兽药。由于具有广谱抗菌活性，在我国兽医临床上应用广泛。但是，生产实践表明，乙酰甲喹毒性偏大，剂量高于治疗量的3～5倍或长时间连续使用时可引起中毒甚至死亡。临床毒理学研究也提示其可引起基因突变、染色体畸变，具有肝脏毒性、肾上腺毒性和两代繁殖毒性。

华中农业大学的刘兆颖对乙酰甲喹在肝微粒体中代谢物进行了相对定量，认为Ｎ４－脱一氧乙酰甲喹是乙酰甲喹在猪、鸡和大鼠 肝 微粒体 中 的 主 要 代 谢 产 物 之一。华中农业大学的尹伏军则进行了氚标乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内的吸收分布、排泄和代谢研究，最终确定脱二氧乙酰甲喹（３－甲基－２－乙酰基－喹喔啉）为乙酰甲喹在这三种动物体内的残留标示物。

目前三种残留标示物均需通过三种不同的方法进行分别测定，尚无通过一个样本进行三种残留标示物一次测定的先例。更无通过养殖海水间接体现生物体药物残留的先例。

发明内容

本发明的目的是公开一种通过测定海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）从而间接体现生物体药物残留指标的测定方法，包括仪器与试剂的选择和调配、样品提取与净化、具体的色谱条件和质谱条件。

与现有技术相比，本发明可通过测定海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的含量从而间接体现生物体药物残留指标，具有速度快、成本低、对养殖海产品无伤害的特点，进而对目前养殖行业滥用抗生素的情况提供快速准确的数据支持，有利于促进养殖行业的健康发展。

具体实施方式：

一种海水中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA的测定方法，其特征在于：

a) 仪器与试剂：

超高效液相色谱-串联质谱仪(Quattro Premier XE, Waters, USA)，超纯水仪(Milli-Q Gradient, Millipore, France)，高速离心机(TGL-10C, 上海安亭科学仪器厂)，超声波清洗器(KQ-600E, 昆山市超声仪器有限公司)，氮吹仪(N-EVAP^TM112,Organomation>

b) 前处理方法

量取500mL海水样品，固相萃取小柱预先用3mL甲醇和3mL 水活化，加入海水样品，用3mL水溶液淋洗，6mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱收集；40℃下氮气吹干，加入1mL含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（70:30, v/v）1mL定容，超高效液相色谱串联质谱法测定；其中脱一氧乙酰甲喹、脱二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的定量限均为：10ng/L；

c) 色谱条件：

色谱柱：ACQUITY^TM>18>

d) 质谱条件：

配制浓度均为1 μg/mL三种乙酰甲喹代谢物自动调谐液，采用蠕动泵进样方式(10 μL/min)，自动调谐，优化的质谱条件如下所示：电离方式：正离子(ESI+)；电离电压：2.50 kV；锥孔电压：30 V；离子源温度：110℃；锥孔反吹气流速：50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流速：700 L/h；氩气流速：0.11 mL/min；其他参数如下，*代表定量离子：

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