水性眼用溶液和治疗干眼综合征的方法

摘要

本发明涉及一种无菌水性眼用溶液，包含在载体溶液中的约0.05％至约0.5％(w/w)的N‑(N‑乙酰半胱氨酸‑)壳聚糖或其药学上可接受的盐，其中N‑(N‑乙酰半胱氨酸‑)壳聚糖的游离硫醇基团的含量为80μmol/g聚合物至280μmol/g聚合物。本发明还涉及含有所述眼用溶液的容器和所述眼用溶液在预防或治疗干眼综合征或干眼体症和/或干眼症状中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及水性眼用溶液。本发明还涉及含有水性眼用溶液的容器。本发明进一步涉及采用新型水性眼用溶液治疗干眼综合征的方法。该方法在减轻干眼体征和/或干眼症状中有用。该方法包含对有需求的受试者施用含有硫醇化壳聚糖的水性眼用溶液。

背景技术

干眼综合征(DES)(也称为干眼病)是一种高度普遍的眼表疾病。约4千万美国人受某种类型的干眼症的影响，其中的大部分(50岁以上)患有中度到重度干眼症(Schaumberg，Sullivan等人，2003，Prevalence of dry eye syndrome among US Women，Am JOphthalmol(136)：318-326；Schaumberg，Dana等人，2009，Prevalence of dry eyedisease among US men：estimates from the Physicians'Health Studies，ArchOphthalmol(127)：763-768)。

广泛地，干眼病可以是与泪膜不稳定性和功能障碍(诸如增加的泪液蒸发和/或减少的水分泌)相关的任何综合征。在不同表述中，被称为一般术语“干眼病”的是：干燥性角膜结膜炎(KCS)、年龄相关性干眼症、史蒂文斯-约翰逊综合征、舍格伦综合征、眼瘢痕性类天疱疮、角膜损伤、眼表感染、赖利-戴综合征、先天性无泪、营养失调或缺乏(包括维生素缺乏)、药理学副作用、腺和组织破坏、自身免疫和其它免疫缺陷病症、和昏迷病人的眨眼无能。还包含由环境暴露于大气颗粒物、烟、烟雾和过度干燥的空气引起的干眼症状；和由隐形眼镜不耐受和由计算机工作或计算机游戏引起的眼压引起的干眼症状。

还有其它与干眼病具有高共病程度的疾病：过敏性结膜炎(季节性和慢性)，睑炎和睑板腺功能障碍。这些情况会影响泪膜的质量和稳定性，导致干眼体征和症状。

诸如光折射角膜磨镶术(PRK)、准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK)和准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)的激光辅助的视力矫正术也负面影响了泪膜功能并且经常引起(暂时)干眼病。

目前，DES的管理包含药物和非药物治疗，其包括环境管理、加重因素的避免、眼睑卫生、泪液补充(人工泪液)、促分泌剂(增加泪液的产生)、泪管栓塞、抗炎剂(环孢菌素、类固醇)、湿润室、和甚至唾液腺自动移植(Behrens，Doyle等人，2006，Dysfunctional tearsyndrome：a Delphi approach to treatment recommendations，Cornea(25)：900-907)。目前用于治疗DES的可用选项是不足的。甚至泪液补充也不是理想的治疗选择，因为它需要受试者在一天中多次重复人工泪液安装。

多种聚合物已经被公开作为提供一些益处以减轻DES症状的可能帮助，并且事实上一些人工泪液包含一种或多种聚合物，这些人工泪液包括欧盟内用于干眼的目前最畅销的5种非处方(OTC)产品(和)。这些聚合物旨在保护眼粘膜并为眼表提供润滑。示例包括纤维素衍生物、透明质酸、液体多元醇、聚乙烯醇、聚维酮、聚羧乙烯和羟丙基瓜尔胶。治疗DES的产品中的聚合物在眼表上具有相对短的停留时间并需要频繁滴注。为了增加眼部停留时间，一些制剂含有凡士林或矿物油；然而，由于显著模糊，这些高粘度产品只能在晚上睡觉前使用(Abelson等人，2008，TearSubstitutes.在：Albert和Miller，编辑，Principles and Practices of Ophthalmology，第3版，第1卷，Philadelphia：W.B.Saunders Company，287-292)。所有其它泪液替代品必须在一天中重复滴注。

对这些聚合物的一些潜在改进已经被公开。其中一个潜在改进可以是使用具有显著粘膜粘附的性质的聚合物，以增加制剂在眼表上的停留时间，而不引起显著模糊。壳聚糖，衍生自天然聚合物甲壳素的聚阳离子聚合物，其粘膜粘附的性质是众所周知的。含有壳聚糖的眼用制剂的眼部停留时间的增加不仅是由于其粘度增强性质，还因为壳聚糖与带负电荷的粘蛋白在眼表上的相互作用(Wadhwa，Paliwal等人，2009，Chitosan and its rolein ocular therapeutics，Mini Rev Med Chem(9)：1639-1647)。此外，壳聚糖对多种病原微生物具有抗微生物活性(Felt，Carrel等人，2000，Chitosan as tear substitute：awetting agent endowed with antimicrobial efficacy，J Ocul Pharmacol Ther(16)：261-270；Dai，Tanaka等人，2011，Chitosan preparations for wounds and burns：antimicrobial and wound-healing effects，Expert Rev Anti Infect Ther(9)：857-879)。

聚合物的硫醇化已经被公开以进一步增加其粘膜粘附的性质。EP 1126881 B1公开了包含至少一个非末端硫醇基团的粘膜粘附聚合物。在WO 2008/077172中公开了用于制备用于组织增强的植入物的硫醇化多糖的用途，其中所述硫醇化聚合物的特征在于导致聚合物网络的稳定化的二硫键的形成。WO 2008/077172的优先权申请A 2136/2006公开了硫醇化聚合物的其它应用领域。

通过与带有硫醇基团的配体共价连接而进行的壳聚糖的改性(即硫醇化)已经公开。还已经公开的是硫醇化增加了壳聚糖的粘膜粘附的性质(Kast和Bernkop-Schnurch，2001，Thiolated polymers-thiomers：development and in vitro evaluation ofchitosan-thioglycolic acid conjugates，Biomaterials(22)：2345-2352；Bernkop-Schnurch，Hornof等人，2004，Thiolated chitosans，Eur J Pharm Biopharm(57)：9-17；Bernkop-Schnurch，2005，Thiomers：a new generation of mucoadhesive polymers，AdvDrug Deliv Rev(57)：1569-1582；Schmitz，Grabovac等人，2008，Synthesis andcharacterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate，Int J Pharm(347)：79-85)。还评估了一些硫醇化壳聚糖的抗微生物效果(WO2009132226A1；WO2009132227A1；WO2009132228A1；Geisberger，Gyenge等人，2013，Chitosan-thioglycolic acid as aversatile antimicrobial agent，Biomacromolecules(14)：1010-1017)。

N-乙酰半胱氨酸(NAC)是带有硫醇基团的氨基酸L-半胱氨酸的衍生物。NAC是具有抗氧化活性的还原剂。还以其通过减少粘蛋白二硫键来降低粘液粘度的能力而被熟知。由于这些粘液溶解性质，NAC广泛地用于降低具有过多粘液产生的支气管肺病中的粘液粘度。含有粘液溶解的和抗氧化试剂NAC的局部眼用制剂用于治疗角膜疾病，诸如睑板腺功能障碍和DES(Lemp，2008，Management of dry eye disease，Am J Manag Care(14)：S88-101；Akyol-Salman，Azizi等人，2010，Efficacy of topical N-acetylcysteine in thetreatment of meibomian gland dysfunction，J Ocul Pharmacol Ther(26)：329-333)。EP 0 551 848 B1公开了用于治疗DES的眼用药物组合物，其含有3％和5％(w/v)之间的浓度的NAC和聚乙烯醇。

已经公开的是，当与未硫醇化壳聚糖进行比较时，使用NAC的壳聚糖的硫醇化增加了在兔眼上的眼部停留时间(Dangl，Hornof等人，2009，In vivo Evaluation of OcularResidence Time of ¹²⁴I-labeled>

已经公开的是，N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖HCl在小鼠干眼模型中对小鼠眼睛的眼表具有一些有益效果(Hongyok，Chae等人，2009，Effect of chitosan-N-acetylcysteine conjugate in a mouse model of botulinum toxin B-induced dryeye,Arch Ophthalmol(127):525-532；Hornof，Goyal等人，2009，Thiolated Chitosan forthe Treatment of Dry Eye-Evaluation in Mice Using the Controlled-EnvironmentChamber Model，ARVO Meeting Abstracts(50)：3663)。

评估和讨论硫醇化聚合物的不同用途的其它公开如下列出：

Hornof等人,Mucoadhesive ocular insert based on thiolated poly(acrylicacid):development and in vivo evaluation in humans；Journal of ControlledRelease 89(2003)419-428；Hornof,M.,In vitro and in vivo evaluation of novelpolymeric excipients in the ophthalmic field,Thesis,University of Vienna,2003；Bernkop-Schnurch等人,Permeation enhancing polymers in oral delivery ofhydrophilic macromolecules:Thiomer/GSH systems,J.Contr.Release 93(2003)95-103；M.Hornof等人,In Vitro Evaluation of the Permeation Enhancing Effect ofPolycarbophil-Cystein Conjugates on the Cornea of Rabbits,J.Pharm.Sci.91(12)2002,2588-2592；和Clausen等人,The Role of Glutathione in the PermeationEnhancing Effect of Thiolated Polymers,Pharm.Res.19(5)2002,602-608；Yamashita等人,Synthesis and Evaluation of Thiol Polymers,J.Macromol.Sc.26(1989),9,1291-1304；Zheng等人,Disulfide Cross-Linked Hyaluronan Hydrogels,Biomacromolecules 3(6)2002,1304-1311；Wang等人,Chitosan-NAC Nanoparticles as aVehicle for Nasal Absorption Enhancement of Insulin,J.Biomed Mater Res PartB:Appl Biomater 88B:150-161,2009；WO 2008/094675 A2；US 5,412,076 A。

然而，到目前为止，满足长期稳定性、耐受性、安全性、治疗干眼综合征的有效性和提高的患者依从性的要求的包含硫醇化壳聚糖的制剂还没有被公开。作为干眼治疗的当前疗法的无效和不方便的结果，仍然需要一种满足上述要求的治疗干眼综合征的方法。

发明内容

本发明涉及一种含有硫醇化壳聚糖的水性眼用溶液。特别是，本发明涉及无菌水性眼用溶液，其包含在载体溶液中的约0.05％至约0.5％(w/w)的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖(N-(N-acetylcysteinyl-)chitosan)或其药学上可接受的盐，其中N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖的游离硫醇基团的含量为约80μmol/g聚合物至约280μmol/g聚合物。

此外，本发明还涉及包含所述水性眼用溶液的容器。

本发明还涉及所述眼用溶液在预防或治疗干眼综合征或干眼体症和/或干眼症状中的特定用途。因此，本发明还涉及治疗需要该治疗的受试者中的所述疾病和症状的方法。该方法包含首先确定经受干眼综合征或干眼症状的受试者，然后向受试者施用有效量的含有N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖或其药学上可接受的盐的水性眼用溶液的步骤。

特别地，本发明适用于治疗由下述中的一种或多种所引起的或是与下述中一种或多种相关的干眼体征和/或症状：干燥性角膜结膜炎(KCS)、年龄相关性干眼症、史蒂文斯-约翰逊综合征、舍格伦综合征、眼瘢痕性类天疱疮、角膜损伤、感染、赖利-戴综合征、先天性无泪、PRK、LASEK和/或LASIK治疗、过敏性结膜炎、睑炎和睑板腺功能障碍、营养失调或缺乏(包括维生素缺乏)、药理学副作用、腺和组织破坏、自身免疫和其它免疫缺陷病症和昏迷病人的眨眼无能。还包括由环境暴露于大气颗粒物、烟、烟雾和过度干燥的空气引起的症状；和由隐形眼镜不耐受和由计算机工作或计算机游戏引起的眼压引起的症状。

附图说明

图1显示了如在示例3中所描述的采用不同包装在25℃和40％的相对湿度下长期储存期间含有0.1％(w/w)N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖HCl的水性眼用溶液中的游离硫醇基团的稳定性的比较。灰色柱描绘在组1(具有氧气吸收剂的包装和储存)中的储存期间不同时间点(起始点、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月)处的硫醇基团含量，白色柱描述组2(没有氧气吸收剂的包装和储存)中的硫醇基稳定性。

图2显示了如在示例4中所描述的在环境空气、湿度和温度条件下的单剂量单元的30天的短期储存期间的含有0.1％(w/w)N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖HCl的水性眼用溶液中的游离硫醇基团的稳定性。

图3显示N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖HCl下部结构的示意图。

图4显示了如示例6所述的进行合成的和如示例7所述的进行分析的聚合物1和聚合物6的硫醇基团测量结果(没有TCEP：灰色条带，用TCEP还原后：白色条带；具有标准偏差的3次测量的平均值)。

图5显示了如示例6所述的进行合成的和如示例7所述的进行分析的聚合物1和聚合物6的0.5(w/w)溶液的动态粘度的测定结果(没有TCEP：灰色条带，用TCEP还原后：白色条带)。

图6、7和8显示了N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖HCl-粘蛋白网络的线性粘弹性范围的测定。

图9显示了从分别以¹²⁴I-壳聚糖-NAC、¹²⁴I-壳聚糖HCl和Na¹²⁴I处理的眼睛的单独时间-放射性浓度曲线中得到的曲线值(0-96h)下的计算面积。

图10显示了从以¹²⁴I-壳聚糖-NAC和¹²⁴I-标记的硫醇化透明质酸(HA-半胱氨)处理的眼睛的单独时间-放射性浓度曲线(％AD*h/g)中计算的曲线下面积(AUC)值(0-72h)。

具体实施方式

发明人意外地发现了一种稳定的眼用溶液，其可有效地治疗干眼综合征或改善经受干眼综合征的病人的一个或多个干眼症体征和/或症状和/或提高具有干眼病的病人的泪膜的质量。本发明的无菌水性眼用溶液含有在载体溶液中的约0.05％至约0.5％(w/w)的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖或其药学上可接受的盐，其中所述N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖的游离硫醇基团的含量为约80μmol/g聚合物至约280μmol/g聚合物。优选地，采用盐酸盐作为药学上可接受的盐。

在下文中，术语“壳聚糖-NAC”代表N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖和其药学上可接受的盐。

本发明的方法是基于干眼病的当前最常用的治疗方法-人工泪液(即，盐水溶液或含有聚合物的溶液)和消炎药(环孢霉素)的改善。

本发明是适于治疗任何干眼综合征。广泛地说，属于本发明的干眼综合征或干眼病可以是与泪膜不稳定性和/或功能障碍(诸如增加的泪液蒸发和/或降低的水分分泌)相关的任意的综合征。

特别是，本发明适于治疗由下述中的一种或多种所引起的或是与下述中一种或多种相关的干眼病：干燥性角膜结膜炎、年龄相关性干眼症、史蒂文斯-约翰逊综合征、舍格伦综合征、眼瘢痕性类天疱疮、角膜损伤、感染、赖利-戴综合征、先天性无泪、PRK、LASEK和/或LASIK治疗、过敏性结膜炎、睑炎和睑板腺功能障碍、营养失调或缺乏(包括维生素缺乏)、药理学副作用、腺和组织破坏、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病和昏迷病人的眨眼无能。还包括由环境暴露于大气颗粒物、烟、烟雾和过度干燥的空气引起的干眼症状；和由隐形眼镜不耐受和由计算机工作或计算机游戏引起的眼压引起的干眼症状。

如在背景技术所表明的，还有其它与干眼病具有高共病程度的疾病：过敏性结膜炎(季节性和慢性)，睑炎和睑板腺功能障碍。这些情况会影响泪膜的质量和稳定性，导致干眼体征和症状。

诸如光折射角膜磨镶术(PRK)、准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK)和准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)的激光辅助的视力矫正术也负面影响了泪膜功能并且经常引起(暂时)干眼病。

本治疗方法包括以下步骤：(i)确定经受干眼病的受试者；和(ii)向受试者的眼睛施用包含含有壳聚糖-NAC的水性眼用溶液的水性眼用溶液；其中所述干眼病是由上面提到的疾病、综合征和压力因素中的一种或多种引起的或与上面提到的疾病、综合征和压力因素中的一种或多种相关。

本发明的制剂的一个显著优点在于，在受试者的眼睛上的单次滴注后，壳聚糖-NAC具有长达24小时的对泪膜厚度的恢复作用。这意味着，受试者不需要像诸如当采用人工泪液时的泪液替代疗法一样，不断地将该产品滴注到眼睛中。日局部用量的水性眼用壳聚糖-NAC溶液(对减缓干眼症状和/或改善泪膜组合物有效的)可分成一次或多次单元剂量给药。受试者将根据需要使用产品，而一般不超过一天两次，在很多情况下，该产品将以一天一次进行使用。对于本发明的壳聚糖-NAC溶液的优选的摄入为一天一次每只眼睛一滴0.1％(w/w)溶液。因此，本发明的制剂的显著优点为其是一天一次的产品并能够保证较好的患者依从性。

通过本发明的方法治疗后，受试者中的一种或多种干眼体征和/或症状被减少或减轻。干眼症状包括干燥、烧灼感、眼痒、眼部不适、畏光、异物感、视力模糊、沙砾感和视觉干扰和/或损失，包括视力模糊、降低的阅读速度、畏光和视敏度的损失。干眼体征由以下测量进行评定：角膜和/或结膜染色(使用荧光素、丽丝胺绿或玫瑰红染色剂)、施墨试纸条检测、区域-快速线程、泪膜摩尔渗透压浓度、泪液破裂时间和泪河高度。

DES的体征和/或症状使用本发明的制剂进行改善的一个原因可能是制剂对眼部泪膜厚度的恢复作用，这可以是通过硫醇化壳聚糖与眼表粘蛋白的化学相互作用，或通过眼表上的在应用于眼表后由壳聚糖-NAC的交联形成的保护性涂层的存在，或两种作用的结合而引起的。

施用于受试者的含有壳聚糖-NAC聚合物的水性眼用溶液的“有效量”为有效减少干眼病的临床体征和/或症状的量。该量包含在载体溶液中的约0.05％至约0.5％(w/w)的壳聚糖-NAC聚合物。

低于0.05％的量的壳聚糖-NAC处在这样低的浓度下以至于在患者身上看不到临床效果。超过0.5％很多时，患者耐受性开始受损并且壳聚糖的任意渗透增强效果更加明显。水性眼用溶液中的壳聚糖-NAC的浓度优选为0.05至0.3％(w/w)，更优选为0.05至0.2％(w/w)，最优选为0.08至0.16(w/w)。在远低于0.05％的浓度下，粘膜粘附特性和由此的临床效果并不那么明显。在远超过0.3％浓度下，眼部应用后的壳聚糖-NAC制剂的高粘度导致了“团块”的形成，并且溶液在眼表上不是均匀铺展的。在0.05％至0.3％的浓度范围内的壳聚糖-NAC的溶液在眼表面上均匀地分布，如在体内的碘-¹²⁴放射性标记的壳聚糖-NAC的研究所证明的(参见示例9和10)。水性眼用溶液中的壳聚糖-NAC的浓度最优选为约0.1％，因为临床效果和患者耐受性均是最优的。

存在于水性眼用溶液中的结合于壳聚糖-NAC的硫醇基团的很大比例需要处于游离硫醇基团的形式，即，如下面所定义的非交联的硫醇。重要的是，这些硫醇基团的大部分仍保持游离，以便仅在用于眼表时发生反应。在某些情况下，游离的硫醇基团的量可能是相当低的，但在进行滴注时仍可对眼睛提供一些药物益处。然而，优选的是，本发明的制剂中的壳聚糖-NAC聚合物的游离硫醇基团的含量为约80μmol/g聚合物至280μmol/g聚合物；优选地为约105μmol/g聚合物至250μmol/g聚合物、更优选为110μmol/g聚合物至250μmol/g聚合物、最优选为140μmol/g聚合物至250μmol/g聚合物的游离硫醇基团范围。

在远低于80μmol/g聚合物的游离硫醇基团浓度下，壳聚糖-NAC和粘蛋白之间的相互作用微弱并且相当于未改性的壳聚糖HCl，然而，在300μmol/g聚合物以上的游离硫醇基团的非常高的浓度下，核心聚合物壳聚糖的物理化学性质这样大的程度上被改变：聚合物因为其在水中降低的阳离子特性和受限的溶解度而无法用于制备水性眼用溶液。

这一在壳聚糖-NAC上固定的游离硫醇基团的量在本发明的眼用制剂准备在干眼患者的眼睛中使用时需要存在。这意味着，在本发明的水性眼用溶液中存在的游离硫醇基团必须可相对长时间储存。因此，最终的干眼产品必须是稳定的并保留上述游离的硫醇基团至少约12个月，更优选为至少约18个月，甚至更优选为至少约24个月。

水性眼用溶液中的在壳聚糖-NAC上固定的游离硫醇基团的量可以以已知的方式由本领域技术人员测定，诸如通过Ellman试剂(见示例1)。

在水性眼用溶液中的壳聚糖-NAC聚合物上的大量游离硫醇基团是很重要的，除这一事实外，在本发明的溶液中的壳聚糖-NAC聚合物上少量的交联硫醇(二硫化物)也是优选的。在准备和储存水性眼用溶液期间，可能发生在壳聚糖-NAC上固定的硫醇基团的交联。在制剂中存在的交联硫醇的低量是本发明的壳聚糖-NAC聚合物制剂的优选的参数。

因此，根据本发明的优选实施例，N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖中的交联硫醇基团的量为其中总硫醇基团的30％以下，优选为25％以下，最优选为15％以下。

尤其是，在该优选的实施例中，在室温下储存至少12个月后，所述N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖中的交联硫醇基团的量为其中总硫醇基团的30％以下，优选为25％以下，最优选为20％以下。

如果在配方中存在的交联硫醇基团的量太高，水性眼用溶液的性质可在所需的参数的范围外改变，例如，该水性眼用溶液的粘度可能变得过高而不适合用于滴眼液。

如以下更详细的说明，已经发现制备一种壳聚糖-NAC是可能的，其硫醇基团没有或仅最低限度进行交联，并具有总硫醇基团的小于5％、优选为4％以下的交联硫醇基的量。特别是如果该壳聚糖-NAC用于制造本发明的眼用溶液，游离硫醇基团在溶液中的整个寿命周期中是趋向于稳定的：

因此，已经发现在制剂的制备期间采用该壳聚糖-NAC时，交联硫醇基团的增加为<10％的初始存在于壳聚糖-NAC原料上的游离硫醇基团的量。此外，溶液的储存超过12个月或甚至18个月的期间，交联硫醇基团的增加为<15％的初始存在于制剂中的游离硫醇基团的量。最后，即使提供氧阻隔的溶液的第二容器(如下面所定义的)被打开，在打开30天后，交联硫醇基团的增加为<15％的打开前初始存在于制剂中的游离硫醇基团的量。

基本上，本发明的硫醇化壳聚糖眼用制剂是根据以下步骤制备的：

1、甲壳素是从诸如虾或雪蟹壳的硬皮外壳中分离的，

2、壳聚糖通过本领域熟知的化学方法(例如碱性脱乙酰作用)由甲壳素制备；

3、通过带有硫醇的配体的共价连接，诸如使用本文所述的N-乙酰半胱氨酸，使壳聚糖硫醇化；

4、然后将壳聚糖-NAC配制成如本文所述的水性眼用溶液的形式；和

5、然后将含有壳聚糖-NAC的水性眼用溶液放入合适的容器中，该容器将确保其如本文所述的稳定性。

如本文详细描述的，化学地，壳聚糖是具有有利的生物学性质(诸如高生物相容性和低毒性)的聚阳离子生物聚合物。制备用于本发明制剂的壳聚糖的原料的来源并不是关键的，只要所得壳聚糖相当纯净且不含污染物即可。例如，壳聚糖也可由非动物来源进行制备。本发明的壳聚糖可以通过各种方法进行加工，只要壳聚糖具有本说明书中所要求和阐述的性质即可。最常见的是，壳聚糖的原料来自甲壳类的壳中的甲壳素。甲壳素可以在收获硬皮外壳食物来源(诸如龙虾、螃蟹和虾)期间获得。在根据本发明的制剂中加工和使用的壳聚糖的甲壳素的一种优选的原料来源是来自雪蟹(Chionoecetes opilio)壳。只要供应足够，各种甲壳类来源都可以用于获得甲壳素以制备壳聚糖。由原料生物来源制备壳聚糖是众所周知的且公开于很多科学出版物(例如Chang，Tsai等人，1997，Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution，Carbohydr Res(303)：327-332；Dutta，Dutta等人，2004，Chitin and chitosan：Chemistry，properties andapplications，J Sci Ind Res(63)：20-31)中。

壳聚糖-NAC可以通过壳聚糖与带有硫醇基团的配体反应来合成。用于硫醇化的方法在许多科学出版物(例如Seki,Aoi等人,1999,Partially deacetylated chitin orchitosan derivative with selectively substituted free amino group by aminoacid and peptide and having substantially no substituted hydroxide group,andits manufacture,JP2000-302803；Bernkop-Schnurch,Hornof等人,2004,Thiolatedchitosans,Eur J Pharm Biopharm(57):9-17；Schmitz,Grabovac等人,2008,Synthesisand characterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate,Int J Pharm(347):79-85；Zhu,Su等人,2012,Synthesis of thiolated chitosan and preparationnanoparticles with sodium alginate for ocular drug delivery,Mol Vis(18):1973-1982)中公开过。

本发明中使用的壳聚糖-NAC在用于制备眼用水溶液的浓度范围内需是水溶性的，并且所得溶液需要是澄清和无色的。具有有机或无机酸的壳聚糖-NAC的盐形成增加壳聚糖的水溶解度。本发明的硫醇化壳聚糖的合适盐包括诸如乙酸、柠檬酸、甲酸和酒石酸的有机酸和诸如HCl和H₂SO₄的无机酸的任何药学上可接受的盐。壳聚糖-NAC盐酸盐是本发明的优选实施例。

重要的是，采用这样的反应途径和反应条件，使得在合成和纯化后，在壳聚糖骨架上固定的基本上所有的硫醇基团为游离形式而不是如二硫化物的交联形式存在，即仅最低程度地交联。事实上，本发明的硫醇化壳聚糖中的所有连接的硫醇都为游离硫醇的形式，即它们不是交联的。在合成期间最小量的交联只在硫醇化壳聚糖的粘度保持在所述参数内并且其水溶性足以制备水性眼用溶液时是可接受的。

已经发现，通过在合成之后(例如在硫代乙酰基部分的碱性水解之后)将壳聚糖-NAC暴露于还原剂，可以制造具有非常低或甚至零度交联的硫醇基团的壳聚糖-NAC。还原剂可以选自DTT，TCEP或NaBH₄的组，优选为NaBH₄。此外，已经发现，还原步骤应该在升高的温度下进行，诸如30℃以上，或优选为40℃以上。此外，需要使用大量还原剂，诸如还原剂与壳聚糖主链聚合物的化学计量比为2:1或更高。

根据该实施例，可以合成具有小于5％、优选为4％以下的交联硫醇基团的程度的壳聚糖-NAC聚合物。

本发明的最终壳聚糖-NAC的水溶液中的粘度优选地落入一定范围内，本发明人意外地发现，如果在制备壳聚糖-NAC期间，壳聚糖-NAC在一定条件下并且在一定参数内进行处理，特别是根据上述还原条件(导致聚合物仅进行最低程度的交联)时，壳聚糖-NAC的粘度仅落入该优选范围内。所得产物的粘度优选地落入可接受的范围内，使得壳聚糖-NAC将在最终得到的滴眼液制剂中最有用。因此，壳聚糖-NAC聚合物的运动粘度(在25℃的水中的0.5％)优选在约1至15mm²/s的范围内，更优选在约2至10mm²/s的范围内。如果粘度太高，则有用的滴眼溶液无法制备为具有在制剂中的壳聚糖-NAC的优选浓度范围，因为聚合物将在容器中保持为不溶性粘性物质。

壳聚糖-NAC需要进行纯化以用于本发明的制剂中(诸如在上述步骤#3之后，特别是在用还原剂处理壳聚糖-NAC之后)。壳聚糖-NAC应以使所得产物是纯净的方式进行洗涤。一种已知的方法公开在Kast和Bernkop-Schnurch，2001，Thiolated polymers-thiomers：development and in vitro evaluation of chitosan-thioglycolic acid conjugates，Biomaterials(22)：2345-2352中。

另一种方法是用极性溶剂对壳聚糖-NAC进行洗涤，随后进行干燥以除去溶剂。一种优选的溶剂为异丙醇，因为其是无毒的、容易获得的、经济的，然而其它溶剂，和除异丙醇之外的其它醇也可以起作用。这种洗涤可以根据需要进行重复，这取决于每次使用的溶剂体积。优选地，洗涤和干燥步骤重复至少一次。

干燥步骤可以在室温和标准湿度下进行，但是该方法可能非常耗时。因此，干燥方法优选在高温和/或减压下进行。壳聚糖-NAC的干燥优选在至少约40℃至约70℃的经升高的温度下进行，并且优选地进行至少约5小时。更优选的干燥方法在至少约50℃至约60℃的温度下进行约10至24小时。一种优选的多步纯化方法为采用异丙醇对壳聚糖-NAC聚合物洗涤三次，并通过离心回收固体，随后在约60℃下干燥约15至20小时。

根据本发明的水性眼用溶液可以含有至少一种眼用相容赋形剂。可以使用任何适用于例如调节张力、溶液的粘度，或稳定pH、增加活性成分的溶解度、在施用后增加眼部舒适性，或一般性稳定制剂的赋形剂。

水性眼用溶液的pH通过添加任何生理和眼睛上可接受的pH调节酸、碱或缓冲液来进行调节，以具有在约5.5至约7的范围内的pH。远低于约5.5的pH在生理学可接受的参数(该溶液会在眼睛中引起严重的刺痛或烧灼感觉)之外。在pH远高于7时，形成壳聚糖-NAC的稳定溶液(壳聚糖-NAC不能从溶液中沉淀出来)是困难的。因此，由于容易配制稳定的溶液，低于7的pH是优选的。本发明的水性眼用溶液的优选的pH为约5.8至约6.8之间，最优选pH为6.0至6.6。

在本发明的制剂中所采用的合适的酸的示例包括乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的示例包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠、氨丁三醇、THAM(三羟甲基氨基-甲烷)等。本发明的优选实施例是硼酸和硼酸钠缓冲体系，其还含有诸如甘露醇的多元醇，以在最优选的6.0至6.6的pH范围内增加缓冲能力。

为增加制剂稳定性在本发明的制剂中所采用的合适赋形剂的示例包括乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)、焦亚硫酸钠、甘露醇、聚乙二醇等。

本发明的局部眼用制剂的重量克分子渗透浓度一般为约150至约400毫渗量(mOsM)，更优选为约200到约350mOsM，最优选重量克分子渗透浓度为约250至约330mOsM。重量克分子渗透浓度可以通过适量的生理和眼睛可接受的离子型或非离子型试剂进行调整。氯化钠是一种常见的渗透剂。等量的一种或多种的盐由诸如钾、铵等的阳离子和诸如氯化物、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、硼酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、硫代硫酸盐、硫酸氢盐等的阴离子组成，可用于补充或代替氯化钠以获得上述范围内的重量克分子渗透浓度。此外，非离子试剂，诸如甘露醇、右旋糖、山梨醇、甘油、葡萄糖等也可用于调节重量克分子渗透浓度。氯化钠和甘露醇是调节渗透压的优选试剂。

眼用制剂可以包含润滑剂，以提供适用于在治疗DES中必要的常规应用的高眼舒适水平。有许多类型的润滑剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、液体多元醇、透明质酸和其药学上可接受的盐、润滑素和纤维素衍生物；然而，优选试剂为聚乙二醇和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

在优选实施例中，根据本发明的眼用溶液除N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐之外还包含以下赋形剂：

1.0至16.0mg/ml、优选为8至16mg/ml的量的硼酸；

0.01至5.0mg/ml、优选为1至5mg/ml的量的聚乙二醇400；

0.01至0.5mg/ml的量的Na₂-EDTA；

0.01至5.5mg/ml、优选为0.1至4mg/ml的量的甘露醇；

0.01至9mg/ml、优选为1至3mg/ml的量的氯化钠；和

0.01至20mg/ml、优选为1至3mg/ml的量的羟丙基甲基纤维素。

根据本发明的眼用溶液必须是无菌的，并且可以以任何适合的方式进行灭菌。一种特别优选的灭菌方法为无菌过滤。根据本发明的眼用溶液含有诸如苯扎氯铵的防腐剂，虽然这是不太优选的。

含有壳聚糖-NAC的水性眼用溶液可以以任何用于局部给药的适合的方式给药至患者的眼睛。优选地以水性滴眼液的形式。这种溶液可处在打开前是无菌的单次使用的容器中，因此不需要防腐剂，或者该溶液可以在打开后保持无菌的多次使用的容器的形式中，或在具有含有防腐剂的制剂的多次使用的容器中。

壳聚糖-NAC聚合物的硫醇基团倾向于在水溶液中形成二硫键，从而降低壳聚糖-NAC的粘膜粘附的性能。已经发现的是，这种趋势取决于在水性眼用溶液中的氧的存在。

人们已经发现，可能的是，当在无氧条件下、或基本上无氧的条件下储存溶液时，在水溶液中根据本发明所采用的壳聚糖-NAC的游离的硫醇基团甚至更稳定。无氧气氛可以为氮气气氛、真空气氛、或由惰性气体组成的气氛。

因此，当溶液被放入到容器中时，它应该在没有氧气的情况下进行。此外，当容器以本发明的水性眼用溶液填充后，它应该保持无氧。因此，本发明还涉及保持水性眼用溶液在储存过程中不含氧的容器。因此，本发明的一个方面包括基本上无氧容器，其含有水性眼用溶液。“基本上无氧”，理解为具有1.5％以下的氧气的气氛。在制备溶剂和填充到容器期间，溶液中的溶解氧的浓度低于1mg/L，更优选为低于0.5mg/L，甚至更优选在0.1mg/L的范围内。

在优选的实施例中，该容器是由氧无法渗透的材料制成的，由此在填充之后，眼用溶液在一段经延长的时间内基本上可保持无氧。该容器可以是玻璃或玻璃内衬的聚合物、金属或金属内衬的聚合物。在另一个优选实施例中，容器是由含有可以防止氧气通过容器壁进入溶液的氧气吸收剂的聚合物制成的。这种氧气吸收剂包括铁盐、亚硫酸盐、抗坏血酸、不饱和脂肪酸盐、金属聚酰胺复合物或钯/H₂基体系。例如，WO>

此外，容器本身可以由具有被嵌入的氧清除剂和无气闭合体系的气密性材料制得。

在优选实施例中，提供有含有眼用溶液的第一容器和含有所述第一容器的第二容器。

因此，例如，装有本发明的眼用溶液的容器本身是包含在密封囊或袋中的。特别是由铝或铝层板或铝组合物制成的囊或袋可在其中包含一个或多个含有本发明的眼用溶液的子容器(即“第一容器”)。第二容器，即囊或袋也可以含有如在一些标准包装中采用的另外的氧气吸收剂(例如PKH-20或氧清除剂)。即使在囊是在真空中或在惰性气氛中密封的情况下，也需要加入氧气吸收剂，以从子容器中去除残留的氧气。囊可以含有一个或多个单剂量容器或多剂量容器，例如每个囊五个单剂量容器。在多剂量容器的情况下，其必须将根据本发明的眼用溶液保持在无菌条件下和基本上无氧条件下。

在根据本发明的容器中所含有的壳聚糖-NAC室温下储存至少12个月后优选地具有约80μmol/g聚合物至250μmol/g聚合物、优选为105μmol/g聚合物至约250μmol/g聚合物的游离硫醇基团的含量。这意味着，根据本发明，游离硫醇基团保持在壳聚糖-NAC上，并且所得制剂在经延长的一段时间内是稳定的。这一段时间优选为至少约12个月，更优选为至少18个月，和甚至更优选为至少24个月。这种长期的稳定性倾向是由于一些产品最终具有在商业配送和供应链上的长存储时间和延迟的事实，这可能会导致失去可接受的参数的不太稳定的产品。

此外，在室温下储存至少12个月、更优选为至少18个月之后，在根据本发明的容器中含有的壳聚糖-NAC中的交联硫醇基团的量优选地为其中总硫醇基团的30％以下，优选为25％以下，最优选为20％以下。正如上面提到的，如果采用具有仅最小程度交联的硫醇基团的壳聚糖-NAC用于制造溶液，那么溶液中的游离硫醇基团的稳定性会是特别好的。

在上述实施例中，还有第二容器(例如气密性囊)，其含有一个或多个第一容器(例如由LDPE制得的单次使用容器)，在将第一容器打开至少30天后，溶液中的游离硫醇基团的含量优选地保持在本发明所定义的范围内。例如，5个容器所需的治疗时间为5天，因此，这一期间内的稳定性是足足有余的。

正如上面提到的，已经发现，特别是如果采用具有仅最小程度交联的硫醇基团的壳聚糖-NAC用于制造本发明的眼用溶液，那么游离硫醇基团甚至在提供氧阻隔的第二容器被打开后仍保持稳定，即已经发现，在第二容器打开30天后，交联硫醇基团的增加为<15％的打开前初始存在于溶液中的硫醇基团的量。

本发明主要涉及与人类受试者的治疗，但也可出于兽医目的，用于治疗其他哺乳动物受试者，诸如狗和猫。

本发明进一步通过以下示例进行说明，不应被解释为将本发明限制为本文所述的具体过程。

示例

示例1：硫醇基团含量的测定

硫醇基团的量化是基于采用5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸，DTNB，“Ellman试剂”)的湿化学法。游离硫醇基团在混合的二硫化物的形成下与该试剂进行反应，而一当量的2-硝基-5-硫代苯甲酸被释放。在缓冲的碱性介质(pH＝8.05)中，最终获得的硫醇盐为明显的黄色着色的溶液，其吸收可在450nm处进行光度测量。

在1.5ml Eppendorf容器中称取119.0至121.0mg的含有0.1％N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐的样品。每个溶液测定三个值。25.0mg N-乙酰半胱氨酸进行准确称重并溶解在25.0ml的硼酸盐缓冲液(pH 6.75)中。然后将该溶液进一步稀释用于校准曲线。硼酸盐缓冲液用于空白值。pH为8.0的磷酸盐缓冲液加入各个溶液中直到600μl的最终体积。600μl新鲜制备的Ellman溶液(在100ml磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中含有20mg的5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸))被添加到各个溶液(标准溶液、样品溶液和空白值)中。溶液充分混合，并在UV保护下培养1.5小时。之后，含有N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐的样品溶液在13400rpm下离心5分钟。最后，1.1ml的各溶液(标准溶液、样品溶液和空白值)被转移到半微量比色皿中，并在分光光度计中相对空白值的450nm处进行测试。

样品溶液中的硫醇化壳聚糖的游离硫醇基团的平均含量被测定为2.61％(w/v)，对应于178.5μM的游离硫醇基团/g聚合物的值。

示例2：制剂组成：

下面的水性眼用溶液采用具有158μM/g聚合物的游离硫醇基团的含量和5.63mm²/s的运动粘度(25℃，0.5％水溶液)的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐进行制备。所有其它成分为药物添加剂。该溶液通过无菌过滤进行灭菌。

滴眼制剂具有以下组成：

化合物量[mg]N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐1.0硼酸12.4聚乙二醇400(PEG 400)3.0Na₂-EDTA0.42甘露醇2.0NaCl2.0HPMC1.5NaOH足量重蒸馏水加至足量1ml

表1水性眼用溶液的组成

制剂的物理-化学性能在下面说明范围内：

pH值6.0–6.6重量克分子渗透浓度[mOsmol/kg]250–330游离硫醇基团的含量[μMol/g聚合物]140-250硫醇化壳聚糖的含量[mg/ml]0.90–1.10无菌性无菌的

表2水性眼用溶液的物理-化学性质

该示例表明，壳聚糖-NAC可以根据本发明进行配制以满足用于眼用制剂的要求。

示例3：水性眼用溶液的长期稳定性：

组1：含1mg的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐/ml的根据本发明的制剂在惰性条件进行制备，并随后采用吹填密封技术无菌地填充到五个LDPE(低密度聚乙烯)制成的0.3ml的体积的单剂量容器的卡中。各个卡包装在含有氧气吸收剂(PKT KH-20)的铝囊中。

组2：含1mg的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐/ml的根据本发明的制剂进行制备，填充至五个单剂量容器的卡中，并包装在如上所述的铝囊中，但在这一组中，铝囊不含有氧气吸收剂。

在组1和组2的制备条件下制备的制剂样品在25℃温度和40％相对湿度的可控条件下储存18个月。游离的硫醇基团的含量如在正常时间间隔的示例1中所描述的进行测量。同时袋内的氧气浓度用氧气分析仪(PBI Dansensor CheckPoint II)进行测量。硫醇基团测量的结果如图1所示(组1：灰条，组2：白条)。结果表明，当含有壳聚糖-NAC聚合物的本发明的水性眼用制剂是存储在小于1.5％的最大氧气水平(由氧气吸收剂提供)的基本上不含氧的气氛中时，在至少18个月的一段时间内，在可接受的参数内，游离硫醇含量仍然很高。令人惊讶的是，即使没有氧气吸收剂进行储存时，溶液的硫醇基团含量仍在约为1个月的时间周期内保持稳定。4个月后，硫醇基团的含量仍然保持在可接受的参数内，但观察到减少了20％的硫醇基团含量。在18个月的整体储存期中，组2的袋中的氧气水平在3.0至5.7％的范围内。

示例4：从铝袋中去除单剂量容器后的水性眼用溶液的短期稳定性

含1mg的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐/ml的根据本发明的制剂在惰性条件下进行制备，并随后采用吹填密封技术无菌地填充到五个LDPE(低密度聚乙烯)制成的0.3ml的体积的单剂量容器的卡中。各个卡包装在含有氧气吸收剂(PKT KH-20)的铝囊中。在制备后的一个月内，卡从袋中除去并储存在环境空气、湿度和温度条件下的封闭折叠盒中30天。制剂中的游离硫醇基团的含量在第0天、第5天、第12天、第19天和第30天测量。

结果如图2所示(具有标准偏差的3个批次的平均值)。这些结果表明当产品在环境空气的条件下在氧气存在的LDPE单剂量单元中储存时，产品在30天的时间段内仍保持在所需的参数范围内。30天后游离硫醇基团减少约为10％。类似的结果甚至在含有卡的铝囊在除去卡之前在40℃温度下存储5个月时被观察到。

示例5：合成N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐

具有不同程度的硫醇化的N-(N-乙酰半胱氨酸-)壳聚糖盐酸盐聚合物(图3)由N,S-二乙酰半胱氨酸通过亲核取代共价连接至壳聚糖的伯胺，然后在碱性介质中释放游离的硫醇基团来进行合成。采用不同的壳聚糖作为用于合成的原料(见表3)。在脱乙酰的来源和程度的数据由供应商来提供。采用Malvern Instruments的Viscotek TDA305通过与尺寸排阻色谱法(SEC)结合的三重检测测定分子量。样品溶解在乙酸5％中并在粘性凝胶柱上无梯度地分离。

表3壳聚糖原料说明列表

最终获得的硫醇化程度依赖于壳聚糖与N’S-二乙酰半胱氨酸的活性酯的重量比和反应条件(在亲核取代反应期间的pH值和温度)。合成了具有在40μM/g聚合物至400μM/g聚合物的范围内的硫醇化程度的壳聚糖-NAC聚合物。

对于表4中列出的5个不同批次的壳聚糖-NAC聚合物的合成，采用了以下反应条件：采用具有100kDa至250kDa的分子量的壳聚糖(供应商HMC+)作为起始原料。壳聚糖与N’S-二乙酰半胱氨酸的活性酯的重量比为1:1(重量％)、壳聚糖与还原剂硼氢化钠的重量比为1:2(重量％)。采用硼氢化钠的还原在约40℃的经升高的温度下进行。

分子量硫醇化程度145kDa220μM/g聚合物165kDa225μM/g聚合物200kDa210μM/g聚合物235kDa220μM/g聚合物200kDa220μM/g聚合物

表4壳聚糖-NAC聚合物在分子量和硫醇化程度方面的表征

在表4中列出的所有的壳聚糖-NAC聚合物都适用于依据水溶性、粘度和硫醇基团含量制备根据本发明的水性眼用溶液。

示例6：用于合成最低限度交联的壳聚糖-NAC的反应条件

N,S-二乙酰半胱氨酸与壳聚糖的伯胺的共价连接之后是在pH 8±0.2处的硫代乙酰部分的碱性水解。然后使用大量过量的硼氢化钠(壳聚糖：硼氢化钠＝1:2(重量％))在40℃的惰性条件下还原所得的分子内和分子间二硫键。随后，通过加入5N HCl来破坏过量的硼氢化钠，其同时在pH 1±0.1下产生壳聚糖-NAC盐酸盐。灰白色产物以2-丙醇进行沉淀，通过离心进行回收并根据限定的方法进行干燥。

如在许多实验所示，当二硫化物交联的壳聚糖-NAC聚合物形成水凝胶或变得不溶于水溶液体系时，经升高的温度和令人惊讶地大量还原剂对于定量和可再现的还原是必需的(参见表5)。

表5还原条件

潜在地利用聚合物1-5用于制备根据本发明的水性眼用溶液的唯一选择是在60℃下将这些二硫化物交联的衍生物热降解超过4天(取决于交联的程度和类型(分子内和分子间))，以满足0.5重量％水溶液的运动粘度的规格，该运动粘度优选在1至15mm²/s的范围内。此外，干燥过程非常耗时。相反，在优化的反应条件下合成的最低限度交联的编号6的壳聚糖-NAC聚合物在60℃下干燥时间小于20小时后落入粘度的优选范围内。

示例7：最低限度交联的壳聚糖-NAC的表征

对根据示例6的编号1和编号6的壳聚糖-NAC聚合物的在用三(2-羧乙基)膦(TCEP)对任意在最终聚合物中存在的二硫化物进行选择性和定量还原之前和之后的游离硫醇基团的相对含量、分子量和动态粘度进行表征。

相对硫醇基团含量的测定：将作为1.5％(w/w)的水溶液溶解的壳聚糖-NAC聚合物在室温下用/不用TCEP(3mg/ml)培养90分钟。用1N HCl酸化后，用2-丙醇对壳聚糖-NAC聚合物进行重复沉淀，并通过离心进行回收。将残余物溶于蒸馏水中，然后加入2,2’-二硫基联吡啶，在与游离硫醇部分的反应时产生稳定的硫酮。这种互变异构体物质可以通过343nm处的UV分析容易地进行定量。

动态粘度的测量：将作为0.5％(w/w)的水溶液溶解的壳聚糖-NAC聚合物在室温下用/不用TCEP(2mg/ml)培养90分钟。通过25℃下以5s^-1的恒定剪切速率通过旋转测量进行流变学表征。

分子量测量(SEC分析)：为了确定反应条件对壳聚糖主链的分子量的影响，通过采用合成如示例6中所述的聚合物6的相同反应条件(但不加入N’S-二乙酰半胱氨酸的活性酯)制备未改性的壳聚糖HCl盐。0.1％(w/w)浓度的溶解于5％乙酸的壳聚糖和壳聚糖-NAC聚合物在室温下用/不用TCEP(1mg/ml)培养90分钟。在0.7ml/min的流速下对分子量进行无梯度分离，并采用来自Malvern Instruments的Viscotek TDA305通过三重检测进行测定。

聚合物1和聚合物6的硫醇基团的测量结果显示在图4(没有TCEP：灰色条，用TCEP还原后：白色条；具有标准偏差的3次测量的平均值)。聚合物1和聚合物6的0.5％(w/w)溶液的动态粘度的测定结果分别显示在图5中(没有TCEP：灰色条，用TCEP还原后：白色条)。

这些结果表明，即使存在相对少量的二硫化物交联结构(在聚合物1的没有TCEP处理的情况下，9％的所有N-乙酰半胱氨酸基团固定在聚合物上)对水溶液中的壳聚糖-NAC聚合物的粘度有很大影响，而具有仅约3％的硫醇基团的最低限度交联的壳聚糖-NAC作为适于制备滴眼液的低粘度的水溶液溶解的二硫化物而存在。

此外，聚合物的流变性能和二硫化物交联的含量之间的相关性通过SEC分析被证实。最低限度交联的壳聚糖-NAC聚合物(聚合物6)在通过TCEP定量还原后显示出20-30％的分子量的轻微降低。在定量还原后，聚合物6的分子量与未改性的壳聚糖HCl的分子量相当。然而，部分交联(9％)的壳聚糖-NAC(聚合物1)的主要量表现出超过柱的排阻极限的分子量，甚至可分析的级分(约20％)会产生其初始重量的四倍的分子量。在用TCEP定量还原后，聚合物1的分子量与未改性的壳聚糖HCl的分子量在相同的范围内。如所预期的，未改性的壳聚糖HCl与TCEP的反应不导致任何分子量的降低。

示例8：粘膜粘附测试

具有不同程度的游离硫醇基团的壳聚糖-NAC聚合物的粘膜粘附的性质通过测量它们与分离的粘蛋白的相互作用来评价。壳聚糖-NAC聚合物如示例5所述的进行合成，并用于制备如示例2中所述的水性眼用制剂。采用未改性的壳聚糖HCl作为对照组。

含有壳聚糖-NAC或壳聚糖HCl的水性眼用制剂分别用分离的且氯化铯梯度纯化的猪胃粘蛋白的水溶液在32℃下培养30分钟。各样品中的聚合物的最终浓度为0.15％(w/w)。聚集体可过夜形成，并在第二天通过离心从溶液中除去。离心后，将聚集体重悬于蒸馏水中用于流变学测量。在10rad/s的角频率下以振荡振幅扫描测试(流变仪MCR 101，锥板测量系统)对所得悬浮液的稳定性进行评价，以确定线性粘弹性范围。

该实施例的结果表明，具有约80至250μM/g聚合物的范围内的硫醇化程度的壳聚糖-NAC聚合物与粘蛋白进行了强烈地相互作用，正如由宽的线性粘弹性区域和储能模量G’和损耗模量G”之间的大差异所证实的。在图8中显示了一个示例(游离硫醇基团的含量为80μmol/g的含量)。

上述效果取决于硫醇化的程度。未修饰的壳聚糖HCl和具有40μM硫醇基团/g聚合物的改性的程度的壳聚糖-NAC仅显示出与粘蛋白的弱相互作用，正如分别由不存在的和非常窄的线性粘弹性范围所证明的。结果示于图6(无硫醇化，未改性的壳聚糖HCl)，图7(游离硫醇基团的含量为40μmol/g)和图8中并描述在表6中。仅当硫醇化程度为约80μM/g聚合物时，壳聚糖-NAC开始表现出强的粘膜粘附性质，正如由与粘蛋白的强相互作用所证明的。

表6聚合物-粘蛋白相互作用强度的测定

示例9：在兔子中进行单眼滴注后测定含有0.1％放射性标记的壳聚糖-NAC的水性眼用溶液的眼部停留时间

该研究的目的在于获得在测试物质单独局部应用于进入到雌性新西兰白兔的眼睛中的生理缓冲液后的¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC在0.1％(w/w)的浓度下的药代动力学数据。在这项试验研究中，全部的四个测试动物在右眼接受了¹²⁴I-壳聚糖-NAC>124I-壳聚糖-HCl>124I-NaI。动态微PET测量(350–650keV的能量窗口，6ns的时间窗口)在将测试物质给药后进行1小时。此外，15min的静态扫描在测试物质给药后3、6和9小时处进行，30分钟的静态扫描在24小时处进行并且60分钟的静态扫描在48、72和96小时后进行。作为主要的结果参数的放射性浓度在应用位点处进行监测。将用于微PET影像的单元转换为绝对放射性浓度的校准因子最初通过测量充满已知的放射性浓度的Na¹²⁴I溶液的校准圆柱伪影生成。放射性测试物质的浓度采用图像分析软件AMIDE2对各个图像进行定量。感兴趣椭圆形区域(ROI)在矢状传输图像上位于眼睛的边缘，因此位于泪阜(眼内角)的具有高活性吸收的区域从ROI排除。从限定的ROI中计算作为由ROI限定的组织中的时间函数的时间-放射性浓度曲线(TAC)(是指放射性浓度(μCi/g))。每克组织中的应用剂量百分比(％AD/g)计算为平均组织浓度(μCi/g)除以在实验开始全部应用的放射性(μCi)。采用PRISM5软件(GraphPad>

作为额外的质量控制参数，在¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC溶液中的硫醇基团含量在给药前进行测量。

结果显示在图9中。Na¹²⁴I迅速从眼部清除，且在应用6小时后难以检测到。0.1％(w/w)¹²⁴I壳聚糖-NAC溶液的单一给药导致了与¹²⁴I-壳聚糖-HCl相比的给药眼睛上的活性浓度的增加，说明了粘膜粘附性能的提高。在给药24小时后，在用0.1％¹²⁴I壳聚糖-NAC治疗的眼睛中的活性浓度与¹²⁴I-壳聚糖-HCl眼睛相比几乎高了2.2倍(分别为2.16±0.36对1.21±0.26％AD/g)。该差值在下一个观察期内保持，使得给药48小时后发现2.35±0.15％AD/g(¹²⁴I壳聚糖-NAC)对1.06±0.30％AD/g(¹²⁴I-壳聚糖-HCl)。然后用于两种经应用的测试物质的活性浓度均减少，并在给药96小时后几乎相当。

用于该研究的¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC溶液(在不同的2天内制备的两种溶液)的硫醇基团含量的测定分别显示为约110μM和130μM的硫醇基团/g聚合物，所述硫醇基团仍保持为游离的(即在用Bolton-Hunter试剂放射性标记之后的未氧化的形式)。

示例10：含有0.1％的放射性标记的壳聚糖-NAC或0.1％放射性标记的HA-半胱胺的水性用用溶液在兔的单一眼部滴注后的眼部停留时间的比较

除了上述研究，在将生理缓冲液中的0.1％(w/w)浓度的测试物质局部应用于雌性新西兰白兔的眼睛之后，获得了用于¹²⁴I-标记的壳聚糖-NAC和¹²⁴I-标记的硫醇化透明质酸(HA-半胱胺)的药代动力学数据。在这项研究中，受试者在右眼接受0.1％(w/w)¹²⁴I-HA-半胱胺(n＝3)或0.1％(w/w)¹²⁴I-壳聚糖-NAC(n＝2)的单一局部滴注，而不对左眼进行处理。重复的微PET测量在应用测试物质后3天(72小时)进行。作为主要研究参数，对应用位点的放射性浓度进行了监测。因此，动态微PET测量(350–650keV的能量窗口，6ns的时间窗口)在测试物质给药1小时后进行。此外，15分钟的静态扫描在测试物质给药后6小时后进行，30分钟的静态扫描在24小时后进行，60分钟的静态扫描在48小时和72小时后进行。

如上所述进行对得到的微PET图片的定量分析，并且给出图10所示的结果作为从时间-放射性浓度曲线(％AD*h/g)计算的曲线下面积(AUC)值。本研究中使用的¹²⁴I-标记的壳聚糖-NAC和¹²⁴I-HA-半胱胺溶液中的硫醇基团含量的测定分别显示为约154μM和54μM硫醇基团/g聚合物，所述硫醇基团保持为游离的，即放射性标记后的未氧化形式。

示例11：兔的单一眼部滴注后的¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC溶液的药代动力学表现的比较

分别含有0.05％、0.1％、0.3％和0.5％(w/w)的浓度的¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC的¹²⁴I标记的壳聚糖-NAC溶液的眼部分布在单一滴注后通过在不同时间点总计的数据的微PET扫面投影图像的定性评估进行评价。结果在表7中列出。

表7、4种不同的放射性标记的壳聚糖-NAC溶液的眼部分布的定性评估

对4种不同的放射性标记的壳聚糖-NAC溶液的眼表分布的定性评估清楚表明，具有0.1％和0.3％的壳聚糖-NAC浓度的溶液在与兔眼表上均匀分布24小时相关时表现出最好的结果。含0.05％的溶液更迅速地从眼表清除。含有0.5％壳聚糖-NAC的溶液在眼睛上并不是均匀分布，并且也可更迅速地从眼表清除。

示例12：壳聚糖-NAC对患有干眼综合征的患者中的泪膜厚度的影响

本研究的目的是研究含有0.1％壳聚糖-NAC(171μmol/g游离硫醇基团)对在单剂量后和5天治疗后的患有干眼综合征的患者中的泪膜厚度的影响。为了这个目的，计划了2批次：在批次I中，壳聚糖-N-乙酰半胱氨酸滴眼液在一个随机选择的眼睛中滴注一次，而另一只眼睛接受安慰剂。用光学相干断层扫描(OCT)在滴注前和滴注后10分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、10小时、12小时和24小时后对泪膜厚度进行测量。结果(以μm计的中位数泪膜厚度、括号中的范围，n＝16)如表8所示。

时间壳聚糖-NAC安慰剂预剂量3.9(3.3-4.8)4.0(3.0-5.3)10min4.7(3.4-7.0)4.2(2.0-6.3)8h4.7(3.5-6.5)4.2(3.0-6.5)10h5.2(3.5-7.9)4.3(3.3-5.5)12h4.6(3.7-7.6)4.1(2.9-6.9)24h4.7(4.0-8.1)4.7(2.8-6.3)

表8批次I的泪膜厚度测量的结果

在批次II中，16例患者随机在右眼上接受0.1％的壳聚糖-NAC滴眼液一天一次并且在左眼中一天两次，反之亦然。另一只眼睛在第二次滴注中接受安慰剂。在上午滴注前的每个研究日和最后滴注后的那天，用OCT测量泪膜厚度。在筛查和第6天的批次II中，眼表疾病指数(OSDI)被评估为次要疗效变量。

批次II中的泪膜厚度测量的结果在表9(批次II中的“每日一次”和“每日两次”组的中位数泪膜厚度(μm)；在括号中的范围，n＝16)中示出。

表9批次II的泪膜厚度测量的结果

在整个24小时的后剂量周期的回归分析的基础上，如果将批次I的治疗组与安慰剂组进行比较，泪膜厚度的增加在统计学上是显著的(回归分析以确定随着时间的治疗之间的差异，P<0.0001)。这些结果表明，壳聚糖-NAC滴眼液在超过24h的时间段后造成了泪膜厚度统计学上的显著增加，从而暗示了长角膜停留时间。泪膜厚度恢复到健康受试者的水平(Werkmeister,Alex等人,2013,Measurement of tear film thickness usingultrahigh-resolution optical coherence tomography,Invest Ophthalmol Vis Sci(54):5578-5583)。在批次II中每天一次的滴注足以恢复泪膜厚度并不逊于每日两次的应用。

在批次II中，在筛查的中位数眼表疾病指数为38.5并在第6天提高至13.0，相当于减少了60.5％。这表明，以OSDI评估的DES的个人严重度在用0.1％壳聚糖-NAC滴眼液治疗5天后有所改善。