与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1及其编码基因和应用，涉及植物遗传育种与基因工程技术领域。本蛋白Dull1是如下1）或2）的蛋白：1）由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2）将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加与且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质；上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。Dull1基因可以提高籽粒中抗性淀粉的含量、直链淀粉的含量，改变淀粉的结构；Dull1基因为分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高抗性淀粉、高直链淀粉玉米品种，为玉米种子的淀粉改良和籽粒性状改良提供了有力手段。

说明书

技术领域

本发明涉及植物遗传育种与基因工程技术领域，特别涉及一种与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1及其编码基因和应用。

背景技术

根据欧洲抗性淀粉协会（EURESTA）的定义，抗性淀粉（Resistant starch，简称RS）是指在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物的总称。研究表明抗性淀粉有降低餐后血糖和提高胰岛素敏感性，预防便秘、结肠癌，保持肠道健康，降低血清中的胆固醇和甘油三酯，减少脂肪堆积，保持体重，促进矿物质吸收等多种生理功能。抗性淀粉作为食品原料和食品添加剂如食品增稠剂、稳定剂和改良剂等在食品工业领域有着重要的应用；以及作为医学成分使用，如填充物、包扎物、分解质和增稠物质、药品缓释载体等在医药等工业领域也有重要的应用。

研究表明全球糖尿病人数从2010年到2030年将由2.85亿增加到4.39亿，发展中国家增加69%，而发达国家增加20%。2010年全球糖尿病治疗总费用至少为3760亿美元，2030年预计高达4900亿美元。2010年卫生部统计数据表明中国糖尿病患者有9240万，占我国总人口的9.3%，处于糖尿病前期的高达1.48亿人。我国糖尿病患者，以II型糖尿病为主，约为95%。研究表明每人每天摄入大约20g抗性淀粉，就能起到有益健康的作用。目前，我国城镇平均抗性淀粉摄入量为14.9 g，远低于人们的健康需求。由于抗性淀粉对糖尿病的预防与控制有着重要的应用价值，若能通过提高饮食中的抗性淀粉含量来对糖尿病人的血糖控制，将会给糖尿病患者带来极大益处和节约医疗成本。

目前，绝大多数的研究重点集中在以高直链淀粉为原料，通过加工工艺得到高抗性淀粉。这类产品口感较差，一般只是作为特殊人群的辅助食品利用。通过遗传改良的方法培育高抗性淀粉优质作物新品种，是实施饮食预防的有效策略。但由于抗性淀粉的形成机理还不清楚，到目前为止，抗性淀粉相关基因的报道尚不多见，以及抗性淀粉测定费时、费力和成本高，且易受环境影响，所以高抗性淀粉优质作物新品种培育面临很大的困难。

因此，抗性淀粉相关基因的克隆及功能研究以及分子标记的开发将极大地加快高抗性淀粉优质作物新品种培育的进程。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1及其编码基因和应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1

1、本发明提供的蛋白，命名为Dull1, 是1）或2）的蛋白：

1）由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加与且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质；

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

2、编码上述蛋白的DNA分子

DNA分子为如下1）-6）中任一种的DNA分子：

1）其核苷酸序列是SEQ ID NO：2的DNA分子；

2）其编码序列如SEQ ID NO：列2的自5＇末端第113-5137位核苷酸；

3）其编码序列如SEQ ID NO：2的自5＇末端第113-5000位核苷酸；

4）其基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3的自5＇末端第1-12981位核苷酸；

5）在严格条件下与1）或2）或3）或4）杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

所述严格条件是：用0.1×SSPE（或0.1×SSC）, 0.1%SDS的溶液，在DNA或RNA杂交实验中65°C下杂交并洗膜；

6）与1）或2）或3）或4）的DNA分子具有90%以上的同源性且编码（权利要求１）相同功能的蛋白的DNA分子。

扩增或合成上述Dull1 全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明的保护范围；

所述的重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体，可用现有的植物表达载体构建含有Dull1 编码DNA分子的重组表达载体，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA3301、pCAMBIA2301、pBI121、pBin19、 p*7WG2、pMDC32或其他衍生植物表达载体。

使用Dull1 编码DNA分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜病毒（CAMV）35S启动子、泛素（ubiquitin）启动子和肌动蛋白(actin)启动子等，它们可以单独使用或与其它启动子结合使用；此外使用本发明的DNA分子构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻界区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；所述翻译控制信号和翻译起始密码子的来源是广发的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以是可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因和荧光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（如庆大霉素标记物和卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除草剂基因）等。

所述重组载体具体可为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点间插入上述与抗性淀粉相关蛋白的编码DNA分子得到的重组表达载体；在本发明的实施例中，表达载体为pCAMBIA1300，重组载体为将序列3自5＇末端第1-12981 位核苷酸插入 pCAMBIA1300 载体的KpnI和SbfI位点间得到的载体，命名为35S：Dull1。

所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌，本发明的实施例中，目的菌为根癌农杆菌EHA105。

上述蛋白、DNA分子、含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在调控植物籽粒性状中的应用也是本发明保护范围；

所述应用中所述的物籽粒性状是通过淀粉含量、抗性淀粉含量、直链淀粉含量和/或淀粉性质结构体现；

所述调控植物籽粒性状是为抗性淀粉含量提高和/或提高直链淀粉含量提高，和/或改变淀粉链长分布；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是玉米，所述玉米优选是W64A。

二、蛋白Dull1的基因的获得方法

1、通过对野生型W64A和Dull1突变体籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量进行比较分析，发现Dull1突变体籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量显著比野生型升高，说明突变基因Dull1与抗性淀粉和直链淀粉含量相关；

2、通过PCR技术克隆Dull1基因，并构建互补载体，通过农杆菌转化法转入Dull1突变体中，并对野生型W64A、Dull1突变体和转基因材料籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量进行比较分析转基因材料籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量回复到野生型W64A的水平；同时通过构建Dull1基因反义载体，并转入野生型W64A，使转入Dull1基因反义载体的W64A籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量都显著升高；说明Dull1基因参与抗性淀粉含量和直链淀粉含量的调控。

三、蛋白Dull1的基因的应用

1、将Dull1基因转入植物，可提高籽粒中抗性淀粉的含量、直链淀粉的含量，改变淀粉的结构；

2、根据Dull1基因设计分子标记开展分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高抗性淀粉、高直链淀粉玉米品种，为玉米种子的淀粉改良和籽粒性状改良提供了有力手段，具有重要的理论意义和巨大的应用潜力。

四、培育转基因植物的方法

本发明提供的方法为将上述DNA分子导入目的基因，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下1）和/或2）和/或3）特征：

1）所述转基因植物籽粒的抗性淀粉含量高于所述目的植物；

2）所述转基因植物籽粒的直链淀粉含量高于所述目的植物；

3）所述转基因植物籽粒的淀粉链长分布改变；

所述DNA分子通过所述重组载体导入目的植物；

携带有本发明的与抗性淀粉形成相关蛋白的编码基因Dull1的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中；被转化的植物宿主（目的植物）为双子叶植物或单子叶植物，优选是玉米，更优选是W64A。

所述蛋白、DNA分子、DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在培育高抗性淀粉和/或高直链淀粉等植物籽粒性状中的应用也是本发明保护的范围；所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米。

实验证明，与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①通过等位突变体的方法，分离了一个可以调控抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量的基因，并通过转基因功能互补实验验证了该基因的功能；

②与对照相比，在Dull1 纯合突变体中Dull1的表达量显著下降，籽粒的抗性淀粉含量，直连淀粉含量都大幅度提高，淀粉的链长分布也发生了改变；

③将该蛋白的编码基因转入Dull1 纯合突变体后可以互补突变体的表型，互补转基因植株籽粒中抗性淀粉的含量，直连淀粉的含量恢复到野生型水平；

④将该蛋白的编码基因在玉米中活性降低后，玉米籽粒中抗性淀粉含量，直连淀粉含量都大幅度提高，淀粉的链长分布也发生了改变。

总之，Dull1基因可以提高籽粒中抗性淀粉的含量、直链淀粉的含量，改变淀粉的结构；Dull1基因为玉米的高抗性淀粉或高直链淀粉育种提供了新的基因资源；Dull1基因为分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育高抗性淀粉、高直链淀粉玉米品种，为玉米种子的淀粉改良和籽粒性状改良提供了有力手段，具有重要的理论意义和巨大的应用潜力。

附图说明

图1是玉米Dull1基因结构和突变位点示意图；

图2是野生型W64A和Dull1 等位突变体中Dull1基因型鉴定，

A：突变体du-ref的基因型鉴定，

B：突变体du-M3的基因型鉴定；

图3是野生型W64A和Dull1 等位突变体籽粒中抗性淀粉含量和直链淀粉含量，

A：野生型W64A和Dull1 等位突变体籽粒中抗性淀粉含量，

B：野生型W64A和Dull1 等位突变体籽粒中直链淀粉含量；

图4是支链淀粉链长分布差异；

图5是Dull1基因的表达量分析；

图6是功能互补实验中转基因玉米籽粒中抗性淀粉含量和直链淀粉含量，

A：gDull1-du1-Ref互补载体构建示意图，

B：实时荧光定量PCR检测的转基因玉米中的Dull1的表达量，

C：互补转基因玉米籽粒粒中抗性淀粉的含量，

D：互补转基因玉米籽粒中直链淀粉的含量，

W64A是非转转基因对照，

gDull1-du1-Ref是转基因植株，

EV-du1-Ref是空载体转基因对照植株；

T检验，小写字母代表显著（P<0.05），大写字母代表极显著（P<0.01），

字母相同代表没有差异，字母不同代表有差异；

图7是RNA干扰实验中转基因玉米籽粒中抗性淀粉含量和直链淀粉含量，

A：实时荧光定量PCR检测的转基因玉米中的Dull1的表达量，

B：RNA干扰的转基因玉米籽粒中抗性淀粉的含量，

C：RNA干扰的转基因玉米籽粒中直链淀粉的含量；

W64A是非转转基因对照，Dull1-RNAi是转基因植株，EV-W64A空载体转基因对照植株；

T检验，小写字母代表显著（P<0.05），大写字母代表极显著（P<0.01），

字母相同代表没有差异，字母不同代表有差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步的说明：

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。

下述实施例中的玉米是按如下方法栽培得到的：玉米种子放在30℃温水中浸泡6小时，水面高于种子1-2厘米，浸种后将种子滤干，然后单粒点种于温室。

图1是玉米Dull1基因结构和突变位点示意图。

实施例1，基因新功能的发现

将玉米（Zea mays L.）Dull1等位突变体du1-M3、du1-Ref 和 W64A 的种子分别按上述方法进行栽培，然后取叶片提取DNA。

玉米基因组DNA的提取：

采用改良的CTAB方法（Mou Z, He Y, Dai Y, et al. Deficiency in fatty acidsynthase leads to premature cell death and dramatic alterations inplantmorphology. The Plant Cell. 2000, 12, 405-418.）从水稻叶片中提取基因组DNA，取100mg水稻叶片，经液氮冷冻，直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl MQ H₂O>

1、突变体基因型的鉴定

利用表1中的M3 1F/1R引物组合和M3 2F/Mu1R引物组合，鉴定du1-M3 和W64A (公众可从长江大学获得，记载过该材料的非专利文献是Qiaohui Lin, Binquan Huang,MingxuZhang, et al. Functional Interactions between Starch Synthase III andIsoamylase-Type Starch-Debranching Enzyme in Maize Endosperm. PlantPhysiology. 2012, 158: 679–692. ) 的基因型。以du1-M3 基因组DNA为模板，用M3 1F/1R引物组合进行PCR扩增后经1%凝胶电泳检测后没有产物，而用M3 2F/Mu1R引物组合进行PCR扩增后经1%凝胶电泳检测后有537 bp的条带。以对照W64A 基因组DNA为模板，用M3F1/R1引物组合进行PCR扩增后经1%凝胶电泳检测后有585 bp 条带, 而用M3 2F /Mu1R引物组合进行PCR扩增后经1%凝胶电泳检测后没有产物（图2A）。根据上述结果说明du1-M3为纯合突变体。利用表1中的Ref F/R引物组合，鉴定du1-Ref和W64A(公众可从长江大学获得，记载过该材料的非专利文献是 Qiaohui Lin, Binquan Huang，Mingxu Zhang, et al.Functional Interactions between Starch Synthase III and Isoamylase-TypeStarch-Debranching Enzyme in Maize Endosperm. Plant Physiology. 2012, 158:679–692.)的基因型。以du1-Ref基因组DNA为模板，用Ref F/R引物组合进行PCR扩增后经NcoI酶切完全后进行凝胶电泳后得到146bp的条带，而以对照W64A基因组DNA为模板，用gDull1 Ref F/R引物组合进行PCR扩增后的到的产物由于没有NcoI酶切位点, 经NcoI酶切处理后不能切开，进行凝胶电泳后得到175bp的条带（图2B）。根据上述结果说明du1-Ref为纯合突变体。

表1

引物名称引物序列（5’-3’）M31FATGGAGATGGTCCTACGGTCGCAM31RTGTGCCGCTGCATTCTACTACAM3 2FATGAGCTAGGGAACCCACAGTTGGAMu1RACGGGAACGGTAAACGGGGACAGARef FCATGCAGTGAGATTTACTTCTCCTRef RAGAAAACGAAGTCCATCATATAGGCATCCCATGGAACGTAAACT

2、突变体表型的鉴定

依据美国分析化学家协会（AOAC）的抗性淀粉方法(2002.02)，对野生型W64A和突变体du1-M3和du1-Ref籽粒中的抗性淀粉分别进行测定，结果表明 du1-M3和du1-Ref 籽粒中的抗性淀粉含量分别是11.22%和12.04%显著高于野生型W64A 籽粒中的抗性淀粉含量6.47%（图3A）。根据Perez and Juliano （1978）报道的直链淀粉测定方法, 对野生型W64A和突变体du1-M3和du1-Ref籽粒中的直链淀粉含量分别进行测定，结果表明，du1-M3和du1-Ref籽粒中的直链淀粉含量分别是40.66%和41.52%显著高于野生型W64A 籽粒中的直链淀粉含量24.83%（图3B）。

3、支链淀粉链长分布

授粉后20天采收各材料玉米穗，每穗玉米取下6颗籽粒备用。玉米籽粒去除外皮和胚后，用研钵加4ml蒸馏水将其研磨成匀浆。准确取匀浆1mL 80°C干燥，称取质量，用于标准化。再准确取出2份1mL匀浆作为重复，分别于4°C， 10,000g离心10 min。小心弃去上清，用1mL 80%冰冷乙醇洗沉淀一次，再10,000g离心5 min弃上清后收集沉淀。将沉淀用1.5mL的DMSO分散后沸水浴30min。稀释后，加入异淀粉酶 (Megazyme E-ISAMY) 去分支后, 衍生后按照O’Shea et al. (1998) 的方法用贝克曼毛细管系统（Beckman P/ACE capillarysystem）。每个材料分析至少2个生物学重复。结果表明：与野生型W64A相比，du1-M3 anddu1-ref的支链淀粉中链长聚合度(DP)为DP6-DP9，DP17- DP19和DP37 to DP57的链减少，而链长聚合度(DP)为DP11 - DP15 和DP20 - DP33 的链在增加（图4）。

4、W64A, du1-M3 和 du1-Ref幼穗中抗性淀粉相关基因Dull1的表达水平

玉米幼穗在授粉后10天才收，所有样品立即冻于液氮，然后放-80°C冰箱备用。用Trizol （Invitrogen公司）法提取幼穗总RNA后加DNase （Invitrogen公司）处理。根据生产商的说明，取1 µg总RNA用M-MLV 反转录酶（Promega公司）合成cDNA。实时荧光定量PCR用表3中的qPCR引物组合，SYbGreen mix (Bio-Rad公司)，根据生产商的说明在荧光定量PCR仪（7500，ABI公司）上进行。反应程序: 50°C，2 min；95°C，10 min；然后95°C，15秒， 60°C，1min，40 次循环。泛素载体蛋白编码基因（Ubiquitin carrier protein，简称UBCP）用作参考基因。du1-M3 and du1-Ref幼穗中Dull1的表达量大约是野生型W64A的36% and 27% （图5）。

实施例2，转基因植物的获得与检测

1、 转基因植物的获得

1）重组表达载体的构建

（1）基因的克隆

利用表2中的 gDull11F/gDull11R引物组合，从W64A(公众可以从长江大学获得，记载过该载体的非专利文献是Qiaohui Lin, Binquan Huang, Mingxu Zhang, et al.Functional Interactions between Starch Synthase III and Isoamylase-TypeStarch-Debranching Enzyme in Maize Endosperm. Plant Physiology. 2012, 158:679–692.）基因组DNA中扩增出了包含Dull1基因的DNA预备片段（测序表明预备片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）。将该预备片段通过KpnI和SbfI酶切并进行回收，得到包含全长Dull1的最终基因组DNA片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：3的自5’端第1-12981位所示）(图6A)。

SEQ ID NO：3第1bp到12981bp所示的基因组DNA对应的cDNA的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。序列2由5025个碱基组成，其开放阅读框（ORF）为自5’末端第113位到5137位碱基，编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的Dull1蛋白。

表2、引物序列

引物名称引物序列（5’-3’）gDull11FaaaGGTACCTCGACGCCTTTGAGACTGACgDull11RaaaCCTGCAGGTCAAGGGCGAAGATGGAAGG

Dull11F引物的5’端加KpnI酶切位点，gDull11R引物的5’端加SbfI酶切位点。

（2）构建表达载体

将步骤（1）得到的包含全长Dull1基因的最终基因组DNA片段插入载体pCAMBIA1300（购自Cambia公司）的KpnI和SbfI酶切位点之间，得到重组表达载体gDull1 （图6A）。

2）转基因植物的获得

将质粒gDull1通过电击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）株系EHA105(公众可以从长江大学获得，记载过该材料的非专利文献是C Tao，Z Ding，L Li，Y Shi，MZhao. Optimization of Agrobacterium Tumefaciens Mediated Maize TransformationSystem. Crops, 2008, 26(4):26-29.)中，筛选得到含有重组质粒gDull1的重组农杆菌菌株。取du1-Ref授粉后10天的幼穗，去苞叶消毒后剥取幼胚，将其放入感染培养液（配方参考： Methods in Molecular Biology, Vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e,volume 1）中清洗一到两次，备用。

用含有重组质粒gDull1的重组农杆菌菌株侵染du1-Ref玉米幼胚。然后将幼胚置于共培养培养基（参考文献：Methods in Molecular Biology, vol.343: AgrobacteriumProtocols, 2/e, volume 1)上，以未进行农杆菌转化的幼胚作为对照，在20°C 黑暗条件下共培养3天，然后将幼胚转入含有50mg/L潮霉素的选择培养基（Methods in MolecularBiology, vol.343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1）上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗后移栽到温室或大田中，获得的转基因植株为T₀代，将T₀代收的转基因种子进行种植，得到转gDull1的T1代转基因植株。

按照获得转gDull1 T1代转基因植株的方法，将空载体pCAMBIA1300转化du1-Ref,得到空载体对照植株。

（1）通过实时荧光定量PCR检测Dull1基因的表达量

利用Trizol (购自 Invitrogen 公司) 提取转基因植株和对照植株W64A的植物总RNA，并利用反转录试剂盒（购自 Promega 公司）进行反转录，得到cDNA。利用的引物 qDull1 F和qDull1 R进行PCR检测Dull1基因的表达量。利用qUBCP F 和qUBCP R扩增Ubiquitin carrier protein基因作为内标，引物序列如表3。结果显示，转基因植株中，Dull1的表达量增加（图6B）。

表3 引物序列

引物名称引物序列（5’-3’）qDull1 FTCCCACAGATGTCACCCAACqDull1 RCCAGTCAAGGATGGAAGGGGqUBCP FCAGGTGGGGTATTCTTGGTGqUBCP RATGTTCGGGTGGAAAACCTT

（2）转基因植物的抗性淀粉含量和直链淀粉含量检测

对转gDull1的T1代转基因植株、W64A野生型植株和空载体对照植株的籽粒中抗性淀粉含量和直链淀粉含量进行测定。结果如图6C和图6D所示，与空载体对照与相比，转gDull1的T1代转基因植株籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量均下降, 与W64A野生型植株相比无显著差异。

实施例3，转基因植物的获得与检测

1、 转基因植物的获得

1）干扰片段的获得

W64A玉米幼穗在授粉后10天采收后，立即冻于液氮，然后放-80°C冰箱备用。用Trizol(购自 Invitrogen 公司)法提取幼穗总RNA后加DNase (购自 Promega 公司)处理。根据生产商的说明，取1 µg总RNA用M-MLV 反转录酶 (Promega公司)合成cDNA。

分别用表4中的引物对RNAi 1F/ RNAi1R 和RNAi 2F/ RNAi 2R对上述幼穗cDNA进行PCR扩增，将获得的产物进行测序。两对引物分别扩增得到的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：2第5149bp到5919bp片段，SEQ IDNO：5是SEQ ID NO：4的反向互补序列。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5经全基因组比对分析确认在玉米基因组中无其他同源序列。

表4、引物序列

引物名称引物序列（5’- 3’）RNAi FGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACCAACGGCCAATGTAGTGTRNAi RGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTtCAGTCAAGGATGGAAGGGGG

RNAi 的前后引物5’端分别加gateway载体重组接头。

2）干扰载体的构建

将引物对RNAi1F/RNAi1R扩增得到的产物通过Gateway 载体系统重组插入带有35S启动子的Gateway载体p*7GWIWG2(II)，得到重组表达载体Dull1-RNAi (即干扰载体Dull1-RNAi)，插入片段表达后形成发夹结构。载体p*7GWIWG2(II), 公众可以从长江大学获得，记载过该载体的非专利文献是Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann Depicker. GATEWAY ^{TM>vectors for Agrobacterium-mediated plant Transformation. TRENDS in PlantScience. 2002, 7 (5):193-195.}

3）转基因植物的获得

将干扰载体Dull1-RNAi通过电击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）株系EHA105(公众可以从长江大学获得，记载过该材料的非专利文献是C Tao，Z Ding，L Li，YShi，M Zhao. Optimization of Agrobacterium Tumefaciens Mediated MaizeTransformation System. Crops, 2008, 26(4):26-29.)中，筛选得到含有含有干扰载体Dull1-RNAi的重组农杆菌菌株。取W64A授粉后10天的幼穗，去苞叶消毒后剥取幼胚，将其放入感染培养液（配方参考： Methods in Molecular Biology, Vol. 343: AgrobacteriumProtocols, 2/e, volume 1）中清洗一到两次，备用。

用含有干扰载体Dull1-RNAi的重组农杆菌菌株侵染W64A玉米幼胚后置于共培养培养基（参考文献：Methods in Molecular Biology, vol.343: AgrobacteriumProtocols, 2/e, volume 1)上，以未进行农杆菌转化的幼胚作为对照，将幼胚在20°C 黑暗条件下共培养3天后转入含有50mg/L潮霉素的选择培养基（Methods in MolecularBiology, vol.343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1）上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗后移栽到大田中，获得的转基因植株为T₀代，将T₀代收的转基因种子进行种植，得到转Dull1-RNAi的T1代转基因植株。

按照获得转Dull1-RNAi的T1代转基因植株的方法，将空载体p*7GWIWG2(II)转化W64A,得到空载体对照植株。

2、转基因植物的检测

1）通过实时荧光定量PCR检测Dull1的表达量

利用Trizol (购自 Invitrogen 公司) 提取转基因植株和对照植株W64A的植物总RNA，并利用反转录试剂盒（购自 Promega 公司）进行反转录，得到cDNA。利用表3中的引物qDull1 1F和qDull1 1R进行实时荧光定量PCR检测Dull1基因的表达量。利用qUBCP F 和qUBCP R扩增Ubiquitin carrier protein基因作为内标，引物序列如表3。结果显示，转基因植株中，Dull1的表达量降低（图7A）。

2）转基因植物的抗性淀粉含量和直链淀粉含量检测

对转Dull1-RNAi的T1代转基因植株、W64A对照植株和空载体对照植株的籽粒中抗性淀粉含量和直链淀粉含量进行测定。结果如图7B和图7C所示, 与W64A对照植株和空载体对照相比，转Dull1-RNAi的T1代转基因植株籽粒中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量均大幅度增高（抗性淀粉由6.5%增高到10.5%；直链淀粉由25.5%增高到 38.8%）。

序列表

<110>王利军

<120>与植物抗性淀粉相关的蛋白Dull1及其编码基因和应用

<140>

<141>

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