一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA杂交界面的方法

摘要

本发明公开了一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA杂交界面的方法。本发明将BSA等电点溶液(pH 4.6)作为封闭液来封闭传感界面对DNA光纤进行封闭处理，并提出了一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA杂交界面的方法，实现对传感界面活性吸附位点的高效率封闭，抑制生物功能化的传感界面对非特异性核酸链的吸附作用，同时保证目标链段向传感界面的杂交，从而提高传感设计的信噪比，提升器件灵敏度。本发明的方法在减少活性吸附位点的基础上，同时确保了目标核酸链向DNA界面的杂交，且该方法具有经济、简便、快速的优点。

说明书

技术领域

本发明属于检测分析领域，具体涉及一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA杂交界面的方法。

背景技术

在生物传感方法中，生物元件之间的(亲和)识别构成了传感的基础。传统的生物识别对包括经典的免疫识别对(抗原抗体)与生物体内的亲和识别对(如亲和素和生物素)。一般地，传统识别对中的一方属于蛋白质。而具备生物识别力的蛋白质(如抗体)通常具备较高的获取及保存成本；另外，涉及活体生产的蛋白质也存在批次间性质不稳定的问题。这些缺点在一定程度上限制了传统生物识别材料在传感领域的应用。

自上世纪末，以功能核酸作为新型生物识别元件的传感分析方法也取得了迅猛的发展。功能核酸是具有亲和识别、催化等特定功能的寡聚核苷酸片段，以核酸适配体(aptamer)与DNA酶(DNAzyme)两种核酸材料为代表。相较于抗体等传统生物识别材料而言，可人工合成的功能核酸具备生产及运输成本低、易保存、性质稳定等优势。目前已有百余种功能核酸见诸报道，其识别对象涵盖生物毒素、金属离子、细胞代谢物、大分子蛋白、全细胞等上百种物质，其应用领域集中于生物传感及活细胞诊疗等方面。

随着功能核酸领域的迅猛发展，生物传感领域内也有一大批以功能核酸作识别材料的检测方案应运而生。其中多数方案类属于均相检测——即检测中不存在固相界面，单纯利用液相DNA分子和目标物(互补链或靶分子)之间的相互识别，结合荧光标记或染色、纳米材料辅助的比色、酶促反应等技术手段实现对靶标物的定量分析。虽然均相检测具有对硬件要求低、反应速度快等优点，但相较于基于界面结构(如光纤、光波导芯片、电极等)的生物传感器，均相策略无法实现探针固载化，因而难以构建稳定、高集成化、可再生(可反复利用，单次检测成本低)的传感器件。而应用功能核酸的界面型传感器可细分为两类：1)直接将DNA共价固载于传感界面(后称为DNA界面)；2)依托均相反应进行检测，实现一次信号转换，将靶标物浓度信号转变为中转物质浓度，再利用界面识别中转信号(称为间接界面)。显然，相较于DNA界面，间接界面涉及多次信号转换，不仅在操作层面具有更高的复杂度，更有可能引入信号偏倚、损失，甚至湮没。综上所述，从提升用户操作体验、降低检测成本、推广生物传感检测应用范围层面考虑，构建可再生的DNA界面意义重大。

一般地，人工修饰的生物传感界面上会存在一些活性吸附位点，此类位点易通过亲疏水、静电以及氢键等作用吸附待测液中的特定组分。对于DNA界面而言，无论吸附目标链段或非目标链段，均有可能降低传感的质量、影响分析结果。因此，在构建DNA传感界面时，需要规避核酸分子对传感界面的“非特异性吸附”。

在基于DNA界面的传感系统中，存在两条检验封闭质量的基本标准：1)封闭后的传感界面较之于无封闭或其他封闭材料封闭的传感界面对非特异性链的响应信号应大幅降低；2)封闭后的传感界面应能保证对目标杂交链的高信号响应。然而，在现有的基于DNA界面的传感系统中，少有能同时满足上述两条标准的优质封闭剂见诸报道。采用低质量的封闭，往往不能有效降低非特异性吸附，或在降低非特异性吸附的同时也破坏了DNA界面的生物活性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种封闭液。

本发明提供的封闭液是将BSA与pH为4.4-4.8的缓冲液混匀后得到的溶液。

所述BSA在所述封闭液中的浓度为1-3mg/mL。

上述封闭液中，所述pH为4.6。

上述封闭液中，所述BSA在所述封闭液中的浓度为2mg/mL。

上述封闭液中，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液。所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；所述乙酸-乙酸钠缓冲液0.2M乙酸-乙酸钠缓冲液。

上述0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法如下：将0.1mol/L的柠檬酸水溶液(柠檬酸C₆H₈O₇·H₂O：分子质量210.14，0.1mol/L，溶液为21.01克/升)与0.1mol/L的柠檬酸钠水溶液(柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O：分子质量294.12，0.1mol/L溶液为29.41克/毫升)按照体积比为103：97的比例混匀，即可得到0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

上述0.2M乙酸-乙酸钠缓冲液的配置方法如下：将0.2M的乙酸钠水溶液(Na₂Ac·3H₂O分子质量＝136.09，0.2mol/L溶液为27.22克/升)与0.2M的乙酸水溶液按照体积比为49：51的比例混匀，即可得到0.2M乙酸-乙酸钠缓冲液。

上述封闭液中，所述缓冲液具体为0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

本发明的另一个目的是提供上述封闭液的新用途。

本发明提供了上述封闭液在如下(1)-(8)中任一种中的应用：

(1)构建DNA界面和/或构建可再生DNA界面；

(2)封闭DNA界面的活性吸附位点；

(3)提高DNA界面对目标核酸链的特异性吸附和/或识别；

(4)降低DNA界面对非目标核酸链的非特异性吸附和/或识别；

(5)提高DNA界面对目标核酸链的信号响应值；

(6)降低DNA界面对非目标核酸链的信号响应值；

(7)促进目标核酸链与DNA界面的杂交；

(8)抑制非目标核酸链与DNA界面的杂交。

本发明还有一个目的是提供一种DNA界面的构建方法。

本发明提供的DNA界面的构建方法包括如下步骤：

1)采用共价法将末端修饰氨基的DNA分子与表面活化有醛基的光纤连接，得到DNA修饰的光纤；

2)用上述封闭液封闭所述DNA修饰的光纤，得到封闭处理后的光纤，即得到DNA杂交界面。

上述方法中，若所述DNA分子为双链DNA分子，还包括将所述封闭处理后的光纤的双链DNA分子变性，恢复单链DNA界面的步骤。本发明的方法中的DNA分子为双链DNA分子，需要进行变性处理，使其成为单链，但此处的DNA分子也可以是单链DNA分子，如果是单链DNA分子，则不需要变性处理的步骤。

上述方法中，所述变性的方法为用DNA变性液浸泡所述封闭处理后的光纤，所述DNA变性液为尿素溶液；所述尿素溶液的溶剂为水，溶质为尿素和NaCl，溶质及在尿素溶液中的浓度为：尿素4M，NaCl 50mM。

上述方法中，所述封闭的条件为37℃，100rpm震荡4小时。

上述方法中，所述步骤1)包括如下步骤：

A1)用Piranha溶液浸泡光导纤维，得到Piranha溶液处理后光纤；

A2)用三乙氧基硅烷溶液浸泡所述Piranha溶液处理后光纤，得到三乙氧基硅烷处理后的光纤；

A3)用戊二醛水溶液浸泡所述三乙氧基硅烷处理后的光纤，得到戊二醛处理后的光纤；

A4)用所述末端修饰氨基的DNA分子的溶液浸泡所述戊二醛处理后的光纤，得到DNA修饰的光纤。

上述方法中，

所述步骤A2)和所述步骤A3)之间还包括将所述三乙氧基硅烷处理后的光纤进行超声清洗的步骤；

所述步骤A4)后还包括将所述DNA修饰的光纤依次经过甘氨酸水溶液和氰基硼氢化钠水溶液处理的步骤。

上述方法中，

所述Piranha溶液是将浓H₂SO₄与30％(质量百分比浓度)H₂O₂水溶液混匀后得到的溶液，其中，浓H₂SO₄与30％H₂O₂水溶液的体积比为3:1；

所述三乙氧基硅烷溶液是将APTS与无水甲苯混匀后得到的溶液，其中，APTS的体积分数为1％；

所述戊二醛水溶液中戊二醛的体积分数为1％；

所述末端修饰氨基的DNA分子的溶液中的DNA分子的浓度为300nM。

上述方法中，所述超声清洗的方法为将三乙氧基硅烷处理后的光纤浸泡于无水甲苯中进行超声处理，得到超声处理后的光纤，再用无水甲苯清洗所述超声处理后的光纤，得到清洗后的光纤；最后用氮气吹干所述清洗后的光纤，并将其进行烘烤。所述超声处理的时间为3分钟，超声处理的次数为3次；所述清洗的次数为5次；所述烘烤的条件为200℃烘箱中烘烤1小时。

上述方法中，所述甘氨酸水溶液的浓度为1M；所述氰基硼氢化钠水溶液的浓度为20mg/mL。

本发明的最后一个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在如下(B1)-(B6)中任一种中的应用：

(B1)提高DNA界面对目标核酸链的特异性吸附和/或识别；

(B2)降低DNA界面对非目标核酸链的非特异性吸附和/或识别；

(B3)提高DNA界面对目标核酸链的信号响应值；

(B4)降低DNA界面对非目标核酸链的信号响应值；

(B5)促进目标核酸链与DNA界面的杂交；

(B6)抑制非目标核酸链与DNA界面的杂交。

本发明利用等电点缓冲液中BSA对传感界面吸附量大的特点，将BSA等电点溶液(pH 4.6)作为封闭液来封闭传感界面对DNA光纤进行封闭处理，并提出了一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA界面的方法，实现对传感界面活性吸附位点的高效率封闭，抑制生物功能化的传感界面对非特异性核酸链的吸附作用，同时保证目标链段向传感界面的杂交，从而提高传感设计的信噪比，提升器件灵敏度。本发明的方法在减少活性吸附位点的基础上，同时确保了目标核酸链向DNA界面的杂交，且该方法具有经济、简便、快速的优点。

附图说明

图1是DNA杂交前后紫外吸收光谱的变化情况。

图2是本发明的DNA修饰的光纤的制备方法。

图3是非目标链在经不同封闭液处理后的对照组光纤上的信号。

图4是本发明中目标杂交链和非目标链在未经封闭液处理的DNA光纤上所产生的信号。

图5是本发明中目标杂交链和非目标链在经BSA等电点封闭液处理的DNA光纤上所产生的信号。

图6是本发明的DNA光纤连续两天的信号变化情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明以倏逝波传感器为检测平台(倏逝波光纤传感平台为中国专利申请号为200610089497.4的全光纤倏逝波生物传感器)，以光纤为传感元件，Cy 5.5为荧光标记基团，但本发明不受以下实施方式的限制，凡基于本发明的思想做出的改进或变形应属于本发明的保护范围。

下述实施例中的超声波清洗器KQ218是昆山市超声仪器有限公司的产品。

下述实施例中的Piranha溶液是将浓H₂SO₄与30％(质量百分比浓度)H₂O₂水溶液混匀后得到的溶液，其中，浓H₂SO₄(北京化工厂生产的98％的浓硫酸)与30％H₂O₂水溶液的体积比为3:1。

下述实施例中的光导纤维(简称光纤，600μM芯径)是南京春辉科技实业有限公司的产品。

下述实施例中的三乙氧基硅烷(APTS)溶液为将APTS(Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为440140)与无水甲苯(北京化工厂的产品)混匀后得到的溶液，其中，APTS的体积分数为1％。

下述实施例中的BSA是Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为V900933。

下述实施例中的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法如下：将0.1mol/L的柠檬酸水溶液(柠檬酸C₆H₈O₇·H₂O：分子质量210.14，0.1mol/L，溶液为21.01克/升)与0.1mol/L的柠檬酸钠水溶液(柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O：分子质量294.12，0.1mol/L溶液为29.41克/毫升)按照体积比为103：97的比例混匀，即可得到0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

下述实施例中的杂交液是Thermo Scientific公司的产品，产品名称为PierceBupH Dry Blend Buffers Phosphate Buffered Saline(PBS)，产品目录号为28372。

下述实施例中的尿素溶液的溶剂为水，溶质为尿素和NaCl，溶质及在尿素溶液中的浓度为：尿素4M，NaCl 50mM。

实施例1、一种用BSA等电点封闭液构建可再生DNA杂交界面的方法

一、DNA光纤界面的制备

1、DNA修饰的光纤(DNA光纤)的制备

在DNA末端修饰氨基，经过多步骤活化使光纤表面带有醛基，将DNA末端的氨基和经初步修饰的光纤表面的醛基连接，得到DNA光纤。DNA光纤的具体制备过程如图2所示，具体步骤如下：

(1)DNA杂交制备dsDNA

将单链DNA分子NH₂-AG(终浓度为300nM)、与单链DNA分子NH₂-AG互补的单链DNA分子CT-Cy5.5(终浓度为300nM)和50mM>2-AG和单链DNA分子CT-Cy5.5的核酸序列如表1所示。表1中的A20-Cy5.5、CT-Cy5.5和NH₂-AG均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1本实例所涉及具体核酸名称与序列

将上述得到的ssDNA混合液和dsDNA溶液在日立U-3900紫外/可见分光光度计上进行吸光度测试(采用光程1cm的玻璃比色皿)。ssDNA混合液和dsDNA溶液紫外吸收光谱的变化情况如图1所示，从图中可以看出：和ssDNA混合液相比(杂交前的单链DNA溶液)，dsDNA溶液(杂交后的双链DNA溶液)中，位于258nm处的特征紫外峰峰位红移、峰值增大，符合预期，表明两条互补的DNA链段已杂交形成双链结构。

(2)用Piranha溶液浸泡光导纤维(目的是清洁光纤，并使光纤表面发生羟基化)，于110℃烘箱中加热1小时，加热后冷却至室温，然后用超纯水充分洗涤光纤至洗液中性，并用氮气吹干光纤，放于110℃烘箱中烘烤至少1个小时，得到Piranha溶液处理后的光纤；

(3)用三乙氧基硅烷(APTS)溶液(ATPS可与光纤表面羟基反应，并暴露出氨基官能团)浸泡Piranha溶液处理后的光纤2小时，然后将其浸于无水甲苯中超声清洁3分钟(超声清洁的仪器：超声波清洗器KQ218)，共超声清洁3次，再用无水甲苯溶液清洗光纤5次，后用氮气吹干，并将吹干后的光纤放入200℃烘箱中烘烤1小时，冷却，得到APTS处理后的光纤。

(4)将APTS处理后的光纤浸入体积分数为1％的戊二醛水溶液(醛基与APTS的氨基反应)中，在室温，50-100rpm的摇床中过夜反应，次日，用超纯水清洗5次，得到戊二醛处理后的光纤。

(5)将戊二醛处理后的光纤浸入1mL上述步骤(1)中制备的dsDNA溶液(醛基与dsDNA分子的氨基反应)中，在室温，50-100rpm的摇床中反应2小时，得到修饰dsDNA的光纤。

(6)向修饰dsDNA的光纤浸入20μL 1M甘氨酸水溶液(与光纤表面多余的醛基反应，以封闭醛基位点)中，在室温，50-100rpm的摇床中反应1小时，得到甘氨酸处理后的光纤。

(7)将甘氨酸处理后的光纤浸入20mg/mL的氰基硼氢化钠水溶液(将上述氨基和醛基形成的希夫碱结构还原为稳定的酰胺键)中，在室温，50-100rpm的摇床中反应1小时，然后用超纯水清洁光纤，并浸没在50mM NaCl水溶液中，得到修饰有DNA的光纤，于4℃保存。

2、对照组光纤的制备

将上述步骤1的(4)中的dsDNA溶液替换成50mM NaCl水溶液，其他步骤不变，得到对照组光纤。

二、检测BSA等电点封闭液对于对照组光纤的封闭效果

对传感界面进行封闭处理，从而保证非目标链段不会在界面产生过高的干扰信号，是实现DNA杂交的基础。利用步骤一的2制备的对照组光纤以及对照组核酸A₂₀-Cy5.5考察不封闭以及封闭液的不同对在光纤上引起的信号大小。具体步骤如下：

1、待测液的配制

将A20-Cy5.5溶解于杂交液中，得到A20-Cy5.5待测液，A20-Cy5.5的浓度为10nM。

2、对照组光纤的处理

根据是否用封闭液封闭和封闭液的不同分为如下各组：

(1)不封闭组：将对照组光纤作为不封闭组的光纤。

(2)BSA等电点封闭液组：将对照组光纤浸没于BSA等电点封闭液(BSA溶于0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液得到的溶液，BSA的浓度为2mg/mL，pH 4.6)中，于摇床中震荡摇匀4小时(37℃，rpm＝100)，得到BSA等电点封闭液组的光纤。

(3)BSA水溶液组：将对照组光纤浸没于BSA水溶液(BSA的浓度为2mg/mL，pH 6.75)中，于摇床中震荡摇匀4小时(37℃，rpm＝100)，得到BSA水溶液组的光纤。

(4)PSS组：将对照组光纤浸没于PSS水溶液(PSS的体积分数2％，PSS(MW500,000，Alfa Aesar，lot D09Z004))水溶液中，于摇床中震荡摇匀4小时(37℃，rpm＝100)，得到PSS水溶液组的光纤。

(5)PAA组：将对照组光纤浸没于PAA水溶液(PAA的体积分数2％，PAA(MW 3,000，MACKLIN))水溶液中，于摇床中震荡摇匀4小时(37℃，rpm＝100)，得到PAA水溶液组的光纤。

3、光纤检测

分别将步骤2中的不封闭组的光纤、BSA等电点封闭液组的光纤、BSA水溶液组的光纤、PSS水溶液处理后的光纤和PAA水溶液组的光纤装入倏逝波传感平台所配套的流动池内。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液(用水将杂交液稀释10倍后得到的溶液)冲洗光纤直至基线平稳；基线平稳后，开启蠕动泵，分别将A20-Cy5.5待测液泵入样品槽(进样15s，泵速为10)；之后停止蠕动泵，使A20-Cy5.5待测液在反应池内反应240s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液(质量分数0.5％SDS，pH 1.9)60s；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳后停止采样，保存数据。

检测结果如图3所示。由图3中的信号可见，BSA等电点封闭液组的信号值明显低于其他组，本发明的BSA等电点封闭液可有效降低非特异性链在光纤传感界面所引起的信号，其净信号仅为其他材料的6％～14％。可见BSA等电点封闭液可以有效抑制传感界面对非特异性链的非特异性吸附。

三、检测BSA等电点封闭液处理后的DNA界面对目标链段的杂交信号

除了保证非特异性链对传感界面的低程度吸附外，还需要进一步验证目标杂交链在传感界面引起的信号高低。选用修饰有DNA的光纤、以CT-Cy5.5为目标杂交核酸(CT-Cy5.5与修饰有DNA的光纤表面的核酸呈碱基互补，序列如表1所示)，以A₂₀-Cy5.5为对照组核酸(A₂₀-Cy5.5与修饰有DNA的光纤表面的核酸不互补，序列如表1所示)。具体步骤如下：

1、待测液的配制

(1)A20-Cy5.5待测液

将A20-Cy5.5溶解于杂交液中，得到A20-Cy5.5待测液，A20-Cy5.5的浓度为10nM。

(2)CT-Cy5.5待测液

将CT-Cy5.5溶解于杂交液中，得到CT-Cy5.5待测液，CT-Cy5.5的浓度为10nM。

2、光纤的处理

根据是否用BSA等电点封闭液进行封闭，分为如下两组：

(1)封闭组：将步骤一的1中的(6)获得的修饰有DNA的光纤浸没于BSA等电点封闭液(BSA溶于0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液得到的溶液，BSA的浓度为2mg/mL，pH 4.6)中，于摇床中震荡摇匀4小时(37℃，rpm＝100)，得到封闭液处理后的光纤。

将封闭液处理后的光纤浸没于DNA变性液(尿素溶液)，在室温，50-100rpm的摇床中反应1小时，得到封闭组的光纤。

(2)不封闭组：将步骤一的1中的(6)获得的修饰有DNA的光纤浸没于DNA变性液中，在室温，50-100rpm的摇床中反应1小时，得到不封闭组的光纤。

3、光纤检测

分别将步骤2中的封闭组的光纤和不封闭组的光纤装入倏逝波传感平台所配套的流动池内。在光纤检测过程中，首先用PBS缓冲液冲洗光纤直至基线平稳；基线平稳后，开启蠕动泵，分别将A20-Cy5.5待测液和CT-Cy5.5待测液泵入样品槽(进样15s，泵速为10)；之后停止蠕动泵，使A20-Cy5.5待测液在反应池内反应240s；再次开启蠕动泵，通入洗脱液(质量分数0.5％SDS，pH 1.9)60s；最后通入PBS缓冲液，至基线平稳后停止采样，保存数据。

目标杂交链和非目标链在不封闭组的光纤上所产生的信号结果如图4所示，从图中可以看出：目标杂交链和非目标链的信号值没有显著差异。目标杂交链和非目标链在封闭组的光纤上所产生的信号结果如图5所示。从图中可以看出：目标杂交链的信号值明显高于非目标链的信号值，其中目标杂交链所引起的净信号是非特异性链所引起净信号的28倍。可见BSA等电点封闭液可以有效促进目标核酸链与传感界面的杂交，提高传感界面对目标核酸链的特异性吸附。

四、DNA界面的可重复利用能力的检测

检测使用后，将步骤三中的封闭组的光纤在室温条件下保存于充满10mM PBS缓冲液的流动池内，保存一天后，按照上述步骤三中的方法用保存一天后的封闭组的光纤再次对CT-Cy5.5待测液进行检测。

结果如图6所示。从图6中可以看出：和保存前的杂交信号值相比，用保存一天后的封闭组的光纤得到的杂交信号值仅有4％下降，说明按照本发明的方法构建及封闭的DNA界面具备可再生(可重复利用)的能力。