一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法

摘要

一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法，先将梅花鹿角盘粉末在沸水中加热然后离心，重复多次提取，然后用胰蛋白酶解液进行酶解，煮沸使胰蛋白酶失活后，离心即可得到胶原水解肽，通过对传统的制备方法的改进，使最终的酶解混合物中小分子混合多肽的相对分子质量多集中在5kDa以下。本发明可为鹿角盘产品的深度开发提供可供参考的实验依据，更为促进吉林省鹿产业的发展具有积极的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物蛋白质技术领域，尤其涉及一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法。

背景技术

鹿角盘指的是雄性鹿在锯茸后残留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸长出前自动脱落的盘状物质，也命名为“鹿花盘”、“鹿角帽”，主要含有多种必需氨基酸及多种矿物质元素。鹿角盘呈盔状或扁盔状，直径2-5cm，高2-4.5cm，表面为灰黄色或灰褐色，呈蜂窝状，底面较平并富有一定光泽，上部呈现出不规则的半球形形状，质地较为坚硬，颜色呈灰白色。近些年来，对于鹿角盘的成分主要从以下几个部分进行研究，主要是氨基酸、无机元素、蛋白多肽类物质等等，同时也有少量报道称鹿角盘中含有甾体类、多糖类等物质。

张鹤比较了鹿骨与鹿角盘酶法提取物的蛋白含量，并通过探索酶与底物比例及酶解时间等因素优化了鹿角盘的酶解工艺，优化后工艺鹿角盘蛋白的收率高达22.31％。于文影通过正交分析等手段探索了梅花鹿角盘的最佳酶解用酶及酶解条件。赖海涛等人为使废弃物得到利用，利用酶解的办法提取烤鳗下脚料中存留的蛋白质，并通过正交试验确定了枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶的最佳酶解工艺，确定最佳水解酶为木瓜蛋白酶。

发明内容

为了得到相对分子质量较小的小分子混合多肽，本发明提供一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法。

一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法，按照下述步骤进行：

A、称取梅花鹿角盘粉末置于烧杯中，加入蒸馏水，在沸水浴中加热，加热过程中用玻璃棒不断搅拌，且不断用蒸馏水补充使提取匀浆体积维持恒定，4-6h后离心，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于烧杯中加入蒸馏水继续水浴提取，共提取4-5次，合并每次提取的上清液，合并时水浴加热5min并不断搅拌，即为梅花鹿角盘明胶提取液；

B、取梅花鹿角盘明胶提取液，按酶与梅花鹿角盘粉末1∶1250的比例加入适量的胰蛋白酶解液，37℃水浴条件下酶解50-70min，期间不断用玻璃棒轻轻搅拌，酶解后的明胶提取液马上于100℃沸水浴中煮沸3-8min使胰蛋白酶失活，沸水浴后的酶解液离心，取上清，即获得梅花鹿角盘胶原水解肽；

C、将梅花鹿角盘胶原水解肽液置于大培养皿内，真空冷冻干燥机冻干，得梅花鹿角盘胶原水解肽冻干品，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

优选的，所述的步骤A中，沸水浴后离心，离心条件为7000rpm，25℃，20min。

优选的，所述的步骤B中，沸水浴后的酶解液离心，离心条件为8000rpm，25℃，10min。

本发明所提供的梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法，先将梅花鹿角盘粉末在费用中加热然后离心，重复多次提取，然后用胰蛋白酶解液进行酶解，煮沸使胰蛋白酶失活后，离心即可得到胶原水解肽，通过对传统的制备方法的改进，使最终的酶解混合物中小分子混合多肽的相对分子质量多集中在5kDa以下。

本发明可为鹿角盘产品的深度开发提供可供参考的实验依据，更为促进吉林省鹿产业的发展具有积极的作用。

附图说明

图1为实施例1中蛋白标准曲线。

图2为实施例1中鹿角盘明胶的SDS-PAGE电泳结果图。

图3为实施例1中胶原水解肽的质谱分析图。

具体实施方式

实施例1

一种梅花鹿角盘胶原水解肽的制备方法，按照下述步骤进行：

A、称取100g梅花鹿角盘粉末置于2000mL烧杯中，加入1000mL蒸馏水，在沸水浴中加热，加热过程中用玻璃棒不断搅拌，且不断用蒸馏水补充使提取匀浆体积维持恒定，加热5h后离心(7000rpm，25℃，20min)，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于烧杯中加入1000mL蒸馏水继续水浴提取，共提取4次，合并4次上清液(合并时水浴加热5min并不断搅拌)，即为梅花鹿角盘明胶提取液；

B、取梅花鹿角盘明胶提取液100mL，按酶与底物1∶1250的比例加入适量的胰蛋白酶解液(底物指梅花鹿角盘粉末)，37℃水浴条件下酶解1h(期间不断用玻璃棒轻轻搅拌使酶与底物充分接触)，酶解后的明胶提取液马上于100℃沸水浴中煮沸5min(使胰蛋白酶失活)，沸水浴后的酶解液离心(离心条件为8000rpm，25℃，10min)，取上清，即获得梅花鹿角盘胶原水解肽；

C、将梅花鹿角盘胶原水解肽液置于大培养皿内，真空冷冻干燥机冻干，得梅花鹿角盘胶原肽冻干品，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

实施例2

明胶蛋白提取率的测定(BCA法)

取梅花鹿角盘明胶提取液20μL并用蒸馏水稀释至400μL(避免明胶提取液浓度大超出BCA法测定范围，故将原液稀释20倍)，作为待测样。BCA具体方法如下：

根据实验用量，将溶液A与溶液B按体积比50∶1混合均匀，即为BCA工作液。完全融化牛血清白蛋白标准品(BSA含量为5mg/mL)，取10μL用蒸馏水稀释至100μL(终浓度0.5mg/mL)，按0、1、2、4、8、12、16、20μL分别加到96孔板中并用蒸馏水补齐至20μL。向各加样孔中加入200μL工作液，60℃烘箱放置半小时，待冷却至室温后，用酶标仪在562nm处测定吸光值。以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵座标绘制标准曲线，按公式1计算除盐品中蛋白含量。

计算方法如下：

样品蛋白含量(％)＝查的样品蛋白含量×稀释倍数×100/样品质量(公式1)

表1 蛋白标准曲线制作

孔号12345678标准蛋白质溶液(μL)01248121620蒸馏水(μL)2019181612840BCA工作液(μL)200200200200200200200200

测试得到如下结果：

牛血清白蛋白标准品制作的标准曲线系数为0.994，酶标仪在562nm处测定的吸光值如表2所示。将待测品吸光值代入标准曲线(图1)查得相应蛋白含量，根据公式1计算得制备的梅花鹿角盘明胶蛋白的提取率为21.23％。

表2 样品及标准溶液光度值

实施例3

明胶蛋白的电泳检测(Tricine-SDS-PAGE法)

(1)垂直凝胶模具的固定：电泳所用玻璃板夹层宽度为1.0mm，用清水清洗玻璃板并用蒸馏水及去离子水润洗，将玻璃板固定于电泳槽中，坐于制胶夹上。

(2)凝胶的配制：16％分离胶的配制(4.5mL)：称取尿素1.60g置于干净小烧杯中，加1.874mL去离子水溶解，待尿素完全溶解后，向烧杯中依次加入1.333mL凝胶缓冲液、1.293mL胶贮备液II、20μL 10％过硫酸铵和2.0μL TEMED。用移液枪轻轻吹打使分离胶混合均匀后，灌胶至适当高度，并用移液枪吸取1mL异丙醇灌入(压胶并消除气泡)，室温下凝固1h。5％浓缩胶的配制(2.5mL)：向干净的小烧杯中依次加入1.420mL去离子水、0.830mL凝胶缓冲液、0.250mL胶贮备液I、25μL 10％过硫酸铵和2.5μL TEMED，移液枪反复吹打使浓缩胶液混合均匀，待用。用滤纸除去分离胶上层的异丙醇后，灌入浓缩胶并插入制胶梳子，室温下凝固40min。待浓缩胶凝固后，轻轻拔掉制胶梳子，将电泳槽取下并放入电泳槽中，向电泳槽内槽注入负极缓冲液，电泳槽外槽注入正极缓冲液。

(3)样品处理和电泳：取梅花鹿角盘明胶提取液20μL并用蒸馏水稀释至400μL，作为电泳样品。样品同电泳Marker共同沸水浴处理5min后，上样(蛋白Marker 10μL，样品25μL)。电泳起始电压为80V，当溴酚蓝指示线迁移至浓缩胶与分离胶分界线时将电压调至120V，待溴酚蓝指示线迁移至距离分离胶底0.5cm处时，关闭电泳仪，停止电泳。

(4)染色和脱色：将胶片转移至干净大培养皿中，于摇床上用染色液(考马斯亮蓝R-250)染色5h，倒去染色液并用蒸馏水清洗胶片后，脱色液脱色至背景干净为止。胶片于紫外成像仪中拍照并保存。

测试结果如下：如图2所示，电泳显示热提取的梅花鹿角盘明胶蛋白的相对分子质量集中在200.0kDa至14.3kDa之间，且分布十分密集(说明明胶中的蛋白质种类较多、含量较高)。

实施例4

胶原水解肽的质谱检测

由于酶解不会使原有的大量蛋白消失而只会使蛋白变成更多的多肽，结合图2梅花鹿角盘明胶蛋白的电泳结果，我们分析酶解后的梅花鹿角盘胶原水解肽通过SDS-PAGE电泳检测不能完全显示出来，尤其是低分子量的肽。因此，采用质谱检测梅花鹿角盘胶原水解肽。梅花鹿角盘胶原肽的质谱检测结果如图3所示，与我们的分析相符，证明了梅花鹿角盘胶原肽的相对分子质量集中在5kDa以下。

抗菌性能对比测试：

本发明采用纸片扩散法对本发明制备的胶原水解肽和张鹤在《梅花鹿胶原蛋白制备及治疗骨质疏松症作用研究》中公开的胶原水解肽的抑菌活性进行初步探讨，试验评定结果通过测量各抑菌剂产生的抑菌环直径来进行，可初步判断各制备品抑菌能力的强弱。具体步骤如下：

将小培养皿、镊子、去离子水、圆形滤纸片、移液枪等抑菌试验所用物品放入超净工作台中，开启紫外灭菌30min。紫外照射后，点燃酒精灯并用酒精棉反复擦拭台面及试验所用器具。取四个干净小培养皿置于酒精灯附近，分别标记为阳性对照组、阴性对照组(阴性对照组为去离子水)、A组和B组，并向各组培养皿中放入圆形滤纸片若干。按照分组，用移液枪取对应的抑菌剂浸润到对应的滤纸片上，平均每个滤纸片浸润10μL对应的抑菌剂，待滤纸片干燥后才可进行贴片。在等待滤纸片干燥的过程中，融化固体培养基并分装于若干干净小培养皿中(每个小培养皿中20mL培养基)。待固体培养基充分凝固且温度接近于室温后，取活化后的菌液200μL均匀涂布于固体培养基中，待涂布均匀后贴片。贴片后的各固体培养基用封口膜封住周边且做好标记，倒置培养。白色念珠菌需在30℃培养箱中倒置培养18～20h，其余革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均在37℃培养箱中倒置培养16～18h。倒置培养完毕后，用游标卡尺测量各抑菌剂的抑菌环直径并记录，并拍照保存。

抑菌试验的具体分组如下：

A组：取本发明制备的胶原水解肽冻干品10mg，用1mL去离子水充分溶解并分装后，于-20℃冰箱中保存备用。

B组：取张鹤实验方法制备的胶原水解肽冻干品10mg，用1mL去离子水充分溶解并分装后，于-20℃冰箱中保存备用。

AMP阳性对照组：取氨苄青霉素10mg，用1mL去离子水充分溶解并分装后，于-20℃冰箱中保存备用。

阴性对照组：去离子水。

表1：各菌抑菌环直径测试数据。

由以上测试数据可以知道，本发明制备的胶原水解肽和张鹤报道的胶原水解肽的抑菌活性要好，尤其是革兰氏阳性菌的抑菌效果要好很多。

综上所述：

本发明利用胰蛋白酶为水解酶，采用热提法及多次浸提等手段是为了增加梅花鹿角盘的蛋白提取率，经BCA法测定蛋白提取率高达21.23％。说明鹿角盘中总蛋白的含量较高。酶解时不同的酶用量会产生不同的酶解产物，酶用量越多，酶解混合物中氨基酸及短肽的相对丰度也就越大，因此根据需要控制酶用量是十分关键的。本发明根据前期工作基础，将酶与底物比例选为1∶1250，最后通过质谱方法检测确定酶解混合物中小分子混合多肽的相对分子质量多集中在5kDa以下，符合预期目标。

近年来，酶解技术由于其反应条件温和、易控制、操作简单、后续步骤少等优点被广泛应用于小分子蛋白质、多肽混合物的制备。胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等是酶解技术中经常用到的酶。

本发明通过酶解技术获得的胶原水解肽与背景技术中的研究结果相一致，但所得胶原水解肽的相对分子质量显著低于张鹤等人报道，其原因可能是本实验中使用的酶与底物的比例不同所致。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。