从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法及该超氧化物歧化酶

摘要

本发明提供了一种从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法及该超氧化物歧化酶，以猪血为原料在提取、分离超氧化物歧化酶过程中，不使用任何有机溶剂，避免了环境污染和对酶活性的毒害，并使生产工艺简化。该方法，在超氧化物歧化酶纯化过程中，使用月桂酰氯作为保护剂，将超氧化物歧化酶保护起来，以避免热、酸、碱对超氧化物歧化酶的破坏作用，并结合热变性和等电点沉淀技术，使超氧化物歧化酶粗品得到进一步提纯和精制，具有生产周期短、成本低、更适合工业化规模生产的特点。所制备的超氧化物歧化酶，活性高，单位酶活力达到4500U/mg干粉以上。

说明书

技术领域

本发明涉及有机物分离纯化领域，具体而言，涉及一种从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法及该超氧化物歧化酶。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)，是存在于生物体内的一种至关重要的抗氧化酶，是国际上公认的超氧阴离子氧自由基(O^2-)的专一清除剂，它对平衡机体氧化与抗氧化系统，免除自由基损伤起着至关重要的作用。SOD对人体的功效可归之为“一清四抗”：“一清”即有效清除机体内的超氧阴离子氧自由基，保护人体细胞免氧自由基的毒害；“四抗”即抗衰老、抗疾病、抗辐射和抗疲劳。

近年来，以动物血液为原料制取超氧化物歧化酶(SOD)的技术取得了很大的进步，有些已经实现规模化生产，其中不少已申请了发明专利，例如CN03106275.X公开了一种动物血快速提取超氧化物歧化酶的新方法，该方法在新鲜的动物血中加入酒精和氯化铜去除血红蛋白等杂蛋白，再通过丙酮分级沉淀，冷冻干燥制取SOD成品；CN200410041723.2公开了一种超氧化歧化酶的制备方法，该方法采用新鲜猪血块为原料，包括加入氯化铜进行热变性反应、乙醇-氯仿萃取、丙酮分级沉淀、柱层析纯化、透析以及冻干等复杂工艺流程，最后获得浅蓝色的Cu,Zn-SOD。CN200410071087.8公开了一种用动物血液提取超氧化歧化酶的新方法，该方法采用动物血液加入柠檬酸钠抗凝，不经过离心处理，直接在全血液中加入保护剂葡萄糖、氯化铜、氯化钠进行热变性去除杂蛋白，然后经丙酮溶剂分级分离、再经冷冻干燥得到SOD冻干粉。CN200810148899.6公开了一种超氧化歧化酶的制备方法，该方法在动物凝血块中加入蛋白质沉淀剂去杂蛋白，再经过滤、离心、超滤、冻干，得到冻干粉。CN201110228061.X公开了一种从动物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工艺，该新工艺主要包括溶血、热变性、超滤浓缩、丙酮分级沉淀、离子交换柱层析等步骤得到SOD精品。

现有的动物血球液提取SOD技术方案基本上都使用了有害的化学试剂和有机溶剂，这一方面给产品和环境带来二次污染，生产成本高，操作难度大，另一方面在萃取SOD之后的优质血红蛋白被严重污染，无法综合利用，造成资源浪费。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，以解决现有通过动物新鲜血液制备超氧化物歧化酶的制备方法中，均采用有害的化学试剂和有机溶剂、带来二次污染的问题，所述的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，该工艺以丰富的猪血为原料，通过无机酸碱调节pH并超滤浓缩，具有工艺简单、成本低、绿色环保、易于实施等优点。

本发明的第二目的在于提供一种所述的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法所制备的超氧化物歧化酶，该超氧化物歧化酶冻干粉，具有高附加值、高生物活性等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤：

(1)、在新鲜猪血中加入柠檬酸钠做抗凝处理，离心后收集血红细胞，即得到血球液，加水搅拌得到溶血液；

(2)、用酸调节步骤(1)中的溶血液的pH至5.2～5.5，升温至60～65℃并保温，然后降温并进行过滤，得到滤液；

(3)、用碱调节步骤(2)中的滤液的pH值至6.2～6.5，升温至70～75℃并保温，然后降温并过滤，得到滤液；

(4)、将步骤(3)得到的滤液进行超滤浓缩，得到SOD粗酶溶液，将SOD粗酶溶液加热升温，用碱调整pH值至8.5～9.0，并滴加保护剂A并保温，保温后冷却，离心收集上清液，即得SOD酶液；

(5)、向步骤(5)中的SOD酶液加入保护剂B，搅拌混匀后，冷冻干燥，得到SOD冻干粉。

本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，不使用任何有机溶剂，避免了环境污染和对酶活性的毒害，并使生产工艺简化。与目前许多专利报道的硫酸铵盐析法、丙酮分级沉淀法、离子交换树脂或分子筛柱层析法等纯化方法相比，具有生产周期短、成本低、更适合工业化规模生产的特点。

本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，在步骤(1)中，要选用检验合格的新鲜猪血，加入柠檬酸钠做抗凝处理，柠檬酸钠的质量为猪血质量的0.5～1.0％，柠檬酸钠具有良好的金属离子络合能力，可以与Ca²⁺、Mg²⁺和Fe²⁺等金属离子结合成可溶性络合物，使这些离子失去形成不溶性的络合物的机会，从而减缓凝固作用。离心分离得到血球液和血浆液，血浆液经喷雾干燥制成血浆蛋白粉。在步骤(2)中和步骤(3)中，先调节溶血液至5.2～5.5，再调节至6.2～6.5，然后进行升温、保温、降温的操作，在操作过程中，升温和降温都要迅速进行，在尽量短的时间内完成升温和降温，以防止猪血质变，影响所得到的超氧化物歧化酶冻干粉。在步骤(4)中，进行超滤浓缩，得到SOD粗酶溶液，将SOD粗酶溶液加热升温，用碱调整pH值至8.5～9.0，并加入保护剂，保护剂的作用为避免热、酸、碱对SOD的破坏作用。并结合热变性和等电点沉淀技术，使SOD粗品得到进一步提纯和精制，与目前许多专利报道的硫酸铵盐析法、丙酮分级沉淀法、离子交换树脂或分子筛柱层析法等纯化方法相比，具有生产周期短、成本低、更适合工业化规模生产的特点。

优选的，在步骤(2)中，所述酸为盐酸、硫酸或者磷酸中的一种，更优选的酸为盐酸。

酸用来调节溶液的pH值，本申请采用无机酸，不添加有机酸。

优选的，在步骤(2)中，在所述升温至60～65℃并保温，然后降温并过滤，得到滤液的过程中，具体包括以下步骤：升温至60～65℃并保温30～60分钟后，降温至45℃以下，然后进行板框压滤机压滤，得到压滤滤液。

降温到45℃以下要迅速，并采用板框压滤机压滤，提高过滤的效率。

优选的，在步骤(3)和步骤(4)中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或者氢氧化钙中的一种，更优选为氢氧化钠。

碱用来调节溶液的pH值，本申请采用无机碱。

优选的，在步骤(3)中，在所述升温至70～75℃并保温，然后降温并过滤，得到滤液的过程中，具体包括以下步骤：

升温至70～75℃并保温20～30分钟后，降温至35～45℃，然后进行板框压滤机压滤，得到压滤滤液。

优选的，在步骤(4)中，所述超滤浓缩采用分子量为10000Da的超滤膜装置超滤浓缩，浓缩至步骤(3)滤液体积的1/5～1/10。

优选的，在步骤(4)中，所述升温的过程升温至45～50℃。

优选的，在步骤(4)中，在所述滴加保护剂A并保温，保温后冷却，离心收集上清液的过程中，具体包括以下步骤：

滴加SOD粗酶溶液质量0.01％～0.03％的月桂酰氯并保温1～2小时，保温后冷却至20℃以下，离心收集上清液；

更优选的，所述离心的转速为5000～10000r/min，时间为5～10分钟。

优选的，在步骤(5)中，所述保护剂B为海藻糖、乳糖和甘露醇中的一种或多种的组合；

更优选的，所述保护剂B的添加量为步骤(4)中SOD酶液质量的2.5～3％。

海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α,α)、异海藻糖(β,β)和新海藻糖(α,β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。

乳糖为白色的结晶性颗粒或粉末；无臭，味微甜。作为粉状食品色素的吸附分散剂，降低色素浓度，便于使用并降低贮藏期间的变色。

甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是C₆H₁₄O₆，分子量为182.17。易溶于水，为白色透明的固体，有类似蔗糖的甜味。具有防粘结作用。

如上所述的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法所制备的超氧化物歧化酶冻干粉。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同可分为铜锌SOD、锰SOD和铁SOD三种。

SOD能催化清除超氧阴离子自由基的反应。自由基是具有不配对价电子的原子或原子团，分子或离子构成。在正常生理状况下，生物体内不断地产生自由基，自由基的产生与清除处于平衡状态。但在某些病理情况下，自由基产生量多时，就会对DNA、蛋白质和脂类等生物大分子造成损伤,导致机体疾病的产生。由于自由基具有高度的化学活性,是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，自由基攻击生物大分子导致组织损伤是许多疾病发生发展的根源。因而SOD在防御生物体免受超氧阴离子自由基损伤，抗辐射，抗肿瘤及延缓机体衰老等方面具有重要的作用。

SOD具有清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基的作用，可以延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，即延缓皮肤衰老和脂褐素沉淀的出现。衰老自由基学说认为衰老是来自机体正常代谢过程中所产生的自由基随机附带破坏性的作用结果，自由基引起机体衰老的主要机制可概括为以下三方面：(1)减少生物大分子的交联聚合和脂褐素的堆积；(2)减缓器官组织细胞的损伤与减少；(3)防止免疫能力的降低。

SOD可以提高人体对自由基损伤而诱发疾病的抵抗力自由基损伤而诱发疾病的抵抗力主要包括肿瘤、炎症、肺气肿、白内障和自身免疫疾病等当SOD作为功能性食品基料加入食品中时，可有效抑制许多疾病的发生、发展，对人体健康有极大作用。

SOD可以提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，如烟雾、辐射、有毒化学品和有毒药品等增强机体对外界环境的适应能力。电离辐射引起生物体内生成O^2-、OH等自由基。·OH对机体损伤作用大且其产生部位常为其作用部位，故远离·OH产生部位的生物大分子受损的机会小。O^2-的损伤作用虽远小于·OH，但可从产生部位扩散到其他部位，并在铁离子鳌合剂存在下与H反应生成·OH，从而造成DNA、生物膜等损伤。烟雾、有毒化学品和药品也产生过量的O^2-损伤机体，SOD同样可以减少这些损伤。

SOD还可以清除机体疲劳，增强对超负荷大运动量的适应力的作用。在超负荷大运动量过程中，机体中部分组织细胞会交替出现暂时性缺血及重灌流现象，引起缺血后重灌流损伤，加之乳酸量的增加，导致肌肉的疲劳与损伤。若在运动前供给SOD，则可保护肌肉避免出现上述现象。单次强烈运动可使体内自由基水平明显升高，过量的自由基作为引发剂攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸造成脂质过氧化，引起膜流动性下降，脆性增强。过氧化脂质的一个特征是生成丙二醛，形成磷脂之间的交联，也可与血红蛋白形成褐色产物。机体经剧烈运动后，ATP含量有所降低肌酸激酶活力暂时下降，AMP含量升高，在腺嘌呤转氨酶的作用下促使IMP增高，然后在核苷酸酶和核苷酶的作用下，生成次黄嘌呤，运动后过量的次黄嘌呤在次黄嘌呤氧化酶的作用下，形成过量的O^2-。因此，补充外源SOD能够有效抑制运动引起的细胞损伤。

SOD的作用原理为，超氧阴离子(O^2-)是生物体内主要的自由基，很多情况下O^2-对机体是有害的，它也是导致衰老的原因之一。而SOD是一类重要的清除氧自由基的抗氧化酶，它能催化O^2-使其发生歧化反应，生成O₂和H₂O₂；H₂O₂又在过氧化氢酶(CAT)的作用下，生成无毒的H₂O和O₂，从而起到抗衰老作用。

本申请所制备的超氧化物歧化酶，活性高，单位酶活力达到4500U/mg干粉以上。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，以猪血为原料在提取、分离SOD过程中，不使用任何有机溶剂，避免了环境污染和对酶活性的毒害，并使生产工艺简化。

2)、本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，在SOD纯化过程中，使用月桂酰氯作为保护剂，将SOD保护起来，以避免热、酸、碱对SOD的破坏作用，并结合热变性和等电点沉淀技术，使SOD粗品得到进一步提纯和精制，具有生产周期短、成本低、更适合工业化规模生产的特点。

3)、本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法所制备的超氧化物歧化酶，活性高，单位酶活力达到4500U/mg干粉以上。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

(1)、采集经过检验合格的新鲜猪血1000L，在新鲜猪血中加入其质量0.5％的食品级柠檬酸钠做抗凝处理，采用管式离心机16300r/mim，连续分离离心后收集血红细胞，即得到血球液420L，血浆液580L，加入与血球液等体积的水搅拌60分钟，得到840L溶血液；

(2)、用HCl调节步骤(1)中的溶血液的pH至5.2，快速升温至60℃并保温50分钟，然后快速降温至45℃以下，并经板框压滤机压滤，得到滤液560L；

(3)、用NaOH调节步骤(2)中的滤液的pH值至6.2，快速升温至70℃并保温20分钟，然后快速降温至40℃以下，，经板框压滤机压滤，得到滤液465L；

(4)、将步骤(3)得到的滤液经截留分子量为10000Da的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/10，得到SOD粗酶溶液46L，将SOD粗酶溶液加热升温至45℃，用碱调整pH值至9.0，并滴加其质量0.02％的月桂酰氯并保温1小时后，快速冷却至20℃以下，5000r/min离心10min，收集上清液，即得蓝绿色的SOD酶液；

(5)、向步骤(5)中的SOD酶液加入其质量2.5％的海藻糖，搅拌混匀后，冷冻干燥，得到55g淡蓝绿色的SOD冻干粉。

实施例2

(1)、采集经过检验合格的新鲜猪血1000L，在新鲜猪血中加入其质量0.6％的食品级柠檬酸钠做抗凝处理，采用管式离心机16300r/mim，连续分离离心后收集血红细胞，即得到血球液450L，血浆液550L，加入与血球液等体积的水搅拌40分钟，得到900L溶血液；

(2)、用HCl调节步骤(1)中的溶血液的pH至5.5，快速升温至60℃并保温40分钟，然后快速降温至45℃以下，并经板框压滤机压滤，得到滤液610L；

(3)、用NaOH调节步骤(2)中的滤液的pH值至6.3，快速升温至70℃并保温25分钟，然后快速降温至45℃以下，经板框压滤机压滤，得到滤液520L；

(4)、将步骤(3)得到的滤液经截留分子量为10000Da的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/10，得到SOD粗酶溶液52L，将SOD粗酶溶液加热升温至45℃，用碱调整pH值至9.0，并滴加其质量0.03％的月桂酰氯并保温1小时后，快速冷却至20℃以下，5000r/min离心10min，收集上清液，即得蓝绿色的SOD酶液；

(5)、向步骤(5)中的SOD酶液加入其质量2.5％的乳糖，搅拌混匀后，冷冻干燥，得到51g淡蓝绿色的SOD冻干粉。

实施例3

(1)、采集经过检验合格的新鲜猪血2000L，在新鲜猪血中加入其质量1.0％的食品级柠檬酸钠做抗凝处理，采用管式离心机16300r/mim，连续分离离心后收集血红细胞，即得到血球液930L，血浆液1070L，加入与血球液等体积的水搅拌60分钟，得到1860L溶血液；

(2)、用磷酸调节步骤(1)中的溶血液的pH至5.3，快速升温至65℃并保温50分钟，然后快速降温至45℃以下，并经板框压滤机压滤，得到滤液1230L；

(3)、用KOH调节步骤(2)中的滤液的pH值至6.5，快速升温至75℃并保温30分钟，然后快速降温至45℃以下，经板框压滤机压滤，得到滤液1050L；

(4)、将步骤(3)得到的滤液经截留分子量为10000Da的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/10，得到SOD粗酶溶液100L，将SOD粗酶溶液加热升温至45℃，用碱调整pH值至9.0，并滴加其质量0.02％的月桂酰氯并保温1小时后，快速冷却至20℃以下，5000r/min离心10min，收集上清液，即得蓝绿色的SOD酶液；

(5)、向步骤(5)中的SOD酶液加入其质量2.5％的乳糖，搅拌混匀后，冷冻干燥，得到107g淡蓝绿色的SOD冻干粉。

实施例4

(1)、采集经过检验合格的新鲜猪血2000L，在新鲜猪血中加入其质量0.7％的食品级柠檬酸钠做抗凝处理，采用管式离心机16300r/mim，连续分离离心后收集血红细胞，即得到血球液930L，血浆液1070L，加入与血球液等体积的水搅拌60分钟，得到1860L溶血液；

(2)、用磷酸调节步骤(1)中的溶血液的pH至5.5，快速升温至65℃并保温30分钟，然后快速降温至45℃以下，并经板框压滤机压滤，得到滤液1130L；

(3)、用KOH调节步骤(2)中的滤液的pH值至6.5，快速升温至70℃并保温20分钟，然后快速降温至45℃以下，经板框压滤机压滤，得到滤液1050L；

(4)、将步骤(3)得到的滤液经截留分子量为10000Da的超滤膜装置进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/5，得到SOD粗酶溶液210L，将SOD粗酶溶液加热升温至50℃，用碱调整pH值至8.5，并滴加其质量0.03％的月桂酰氯并保温1小时后，快速冷却至20℃以下，10000r/min离心5min，收集上清液，即得蓝绿色的SOD酶液；

(5)、向步骤(5)中的SOD酶液加入其质量3％的乳糖，搅拌混匀后，冷冻干燥，得到107g淡蓝绿色的SOD冻干粉。

实验例1超氧化物歧化酶冻干粉酶活性测试

对本申请实施例1～4所提供的超氧化物歧化酶冻干粉进行酶活性测试，并与申请号为CN201110228061.X的专利进行对比。实验结果如表1所示。

表1超氧化物歧化酶冻干粉进行酶活性测试结果

实验证明，本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法所制备的超氧化物歧化酶，活性高，单位酶活力达到4500U/mg干粉以上。

综上所述，本申请所提供的从猪血中提取超氧化物歧化酶的方法，以猪血为原料在提取、分离SOD过程中，不使用任何有机溶剂，避免了环境污染和对酶活性的毒害，并使生产工艺简化。该方法，在SOD纯化过程中，使用月桂酰氯作为保护剂，将SOD保护起来，以避免热、酸、碱对SOD的破坏作用，并结合热变性和等电点沉淀技术，使SOD粗品得到进一步提纯和精制，具有生产周期短、成本低、更适合工业化规模生产的特点。所制备的超氧化物歧化酶，活性高，单位酶活力达到4500U/mg干粉以上。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。