细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种诊断细粒棘球蚴病的多表位融合抗原蛋白及其制备方法和应用，本发明通过筛选具有细粒棘球蚴免疫原性的蛋白基因，利用生物信息学手段分析抗原基因编码蛋白的优势线性抗原表位，将抗原表位按照一定顺序串联，构建含有多表位融合抗原基因Eg‑meAg1，并在大肠杆菌中表达，得到具有诊断价值的强反应原性的重组抗原蛋白Eg‑meAg1。本发明所制备的细粒棘球蚴重组多表位融合抗原Eg‑meAg1的具有很高的特异性和敏感性，是一种有价值的Eg感染诊断抗原，为动物细粒棘球蚴病(包虫病)的诊断提供一个抗原蛋白制备的新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种Eg(细粒棘球绦虫，Echinococcus granulosus)感染诊断的抗原蛋白，尤其涉及一种细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细粒棘球蚴病呈世界性分布，在中东、中亚、拉丁美洲、澳大利亚和南欧等国家广泛流行，在我国21个省(市)自治区也流行此病，尤以新疆、甘肃、宁夏、青海、西藏、四川和内蒙古等省的牧区或半牧区流行最为严重。

由于动物感染棘球蚴致使我国畜产品经济损失30亿元以上，严重影响了畜牧业的生产与发展。

Eg(细粒棘球绦虫，Echinococcus granulosus)在分类学上属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、带科、棘球属，幼虫期为细粒棘球蚴。Eg基因组全长151.6Mb，编码11 325个蛋白，其中含有2 231个转运蛋白和1 748个分泌性蛋白。在细粒棘球蚴基因组中，GC含量约占42.1％，与其他寄生蠕虫相比，细粒棘球蚴染色体中GC含量最高。细粒棘球蚴含有完整的糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环，但缺乏从头合成嘧啶、嘌呤及大多数氨基酸(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸除外)的能力，因此，需要依赖宿主提供必需的营养物质来满足自身的生存。Eg具有潜力价值的血清学诊断抗原31种(如蛋白酶抑制剂、四跨膜蛋白(Tetraspanin，TSP)、内质网膜蛋白(Reticulon,RTN)、AgB和Eg95)。

目前，血清学检测是诊断动物感染Eg的重要方法之一。筛选和鉴定特异性高和反应原性强的Eg抗原是研发Eg诊断试剂的关键。

已有研究表明，Eg囊液诊断抗原虽具有较高的敏感性，但特异性较差，与其他绦虫病血清发生高度交叉反应；Eg重组单一蛋白抗原虽具有较高的特异性，但反应原性较弱。因此，有必要开展细粒棘球蚴诊断性抗原的研制，进而建立特异性强和敏感性高的畜牧细粒棘球蚴病的诊断方法，为以后该病的防治提供参考。

发明内容

本发明主要目的是提供一种诊断细粒棘球蚴病的多表位融合抗原蛋白及

其制备方法和应用。

本发明所述的诊断细粒棘球蚴病的多表位融合抗原蛋白，其氨基酸序列为<210>1。

进一步地，该多表位融合抗原蛋白经过密码子优化，在密码子未优化的核苷酸序列如序列<210>2所示，密码子优化后的核苷酸序列如<210>3所示。

本发明的多表位融合抗原蛋白基因是通过以下过程实现的：

A、抗原基因的克隆；

B、抗原蛋白T细胞表位的预测；

C、多表位融合抗原基因的构建；

D、多表位融合抗原基因在的表达和纯化。

步骤A的具体操作为：选择细粒棘球蚴Ag B、TSP1、TSP6和RTN4基因，根据cDNA序列分别设计特异性引物，制作RNA模板，分别进行RT-PCR扩增，将PCR产物克隆到pMD19-T载体，测序后对上述基因序列进行生物信息学分析。

所述的特异性引物如下：

步骤B的具体操作为：步骤B的具体操作为：对细粒棘球蚴Ag B、TSP1、TSP6、RTN4和Eg95基因所编码氨基酸序列的抗原表位进行预测分析，分别采用四种不同的预测方法，寻找出其存在共同优势线性抗原表位的序列。

步骤C的具体操作为：通过编码柔性氨基酸的核苷酸序列将步骤B所得编码优势抗原表位的基因串联在一起，构成一个具有多表位融合抗原基因的串联体Eg-meAg1，然后对融合抗原基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成如序列<210>3所示的多表位融合基因，其不含有大肠杆菌稀有密码子。

步骤C中所述编码柔性氨基酸的核苷酸序列为：GGCCCGGGC。

步骤D的具体操作为：通过标准的分子克隆技术构建pMD19-T-Eg-meAg1重组质粒，采用EcoR I和Xho I分别对pMD19-T-Eg-meAg1质粒和pET-28a(+)质粒进行双酶切，采用T4 DNA连接酶构建一个pET-28a(+)-Eg-meAg1重组质粒，将该质粒转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有Kana抗性的固体LB平板上培养，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序并进行双酶切验证，

将鉴定后的pET-28a(+)-Eg-meAg1重组表达质粒转化至表达工程菌E.coli BL21中培养，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有Kana抗性的液体LB培养基中进行诱导，诱导收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用细粒棘球蚴阳性血清作为一抗，进行Western>

上述多表位融合抗原蛋白可以应用在制备诊断绵羊细粒棘球蚴病的药物中。

本发明对Eg重要基因进行克隆，通过生物学软件对Eg重要抗原基因所编码氨基酸的序列进行优势抗原表位分析，将具有优势抗原表位的氨基酸序列通过柔性氨基酸串联，构建了一个含有多表位融合基因Eg-meAg1，并采用原核表达工程菌对该融合基因进行表达，对其反应原性进一步验证与分析，获得了具有良好反应原性的抗原蛋白Eg-meAg1；然后以多表位融合抗原Eg-meAg1为包被抗原，建立了检测Eg特异性抗体的间接ELISA方法，评估该多表位抗原蛋白的潜力。本发明所制备的细粒棘球蚴重组多表位融合抗原Eg-meAg1的具有很高的特异性和敏感性，是一种有价值的Eg感染诊断抗原，为建立特异性强和敏感性高的绵羊细粒棘球蚴病的诊断方法奠定基础。

附图说明

图1是本发明实施例1重组质粒pET-28a(+)-Eg-meAg1的PCR和双酶切鉴定结果示意图。

其中：A表示重组质粒pET-28a(+)-Eg-meAg1的PCR，M表示DNA标志物，B表示重组质粒pET-28a(+)-Eg-meAg1的双酶切鉴定。

图2是本发明实施例2重组多表位融合蛋白Eg-meAg1的SDS-PAGE和Westernblot分析结果示意图。

其中：M表示蛋白分子量标准，

1:超声处理后的重组菌上清液(supernatant after sonication)；

2-4:IPTG分别诱导4,6和8小时的pET-28a(+)-Eg-meAg1(pET-28a(+)-Eg-meAg1 with IPTG induction for 4,6 and 8h,respectively)；

5:对照载体pET-28a(+)[control vector pET-28a(+)]；

6:未诱导的pET-28a(+)-Eg-meAg1(pET-28a(+)-Eg-meAg1 non-expressed)；

7-8:纯化的融合蛋白(purified fusion protein)；

9:纯化的融合蛋白的Western blot印迹分析(the Western blot analysis of purified fusion protein)。

具体实施方式

实施例1：

本实施例以新疆牧场绵羊为标本，无菌培养并收集绵羊Eg头节，其他原材料通过购买试剂盒等所得。

1、Eg重要抗原基因的克隆

根据Eg AgB(AY871041.1)、TSP1(EG_11043)、TSP6(EG_00715)和RTN4(EG_04657)基因cDNA序列分别设计特异性引物，以绵羊Eg头节为总RNA模板，分别进行RT-PCR扩增。将PCR产物克隆到pMD19-T载体，测序后对上述基因序列进行生物信息学分析。

2、Eg抗原蛋白T细胞表位的预测分析

利用生物在线软件对Eg重要基因(AgB、TSP1、TSP6、RTN4和Eg95)所编码氨基酸序列的抗原表位进行预测分析，综合四种不同的预测方法寻找出存在共同优势线性抗原表位的序列(表1)。

表1细粒棘球蚴重要抗原蛋白的优势线性抗原表位序列

3、Eg多表位融合抗原基因的构建方法

通过编码柔性氨基酸(GPG)的核苷酸序列(GGCCCGGGC)将编码优势抗原表位的基因串联在一起，构成一个具有多表位融合抗原基因的串联体并命名为Eg-meAg1。经过稀有密码子在线软件(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸替换大肠杆菌的稀有密码子，使最终合成的多表位融合基因中不含有大肠杆菌稀有密码子(见序列表)，易于重组蛋白在大肠杆菌中表达。

4、Eg多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达

通过标准的分子克隆技术构建pMD19-T-Eg-meAg1重组质粒，采用EcoR I和Xho I分别对pMD19-T-Eg-meAg1质粒和pET-28a(+)质粒进行双酶切，采用T4 DNA连接酶构建一个pET-28a(+)-Eg-meAg1重组质粒。将该质粒转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有Kana抗性的固体LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落送至华大基因生物公司测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证。

将鉴定正确的pET-28a(+)-Eg-meAg1重组表达质粒转化至表达工程菌E.coli BL21中，37℃培养12h，挑取菌落并用PCR进行筛选，将筛选出的阳性菌转接到含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃培养至OD_600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导8h后收集菌液，同时设置空载体对照和未加IPTG诱导的重组菌作为对照，进行SDS-PAGE电泳分析；同时用绵羊细粒棘球蚴阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗绵羊IgG(EarthOx,USA)为二抗，进行Western>

5、Eg-meAg1多表位融合抗原的纯化

按照Ni-NTA Purification System(Invitrogen,USA)说明书进行蛋白的纯化。Ni柱纯化的重组蛋白Eg-meAg1终浓度为30mg/mL。

实施例2：

1、基于Eg-meAg1抗原蛋白建立间接ELISA方法及条件的优化

(1)最佳工作条件的确定：用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液对纯化的蛋白进行稀释，抗原按64、32、16、8、4和2ug/mL依次作倍比稀释，包被96孔ELISA板，每孔包被100μL。包被条件：ELISA板包被好后，4℃过夜，取出，PBST洗涤3次，每次3min；选用1％明胶、5％脱脂奶粉和5％BSA为封闭液，200μL/孔，37℃分别封闭0.5h、1h、1.5h和2h，洗涤3次；Eg阳性血清分别做1:50、1:100和1:200倍比稀释，100μL/孔，血清作用时间设定为1h，同一样品作3个重复孔，同时作一空白对照孔，洗涤3次；酶标抗体先进行1:2 500、1:5 000和1:10 000稀释，100μL/孔，分别于37℃反应0.5h、1h和1.5h，洗涤3次；加入可溶性单组分TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应，反应时间设定为30min，最后加入H₂SO₄终止反应，100μL/孔，在酶标仪上测定D_450nm值。采用方阵滴定法确定最适包被浓度和条件、封闭液的成分和封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度和作用时间，底物显色时间等。结果判定以阳性血清OD_450nm＝1，且P/N值最大组合所对应的条件作为间接ELISA最佳工作条件。P/N＝(被检血清OD_450nm值－空白对照OD_450nm值)/(阴性血清OD_450nm值－空白对照OD_450nm值)。

试验结果表明，当封闭液为5％脱脂奶粉时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，因此选用5％脱脂奶粉为最佳封闭液(表3-2)。当封闭时间为2h时，阳性血清OD450nm值更接近1.0，P/N值最大，故最佳封闭时间为2h(表3-3)当酶标抗体的稀释度为1:5 000时，阳性血清OD450nm值更接近1，且P/N值最大，因此酶标抗体的最适工作浓度为1:5 000。当酶标抗体工作时间为1h时，阳性血清OD450nm值更接近1，P/N值为最大，故酶标抗体的最佳工作时间为1h。30份Eg阴性血清的OD450nm值主要分布在0.15-0.20之间。经统计学软件Excel和SPSS 13.0软件对数据进行分析，阴性血清样本的平均值(X)为0.159，标准差(S)为0.037，其置信区间上限cut-off值＝X+3S＝0.270。样品OD450nm值大于0.270可判为阳性，小于或等于0.270可判为阴性。

(2)间接ELISA判定标准的确定：以30份绵羊Eg阴性血清为样本，按照血清最适稀释度进行稀释，采用建立的间接ELISA进行检测，测定D_450nm值，运用Excel>

(3)敏感性试验：选择8份Eg阳性血清，以1:200进行倍比稀释，用建立的Eg meAg-1-ELISA法进行检测。根据判定标准，样品OD450nm值大于0.270可判为阳性，小于或等于0.270可判为阴性。当血清稀释度为1:12 800时，结果仍为阳性，说明该方法具有良好的敏感性。

(4)特异性试验：用建立的Eg meAg-1-ELISA法对5份绵羊Em阳性血清、7份绵羊细颈囊尾蚴病阳性血清、8份绵羊肝吸虫病阳性血清、20份绵羊Eg阳性血清和20份绵羊Eg阴性血清进行检测，结果显示20份绵羊Eg阳性血清检测结果均为阳性，其余血清检测结果均为阴性，表明重组蛋白Eg meAg-1与其他寄生虫病血清无交叉反应，具有很高的特异性。

2、基于Eg-meAg1的间接ELISA方法的临床样品的检测

采用Eg-meAg1-ELISA法、HF-ELISA法(Jin Y等建立)和商品化包虫病IgG抗体间接ELISA检测方法(康百得，中国)三种方法对235份绵羊血清进行Eg抗体检测。采用SPSS 13.0软件进行数据分析。结果Eg meAg-1-ELISA法检出Eg阳性血清97份，阳性率为41.28％；HF-ELISA法检出Eg阳性血清91份，阳性率为38.72％；商品化包虫病IgG抗体间接ELISA检测方法检出Eg阳性血清93份，阳性率为39.57％。与HF-ELISA法和商品化包虫病IgG抗体间接ELISA检测方法相比，Eg meAg-1-ELISA阳性检出率最高，敏感性和特异性均较高，检测结果符合率分别为88.94％和95.74％(表2)。

表2重组蛋白Eg-meAg1的间接ELISA法对235份绵羊血清样品的检测

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 石河子大学

<120>细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白的制备方法及其应用

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 155

<212> 氨基酸序列

<213> 细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus.）

<220>

<221> misc_feature

<223> Eg-meAg1蛋白氨基酸序列

<400> 1

MVVKKRWGELRDFFRNDGPGTGNCDQGKAQSANVTGGPGDDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKVVDLLEELGPGTQAITAPDLTTPYPSSGPGRDFFRSDPLGQKGPGKFTEKPKREWRGPGLEEEDEDDLKGPGIETPRAGKKESTVM

<210> 2

<211> 468

<212> 核苷酸序列

<213> Eg-meAg1蛋白基因（密码子未优化）

<220>

<221> misc_feature

<223>Eg-meAg1蛋白基因核苷酸序列

<400> 1

ATGGTGGTAAAAAAAAGATGGGGTGAACTTCGAGACTTCTTTAGAAATGATGGCCCGGGCACTGGCAATTGTGATCAAGGAAAAGCACAAAGTGCCAATGTGACAGGAGGCCCGGGCGATGATGGCCTCACCTCGACGTCGAGGAGTGTGATGAAAATGTTTGGCGAAGTGAAGTACTTCTTCGAACGTGATCCGTTGGGTCAGAAAGTGGTTGACCTCTTAGAGGAACTGGGCCCGGGCACCCAGGCAATTACTGCTCCAGACCTGACAACCCCATATCCCAGTTCTGGCCCGGGCCGGGACTTCTTTAGAAGTGATCCACTGGGTCAAAAAGGCCCGGGCAAGTTTACTGAGAAGCCTAAACGGGAATGGCGCGGCCCGGGCCTGGAAGAAGAAGATGAGGATGATTTAAAGGGCCCGGGCATTGAGACACCGCGCGCTGGCAAGAAGGAAAGCACTGTAATGTAA

<210> 3

<211> 468

<212>核苷酸序列

<213> Eg-meAg1蛋白基因（密码子优化后）

<220>

<221> misc_feature

<223> Eg-meAg1蛋白基因核苷酸序列

<400> 1

ATGGTGGTAAAAAAACGTTGGGGTGAACTTCGTGACTTCTTTCGTAATGATGGCCCGGGCACTGGCAATTGTGATCAAGGAAAAGCACAAAGTGCCAATGTGACAGGAGGCCCGGGCGATGATGGCCTCACCTCGACGTCGCGTAGTGTGATGAAAATGTTTGGCGAAGTGAAGTACTTCTTCGAACGTGATCCGTTGGGTCAGAAAGTGGTTGACCTCTTAGAGGAACTGGGCCCGGGCACCCAGGCAATTACTGCTCCAGACCTGACAACCCCATATCCGAGTTCTGGCCCGGGCCGGGACTTCTTTCGTAGTGATCCACTGGGTCAAAAAGGCCCGGGCAAGTTTACTGAGAAGCCTAAACGGGAATGGCGCGGCCCGGGCCTGGAAGAAGAAGATGAGGATGATTTAAAGGGCCCGGGCATTGAGACACCGCGCGCTGGCAAGAAGGAAAGCACTGTAATGTAA