一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法

摘要

本发明公开了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，包括：将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液中，形成第一体系；将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液和待测多肽溶液的混合溶液中，形成第二体系；检测并判断第一体系和第二体系的荧光强度大小，以确定第二体系中探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构；其中，所述第一体系中的探针多肽的浓度与所述第二体系中探针多肽的浓度相等，探针多肽为用荧光分子进行修饰过的具有特定序列的胶原多肽。本发明通过二硫化物纳米材料能够准确的检测胶原蛋白的三重螺旋结构，该检测方法具有操作简单、成本低廉、检测方便、灵敏度高、特异性强以及样品用量少的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法。

背景技术

作为人体中含量最丰富的蛋白质，胶原蛋白由三条具有(Gly-X-Y)_n重复序列的肽链形成特征性的三重螺旋结构。胶原蛋白的突变或降解，被发现与成骨不全症，关节炎，癌症，血栓症等许多疾病息息相关。胶原蛋白(Gly-X-Y)_n的高度重复序列，导致很难筛选胶原蛋白高特异性的抗体。通过噬菌体展示库技术，已经发现能特异性地结合被基质金属蛋白酶酶切的IV型胶原蛋白产物碎片的肿瘤靶向肽。然而，这些方法存在繁琐耗时，特异性低，亲和力弱等缺陷。因此，开发简单高效的检测胶原蛋白三重螺旋结构的新方法具有重要的理论意义和应用价值。

以前的大量研究都是围绕氧化石墨烯二维材料进行展开的，氧化石墨烯平台被广泛应用于检测DNA的双螺旋结构。二硫化物纳米材料是一种具有类似氧化石墨烯的片层状结构，并可制成单分子层的二维材料。二硫化物纳米材料作为能够堆垛成具有非常大的内空间的“地板房结构”的颗粒状的新型材料，因其独特的分子内部结构和广阔的应用前景，而受到广泛的关注。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，该二硫化物纳米材料-探针多肽平台用于高灵敏、特异性地识别探针多肽与待测多肽形成的胶原蛋白三重螺旋结构，具有灵敏度高，特异性强的优点，可以对nM级别的胶原蛋白三重螺旋结构进行检测，并可以实现复杂生物体系中样品的检测。

本发明还有一个目的是开发了二硫化物纳米材料的新用途，用于检测胶原蛋白三重螺旋结构，且具有操作简单、检测方便、用样量少的优点。

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，包括：

将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液中，形成第一体系；

将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液和待测多肽溶液的混合溶液中，形成第二体系；

检测并判断所述第一体系和所述第二体系的荧光强度大小，以确定所述第二体系中探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构；

其中，所述第一体系中的探针多肽的浓度与所述第二体系中探针多肽的浓度相等，所述探针多肽溶液中的探针多肽为用荧光分子进行修饰过的具有特定序列的胶原多肽。

其机理为：二硫化物纳米材料与探针多肽发生荧光共振能量转移，造成探针多肽发生荧光猝灭，加入待测多肽后，待测多肽与探针多肽形成胶原蛋白的三重螺旋结构，探针多肽脱离二硫化物纳米材料的吸附，荧光进而恢复。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，包括以下步骤：

步骤一、使用荧光分子对具有特定序列的胶原多肽进行修饰，得到探针多肽，并配制一定浓度的探针多肽溶液；

步骤二、将一定体积、同一浓度的所述探针多肽溶液分别加入到不同浓度的二硫化物纳米材料溶液中，在一定的激发波长下，检测各溶液的荧光强度，并根据所述荧光强度确定荧光猝灭效果观测最佳时二硫化物纳米材料溶液的浓度，将该浓度的二硫化物纳米材料溶液作为标准溶液；以及

步骤三、将一定体积和已知浓度的探针多肽溶液分别与不同浓度的待测多肽进行预混，得到多个待测溶液，将一定体积的所述多个待测溶液分别滴加至与步骤二相同体积的标准溶液中，孵育一段时间后，得到混合溶液，检测各混合溶液的荧光强度，若随着待测多肽浓度的增加，混合溶液的荧光强度增强，那么待测溶液中的探针多肽与待测多肽生成了胶原蛋白三重螺旋结构。

例如，所述一定体积、已知浓度的探针多肽溶液为10μL，300μM。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述二硫化物纳米材料溶液的浓度为5～87μg/mL。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述二硫化物纳米材料为二硫化钨、二硫化钼中的一种。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述孵育时间为3～250min。例如，所述孵育时间为10～120min，又如最优孵育时间为40min。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述预混时间为0.1～72hrs。例如，所述预混时间为0.5～48hrs，又如最优预混时间为24hrs。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述荧光分子为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、以及罗丹明中的一种。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述具有特定序列的胶原多肽富含脯氨酸和带电荷的氨基酸。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，将氨基酸序列为G(PRGPOG)₅的多肽的N端用羧基荧光素进行修饰，用液相色谱进行纯化，得到探针多肽FAM-G(PRGPOG)₅。

优选的是，所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中，所述二硫化物纳米材料是采用水热法制备的纳米层状结构的二硫化物纳米材料。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法的二硫化物纳米材料-探针多肽平台用于高灵敏、特异性地识别探针多肽与待测多肽形成的胶原蛋白三重螺旋结构，具有灵敏度高，特异性强的优点，同时也可以对nM级别的胶原蛋白三重螺旋结构进行检测，并可以实现复杂生物体系中样品的检测。

2、本发明所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法具有操作简单、检测方便、成本低廉、灵敏度高、用样量少的优点。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法的原理示意图；

图2为本发明其中一个实施例中所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中二硫化钨纳米材料的红外光谱图、拉曼光谱图以及透射电镜图；

图3为本发明其中一个实施例中所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中不同浓度的二硫化物纳米材料猝灭同一浓度的探针多肽的荧光光谱图；

图4为本发明其中一个实施例中所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中不同浓度的待测多肽在PBS缓冲液条件下对探针多肽-二硫化钨纳米材料的荧光恢复光谱图；

图5为本发明其中一个实施例中所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法中不同浓度的待测多肽在唾液和尿液条件下对探针多肽-二硫化钨纳米材料的荧光恢复光谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明其中一个实施例中提供了一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，包括以下步骤：

一、二硫化物纳米材料的制备：

以仲钨酸铵为原料，通过酸溶、氨溶、硫化氢饱和、洗涤、结晶等过程，制备硫钨酸铵前躯体；采用热分解法，制备纳米级层状结构的二硫化钨纳米材料，详见图2的表征图谱，其中图2中的(A)为红外光谱图，(B)为拉曼光谱图，(C)为透射电镜图；

以钼酸铵为原料，通过酸溶、氨溶、硫化氢饱和、洗涤、结晶等过程，制备硫钼酸铵等前躯体；采用热分解法，制备纳米级层状结构的二硫化钼纳米材料。

二、探针多肽的制备：

将氨基酸序列为G(PRGPOG)₅的多肽的N端用羧基荧光素(FAM)进行修饰，用液相色谱进行纯化，得到探针多肽FAM-G(PRGPOG)₅；

三、不同浓度的二硫化物纳米材料猝灭探针多肽的荧光：

滴加10μL 300μM探针多肽溶液至不同浓度的二硫化钨纳米材料(0～87μg/mL)的溶液中，利用荧光分光光度计检测探针多肽的荧光发射光谱，得出：随着二硫化钨纳米材料浓度的增加，探针多肽的荧光强度明显降低，并将53μg/mL的二硫化物纳米材料溶液作为标准溶液，如图3所示，且从图1可以看出，二硫化物纳米材料与探针多肽发生荧光共振能量转移，造成探针多肽发生荧光猝灭，加入待测多肽后，待测多肽与探针多肽形成胶原蛋白的三重螺旋结构，探针多肽脱离二硫化物纳米材料的吸附，荧光进而恢复。

四、PBS缓冲液条件下胶原蛋白三重螺旋结构的识别

通过超声，将二硫化钨纳米材料分散到PBS缓冲液中，配制53μg/mL的二硫化物纳米材料溶液，将30μL、300μM的探针多肽溶液与0.1～30μL 600μM的待测多肽进行预混24h，得到多个待测溶液，选取10μL所述多个待测溶液分别滴加至5mL的53μg/mL的二硫化物纳米材料溶液中，孵育40min后，得到多个混合溶液，在350nm的激发波长下，检测所述多个混合溶液的荧光强度，如图4所示，从而能够准确判断是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构。通过建立混合溶液的荧光强度和待测多肽浓度之间的线性关系，可以进一步测定待测多肽的浓度。

五、复杂体系中胶原蛋白三重螺旋结构的识别

将0.1～30μL 600μM待测多肽与30μL 300μM探针多肽预混24hrs，将10μL待测多肽与探针多肽的混合液在唾液或尿液中稀释至300μL，取其中的10μL滴加至53μg/mL二硫化钨溶液中，孵育40min后，在350nm的激发波长下激发，利用荧光光谱仪检测荧光恢复的程度，如图5所示，图5中(A)为唾液体系，(B)为尿液体系。从而能够准确的判断复杂体系中胶原蛋白三重螺旋结构。通过建立混合溶液的荧光强度和待测多肽浓度之间的线性关系，可以进一步测定待测多肽的浓度。

因此，本发明所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法对于nM和μM级别的胶原蛋白三重螺旋结构的识别均具有较高的灵敏度。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。