一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsHA16及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsHA16及其编码基因与应用。本发明的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。本发明的实验证明，将GsHA16基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥对碳酸盐胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育具有碳酸盐胁迫耐性的转基因植物的研究奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsHA16及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐碱化加剧是全世界面临的重大问题，并且严重制约植物正常生长发育。世界上有23％的耕地面积是碱性土壤，以及37％的耕地面积是盐性土壤。仅中国东北地区，碱化的牧场就已高达70％，并逐年增加。土壤中盐成分的关键物质是中性盐(NaCl和Na₂SO₄)和碱性盐(NaHCO₃和Na₂CO₃)，并且碱性盐除了中性盐所造成的伤害外还包含碳酸根及碳酸氢根产生的pH伤害，对植物造成的伤害更大。因此，如何提高植物耐碱性、合理开发利用盐碱地资源，挖掘逆境农业生态区生产潜力，是我国农业持续高效发展、保证我国粮食安全亟待解决的重大问题之一。

现代科学技术的迅猛发展，尤其是生物信息学、功能基因组学和分子生物学技术的飞速发展，为挖掘耐盐碱关键基因、分子育种以及合理开发利用盐碱地奠定了扎实的理论基础。

植物质膜H⁺-ATPase是一类广泛存在于植物质膜及内膜系统的质子泵，主要功能是分解并利用细胞内ATP的分解释放出的能量将质子运出细胞，产生并维持细胞膜内外两侧H⁺的电化学梯度，为次级转运体和通道蛋白对营养物质及离子的跨膜转运提供能量。此外，质膜H⁺-ATPase还参与细胞内pH平衡、细胞伸长、气孔开闭以及植物响应外界胁迫等多种生理过程的调节。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物抗逆性相关蛋白，本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为GsHA16，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由951个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsHA16蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与GsHA16蛋白相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GsHA16蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由2856个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsHA16蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsHA16蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsHA16蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GsHA16蛋白的核酸分子的表达盒(GsHA16基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsHA16蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsHA16转录的启动子，还可包括终止GsHA16转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature>

可用现有的表达载体构建含有所述GsHA16基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了GsHA16蛋白或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了GsHA16蛋白或上述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

本发明还提供了GsHA16蛋白或上述相关生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗碳酸盐胁迫，所述抗碳酸盐胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫，体现为在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因植物的根长高于受体植物。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括在受体植物中过表达GsHA16蛋白，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述过表达的方法为将GsHA16蛋白的编码基因导入受体植物。

上述方法中，所述GsHA16蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本发明的实施例中，所述GsHA16蛋白的编码基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过重组载体pCAMBIA330035Su-GsHA16导入所述受体植物中，所述重组载体pCAMBIA330035Su-GsHA16为在pCAMBIA330035Su载体中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述抗逆性为抗碳酸盐胁迫，所述抗碳酸盐胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫，体现为在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因植物的根长高于受体植物。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsHA16基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

扩增编码上述GsHA16蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明发现了一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsHA16。本发明的实验证明，将GsHA16基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥对碳酸盐胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育具有碳酸盐胁迫耐性的转基因植物的研究奠定基础。

附图说明

图1为GsHA16蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析。

图2为GsHA16基因在碳酸盐胁迫下的表达模式分析。

图3为GsHA16转基因拟南芥PCR鉴定。

图4为GsHA16转基因拟南芥RT-PCR鉴定。

图5为转GsHA16拟南芥的耐碳酸盐胁迫分析。其中，图5A为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的幼苗期表型；图5B为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的根长，其中，纵坐标代表根长，横坐标代表NaHCO₃浓度；图5C为150mM的NaHCO₃胁迫处理后的T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的成苗期表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的野生大豆G07256种子在文献“Mingzhe Sun,Xiaoli Sun,YangZhao,Hua Cai,Chaoyue Zhao,Wei Ji,Huizi DuanMu,Yang Yu,Yanming Zhu.Ectopicexpression of GsPPCK3and SCMRP in Medicago sativa enhances plant alkalinestress tolerance and methionine content.PLOS ONE 2014,9(2):e89578”中公开过，公众可以从黑龙江八一农垦大学或东北农业大学获得。

下述实施例中的pBSK-eGFP载体在文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,Xiaodong Ding,XiBai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,a novelGlycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salt toleranceand ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公开过，公众可以从黑龙江八一农垦大学或东北农业大学获得。

下述实施例中的pCAMBIA330035Su载体在文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,XiaodongDing,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,anovel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salttolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公开过，公众可以从黑龙江八一农垦大学或东北农业大学获得。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101在文献“Lee CW,et al.Agrobacteriumtumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense inArabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中公开过，公众可以从黑龙江八一农垦大学或东北农业大学获得。

下述实施例中的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)在文献“Luo X,Sun X,LiuB,et al.Ectopic expression of a WRKY homolog from Glycine soja altersflowering time in Arabidopsis[J].PloS one,2013,8(8):e73295.”中公开过，公众可以从黑龙江八一农垦大学或东北农业大学获得。

实施例1、野生大豆中耐碳酸盐相关基因GsHA16的获得

一、GsHA16基因的获得

1、总RNA的提取

选取饱满的野生大豆G07256种子，用浓H₂SO₄处理10min，无菌水冲洗3～4次，25℃暗培养2-3d催芽。待芽长到1～2cm时，将其转移至1/4Hogland营养液中，置于人工气候箱中培养。取3周龄野生大豆G07256幼苗的根，采用RNAprep>

2、cDNA的获得

以OligodT为引物进行cDNA第一条链的合成，方法参见Invitrogen公司SuperScript^TM>

3、PCR扩增

以野生大豆总cDNA为模板，采用引物GsHA16-FL-F和GsHA16-FL-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

GsHA16-FL-F：5'-ATGGGTGGCATCAGCCTCGA-3'；

GsHA16-FL-R：5'-TTAAACTGTATAGTGCTGCTGAATCGTGT-3'。

4、GsHA16基因的克隆载体构建及测序

将PCR扩增产物与pEASY-T载体连接，构建pEASY-GsHA16克隆载体。并对其进行测序。

测序结果表明：PCR扩增得到的大小为2856bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将序列1所示的基因命名为GsHA16基因，自5’端第1-2856位为ORF，GsHA16基因编码序列表中序列2所示的蛋白质，将序列2所示的氨基酸序列命名为GsHA16蛋白。

二、GsHA16蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析

1、以pEASY-GsHA16克隆载体质粒为模板，采用GsHA16-GFP-F/GsHA16-GFP-R引物进行PCR扩增，得到GsHA16基因全长CDS区(不含终止密码子TAA)，引物序列如下所示(下划线代表酶切位点)：

GsHA16-GFP-F:5’-CGCATCGATATGGGTGGCATC-3’；

GsHA16-GFP-R:5’-GGCTCTAGAAACTGTATAGTGCTGCTGAAT-3’。

2、用限制性内切酶ClaI和XbaI分别对GsHA16基因全长CDS区和pBSK-eGFP载体进行双酶切，连接，构建GsHA16-eGFP融合表达载体。通过PEG法将GsHA16-eGFP融合表达载体转化拟南芥原生质体，同时以未转化GsHA16-eGFP载体的原生质体作为对照，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达。

结果如图1所示，未转化GsHA16-eGFP载体的原生质体细胞中没有观察到绿色荧光信号，而转化GsHA16-eGFP载体的原生质体细胞中绿色荧光蛋白主要分布在细胞膜上，说明GsHA16蛋白主要定位在细胞膜上。

三、GsHA16基因在碳酸盐胁迫条件下的表达模式分析

1、植物材料的处理

取3周龄的野生大豆幼苗，置于50mM>3(碳酸盐胁迫)条件下处理，分别取处理0h、1h、3h、6h和12h的根尖组织，置于-80℃保存。

2、cDNA的获得

取经上述处理不同时间后的野生大豆根尖组织各约100mg，液氮研磨，用RNAprepPlant Kit(TIANGEN,cat no:DP432)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。采用反转录试剂盒SuperScript^TM>

3、通过Real-time PCR对GsHA16基因进行表达量检测

以上述步骤2获得的cDNA为模板，采用引物GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R进行Real-time PCR，对GsHA16基因进行表达量检测。引物序列如下所示：

GsHA16-RT-F：5’-ATCTTCGTCACAAGGTCCCGC-3’；

GsHA16-RT-R：5’-GCAAAGCCCCAGTTAGCATACAC-3’。

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GAPDH基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；

GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。

定量Real-time PCR结果如图2所示：碳酸盐胁迫处理后，GsHA16基因表达量呈上升趋势，并在碳酸盐胁迫处理6h后达到顶峰，表明GsHA16基因的表达受碳酸盐胁迫诱导。

实施例2、转GsHA16拟南芥植株的获得及耐盐碱性分析

一、转GsHA16拟南芥植株的获得

1、以pEASY-GsHA16克隆载体为模板，采用基因特异引物GsHA16-U-F和GsHA16-U-R进行PCR扩增，得到GsHA16基因全长CDS区。引物序列如下(下划线代表载体构建时所需的接头序列，其中U为USER酶切位点)：

GsHA16-U-F:5’-GGCTTAAUATGGGTGGCATCAGC-3’；

GsHA16-U-R:5’-GGTTTAAUTTAAACTGTATAGTGCTGCTGA-3’。

2、用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、USER酶(NEB,M5505S)和步骤1获得的GsHA16基因在37℃下孵育20min，利用USER酶对GsHA16基因片段的尿嘧啶处进行切割，形成可与pCAMBIA330035Su载体互补的粘性末端，接着25℃下孵育20min，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重组表达载体记作pCAMBIA330035Su-GsHA16，并送交测序。

测序结果表明：pCAMBIA330035Su-GsHA16在pCAMBIA330035Su载体中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3、采用冻融法，将pCAMBIA330035Su-GsHA16载体转化至根癌农杆菌GV3101，获得重组农杆菌，并经PCR鉴定得到阳性转化子(含有序列表中序列1所示的GsHA16转化子)，用于侵染拟南芥植株。

4、转GsHA16拟南芥的获得及鉴定

将上述重组农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。将T₀代种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选。将T₁代抗性苗移栽至营养钵中培养，提取基因组DNA，进行PCR和RT-PCR鉴定。具体步骤如下：

采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(全式金，EE111-01)，提取野生型和固杀草抗性植株的基因组DNA，用基因特异引物(GsHA16-FL-S和GsHA16-FL-AS)进行PCR鉴定(图3)。对PCR鉴定阳性的植株，提取总RNA，采用半定量RT-PCR，以拟南芥ACTIN2基因为内参，利用实施例1中的Real-time PCR引物(GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R)检测GsHA16基因在转基因植株中的表达量(图4)。ACTIN2基因特异引物序列如下：

ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；

ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。

将RT-PCR阳性的T₁代转GsHA16拟南芥单株收种子，并分别播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选，观察T₂代分离情况。如此重复，直至得到T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系。选取T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)用于下述耐碳酸盐分析。

二、转GsHA16拟南芥耐碳酸盐分析

1、选取饱满的野生型拟南芥、T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的种子，用5％NaClO处理6-8min，灭菌ddH₂O冲洗5-7次，4℃春化3d，播种于正常的1/2MS培养基，22℃培养11d。待拟南芥长至六叶期，将幼苗分别移至正常的1/2MS培养基、含7mM>3的1/2MS培养基、含8mM>3的1/2MS培养基和9mMNaHCO₃的1/2MS培养基竖直培养7d。实验重复三次。

结果如图5A和图5B所示。当NaHCO₃的浓度为7mM时，T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(4#)的根长分别为4.37cm和4.49cm；野生型拟南芥的根长为3.98cm。当NaHCO₃的浓度为8mM时，T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(4#)的根长分别为3.79cm和3.94cm；野生型拟南芥的根长为3.71cm。当NaHCO₃的浓度为9mM时，T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(4#)的根长分别为3.08cm和2.97cm；野生型拟南芥的根长为2.74cm。从图中和以上结果可以看出：碳酸盐胁迫抑制了野生型拟南芥、T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的根的伸长(图5A)，但T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(4#)的根长要长于野生型拟南芥(图5B)。

2、选取饱满的野生型拟南芥、T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)种子，春化后播种于营养钵中(营养土：君子兰土：蛭石1：1：1)，置于人工气候培养箱中培养。选取长势一致的4周龄拟南芥植株，每3d浇灌1次150mMNaHCO₃(pH>

结果如图5C所示：碳酸盐胁迫处理后野生型拟南芥、T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)都逐渐失绿变紫甚至死亡，但是T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE3(#3)和T₃代转GsHA16拟南芥纯合体株系OE4(#4)的长势明显优于野生型。上述结果表明GsHA16基因超量表达显著提高了植物的碳酸盐胁迫耐性。