一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法

摘要

本发明提供了一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T‑Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1‑RNAP质粒；(3)将待表达基因两端分别加入T7启动子，IRES和T7终止子，然后连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。本发明提高了哺乳表达系统的表达量。

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白质制备领域，具体涉及一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法。

背景技术

目前哺乳动物细胞表达系统，通常采用pCMV启动子进行外源基因的表达，表达量相对原核系统T7启动子普遍低很多，T7启动子表达的蛋白，普遍可达到细胞总蛋白的5-20％甚至更高，并且普通的SDS-PAGE电泳即可检测，而真核表达系统相比差很多，通常都是需要用WB这种高灵敏度的方法进行检测。相对来讲，提高哺乳表达系统的产量具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；

(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；

(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列，Nucleoplasmin核定位序列，EGL-13核定位序列，c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列中的一种。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列。

作为进一步的优选，所述步骤(2)中，所述连接为采用T4DNA连接酶进行连接，所述连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体从pIRES载体上克隆得到多克隆位点B和IRES序列以及T7终止子。

作为进一步的优选，所述克隆方法包括：

1)设计含T7启动子序列的上游引物和t7终止子的下游引物来扩增相应序列；

2)PCR扩增T7启动子，IRES序列，多克隆位点B，通过引物和Platinum-pfx试剂盒，将pIRES载体的片段克隆到pUC57载体上。

作为进一步的优选，所述上游引物T7为：5'TAATACGACTCACTATAGAATTCCGCCCCTCTCC>CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT>

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，在共转染真核细胞后的培养基中添加α-鹅膏蕈碱。

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，所述α-鹅膏蕈碱的浓度为10μg/mL。

作为进一步的优选，所述真核细胞为真核细胞株293T。

本发明的有益效果是：

1、本发明组建成的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达，提高了哺乳表达系统的表达量；并且使用IRES序列以解决T7RNA聚合酶转录没有真核翻译位点的问题。

2、本发明表达蛋白的方法使用α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性，使转染的基因在真核细胞中只受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大。

3、本发明使用双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因，本发明表达效率高，表达量大。

附图说明

图1为本发明实施例1转染真核细胞后48h荧光图。

图2为本发明实施例3转染真核细胞后48h荧光图。

具体实施方式

本发明通过提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。

为了解决上述缺陷，本发明实施例的主要思路如下：

本发明实施例用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；

(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；

(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。

所述步骤(1)中，使用T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成哺乳动物细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。

核定位序列(Nuclear localization signal)是蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。蛋白和mRNA在细胞核和细胞质之间的运输称为入核和出核。本发明实施例一般选用SV40T-Antigen核定位序列。

所述双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因。所述共转染时，通常将两质粒按一定摩尔比混合。

为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述之用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统表达蛋白的方法。

实施例1

密码子优化

使用大肠杆菌BL21T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成人细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入HindIII，下游依次添加了SV40T-Antigen核定位序列和EcoRI酶切位点。片段长度为2600bp左右，序列见序列表。密码子优化及全基因合成均在武汉金开瑞完成。待优化序列生成后，通过Visual Gene Developer软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。

质粒构建

构建T7-RNAP的真核表达载体：将上述合成的基因克隆到质粒pUC57中，提取质粒备用，通过HindIII和EcoRI酶切位点双酶切连接到pcDNA3.1真核表达载体上，取5μgEcoRI/HindIII酶切过的pUC57-T7RNAP与约100ng pcDNA3.1经过同样双酶切消化、回收后的线形化的pcDNA3.1，用T4DNA连接酶按常规方法进行连接反应，连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP，并进行DNA测序。

从pIRES载体上克隆多克隆位点B和IRES序列：整个长度为1600bp，设计含T7启动子序列(横线部分)的上游引物T7上：5'TAATACGACTCACTATAGaattccgcccctctcc 3'和下游引物T7下：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT>

真核细胞的转染和蛋白的表达

a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25cm²的培养瓶中长满细胞可达5×10⁶/mL，取3-4×10⁵细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。

b、质粒DNA配制：按1∶1摩尔比混合pcDNA3.1-RNAP和pUC57-EGFP，每孔2μg混合质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。

c、Lipofect配制：每孔5μL lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。

d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。

e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。

f、每孔2mL PBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。

g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。

h、每孔先加入OPTI-MEN 0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。

i、置入CO₂培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的但含10μg/mL的α-鹅膏蕈碱的DMEM。

j、再次置入CO₂培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL>

双质粒共转染真核细胞株293T：以pcDNA3.1-RNAP/pUC57-EGFP双质粒组成共表达系统，用脂质体共转染真核细胞株293T，在细胞培养基中加入10μg/mL的α-鹅膏蕈碱，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。如图1所示。

实施例2

密码子优化

使用T7噬菌体RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成人细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入HindIII，下游依次添加了SV40T-Antigen核定位序列和EcoRI酶切位点。片段长度为2600bp左右，序列见序列表。密码子优化及全基因合成均在武汉金开瑞完成。待优化序列生成后，通过Visual Gene Developer软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。

质粒构建

构建T7-RNAP的真核表达载体：将上述合成的基因克隆到质粒pUC57中，提取质粒备用，通过HindIII和EcoRI酶切位点双酶切连接到pcDNA3.1真核表达载体上，取5μgEcoRI/HindIII酶切过的pUC57-T7RNAP与约100ng pcDNA3.1经过同样双酶切消化、回收后的线形化的pcDNA3.1，用T4DNA连接酶按常规方法进行连接反应，连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP，并进行DNA测序。

从pIRES载体上克隆多克隆位点B和IRES序列以及poly A信号序列：整个长度为1600bp，设计含T7启动子序列的上游引物T7上：5'TAATACGACTCACTATAGaattccgcccctctcc3'和下游引物T7下：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT>

真核细胞的转染和蛋白的表达

a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25cm²的培养瓶中长满细胞可达5×10⁶/mL，取3-4×10⁵细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。

b、质粒DNA配制：按1∶1摩尔比混合pcDNA3.1-RNAP和pUC57-EGFP，每孔2μg混合质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。

c、Lipofect配制：每孔5μL lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。

d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。

e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。

f、每孔2mL PBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。

g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。

h、每孔先加入OPTI-MEN 0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。

i、置入CO₂培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清。

j、再次置入CO₂培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL>

双质粒共转染真核细胞株293T：以pcDNA3.1-RNAP/pUC57-EGFP双质粒组成共表达系统，用脂质体共转染真核细胞株293T，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。

本发明实施例2过程和实施例1类似，不同在于没有在转染后的培养基中添加10μg/mL的α-鹅膏蕈碱，结果显示，没有10μg/mL的α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞转录酶Ⅱ，有部分细胞的表达量没有达到本发明实施例1的表达量。

实施例3

本发明实施例3过程和实施例1类似，不同之处在于真核细胞的转染和蛋白的表达步骤，具体如下：

a、预处理：用含8％无支原体新生牛血清的RPMI1640培养基，按常规方法传代培养293T细胞。转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25c㎡的培养瓶中长满细胞可达5×10⁶/mL，取3-4×10⁵细胞铺在2mL的培养基中(不含双抗含血清)，使其在转染时密度为90-95％。

b、质粒DNA配制：取pIRES2-EGFP，每孔2ug pIRES2-EGFP质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250μL；多孔可批量配制。质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。

c、Lipofect配制：每孔510μg/mL的α-鹅膏蕈碱l lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250μL温和混匀，温室放置5min。

d、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起(配制后30min内混合)，室温保温20min，保证每孔总体积500μL。

e、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。用移液管吸去上清。

f、每孔2mLPBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。

g、每孔用1mL DMEM清洗2遍。

h、每孔先加入OPTI-MEN0.9mL，再加500μL DNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀。

i、置入CO₂培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的DMEM。

j、再次置入CO₂培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。500转，10min离心，取上清1mL/管(1.5mL>

用脂质体转染真核细胞株293T，仅转染pIRES2-EGFP质粒，分别在24h、48h、72h观察细胞荧光表达情况。如图2所示。

上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：

1、本发明组建成的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达，提高了哺乳表达系统的表达量；并且使用IRES序列以解决T7RNA聚合酶转录没有真核翻译位点的问题。

2、本发明表达蛋白的方法使用α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性，使转染的基因在真核细胞中只受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大。

3、本发明使用双质粒共转染表达系统，一个质粒用于表达T7RNA聚合酶，表达的T7RNA聚合酶用来合成外源RNA，一个质粒用于表达待表达外源基因，本发明表达效率高，表达量大。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉华美生物工程有限公司

<120>一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法

<130>2016

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2715

<212>DNA

<213>Bacteriophage T7

<400>1

atgaacacca tcaacatcgc caagaacgac ttcagcgaca tcgagctggc cgccatcccc60

ttcaacaccc tggccgacca ctacggcgag cggctggccc gggagcagct ggccctggag 120

cacgagagct acgagatggg cgaggcccgg ttccggaaga tgttcgagcg gcagctgaag 180

gccggcgagg tggccgacaa cgccgccgcc aagcccctga tcaccaccct gctgcccaag 240

atgatcgccc ggatcaacga ctggttcgag gaggtgaagg ccaagcgggg caagcggccc 300

accgccttcc agttcctgca ggagatcaag cccgaggccg tggcctacat caccatcaag 360

accaccctgg cctgcctgac cagcgccgac aacaccaccg tgcaggccgt ggccagcgcc 420

atcggccggg ccatcgagga cgaggcccgg ttcggccgga tccgggacct ggaggccaag 480

cacttcaaga agaacgtgga ggagcagctg aacaagcggg tgggccacgt gtacaagaag 540

gccttcatgc aggtggtgga ggccgacatg ctgagcaagg gcctgctggg cggcgaggcc 600

tggagcagct ggcacaagga ggacagcatc cacgtgggcg tgcggtgcat cgagatgctg 660

atcgagagca ccggcatggt gagcctgcac cggcagaacg ccggcgtggt gggccaggac 720

agcgagacca tcgagctggc ccccgagtac gccgaggcca tcgccacccg ggccggcgcc 780

ctggccggca tcagccccat gttccagccc tgcgtggtgc cccccaagcc ctggaccggc 840

atcaccggcg gcggctactg ggccaacggc cggcggcccc tggccctggt gcggacccac 900

agcaagaagg ccctgatgcg gtacgaggac gtgtacatgc ccgaggtgta caaggccatc 960

aacatcgccc agaacaccgc ctggaagatc aacaagaagg tgctggccgt ggccaacgtg1020

atcaccaagt ggaagcactg ccccgtggag gacatccccg ccatcgagcg ggaggagctg1080

cccatgaagc ccgaggacat cgacatgaac cccgaggccc tgaccgcctg gaagcgggcc1140

gccgccgccg tgtaccggaa ggacaaggcc cggaagagcc ggcggatcag cctggagttc1200

atgctggagc aggccaacaa gttcgccaac cacaaggcca tctggttccc ctacaacatg1260

gactggcggg gccgggtgta cgccgtgagc atgttcaacc cccagggcaa cgacatgacc1320

aagggcctgc tgaccctggc caagggcaag cccatcggca aggagggcta ctactggctg1380

aagatccacg gcgccaactg cgccggcgtg gacaaggtgc ccttccccga gcggatcaag1440

ttcatcgagg agaaccacga gaacatcatg gcctgcgcca agagccccct ggagaacacc1500

tggtgggccg agcaggacag ccccttctgc ttcctggcct tctgcttcga gtacgccggc1560

gtgcagcacc acggcctgag ctacaactgc agcctgcccc tggccttcga cggcagctgc1620

agcggcatcc agcacttcag cgccatgctg cgggacgagg tgggcggccg ggccgtgaac1680

ctgctgccca gcgagaccgt gcaggacatc tacggcatcg tggccaagaa ggtgaacgag1740

atcctgcagg ccgacgccat caacggcacc gacaacgagg tggtgaccgt gaccgacgag1800

aacaccggcg agatcagcga gaaggtgaag ctgggcacca aggccctggc cggccagtgg1860

ctggcctacg gcgtgacccg gagcgtgacc aagcggagcg tgatgaccct ggcctacggc1920

agcaaggagt tcggcttccg gcagcaggtg ctggaggaca ccatccagcc cgccatcgac1980

agcggcaagg gcctgatgtt cacccagccc aaccaggccg ccggctacat ggccaagctg2040

atctgggaga gcgtgagcgt gaccgtggtg gccgccgtgg aggccatgaa ctggctgaag2100

agcgccgcca agctgctggc cgccgaggtg aaggacaaga agaccggcga gatcctgcgg2160

aagcggtgcg ccgtgcactg ggtgaccccc gacggcttcc ccgtgtggca ggagtacaag2220

aagcccatcc agacccggct gaacctgatg ttcctgggcc agttccggct gcagcccacc2280

atcaacacca acaaggacag cgagatcgac gcccacaagc aggagagcgg catcgccccc2340

aacttcgtgc acagccagga cggcagccac ctgcggaaga ccgtggtgtg ggcccacgag2400

aagtacggca tcgagagctt cgccctgatc cacgacagct tcggcaccat ccccgccgac2460

gccgccaacc tgttcaaggc cgtgcgggag accatggtgg acacctacga gagctgcgac2520

gtgctggccg acttctacga ccagttcgcc gaccagctgc acgagagcca gctggacaag2580

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