稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用

摘要

本发明公开了一株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。本发明所述的一株能够稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1B9，其微生物保藏号是：CGMCC No.12695。研究证明，由该杂交瘤细胞株分泌的单抗所识别的表位为构象表位。病毒中和试验表明，该单抗能够有效中和PEDV G2亚型的毒株，但对PEDV G1亚型毒株不具有中和活性。鉴于该单抗的生物学特性，该单抗可以用来鉴别PEDV G1和G2亚型毒株，并依此建立一系列诊断方法。此外，该单抗还能够用于治疗由猪流行性腹泻病毒引起的疾病。因此，本发明的提出为PEDV G1亚型的诊断和治疗提供了一种新的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用，特别涉及一株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)是养猪业中引发仔猪腹泻、消瘦、脱水的重要病原体之一，给养猪业带来重大经济损失。研究表明，PEDV有两个基因亚型，即G1和G2亚型。2010年之前，PEDV流行毒株以G1亚型为主，2010年之后，PEDV流行毒株以G2亚型为主。基因序列分析表明，PEDV G1和G2亚型的主要差异在S基因上。G1亚型毒株S基因由4152nt构成，而G2的S基因为4161nt构成，在基因长度上增加了9个碱基。基因内部也存在较大差异。PEDV基因组中最大的变异位于S基因，而S基因中的突变主要集中在N末端。

NPL-PEDV/2013/P10与NPL-PEDV/2013相比，ORF1a/b蛋白、核蛋白、NS3B、膜蛋白以及囊膜蛋白在氨基酸水平上完全一致。而在纤突蛋白(S)中含有六个核苷酸多态性，导致氨基酸位点变化：F375L、T486P、D856E、A1081V、A1099S以及Y1253D。在S1区域有2个氨基酸变异，在S2区域有4个氨基酸变异(Lawrence et al.,2014)。冠状病毒S蛋白能够诱导中和性抗体的产生，S基因变异必然会导致S蛋白诱导产生的中和性抗体在中和病毒方面上存在差异。

本发明发明人以纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得1株稳定分泌抗PEDV的杂交瘤细胞株，命名为1B9。IFA检测发现1B9单抗能够与PEDV-LNCT2发生反应，而Western-blot检测则发现1B9单抗与PEDV-LNCT2不反应，说明1B9单抗所识别的表位为构象表位。病毒中和试验表明，1B9单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms这三株PEDV-G2亚型的毒株，但对PEDV G1亚型毒株CV777不具有中和活性，而PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms与CV777在S基因上差异较大，结合IFA实验结果和遗传变异分析结果，表明1B9单抗识别的抗原为S蛋白。

1B9单抗能够有效中和病毒，使其失去感染细胞的能力，其识别并结合的抗原表位有待研究，通过研究其结合的抗原表位区域，可以获得该单抗阻断PEDV感染细胞的分子机制。

鉴于1B9单抗能够中和PEDV G2(LNCT2、LNSY和Hjms)亚型毒株，不能中和PEDV G1(CV777)亚型毒株的特性，因此该单抗可以用来制备诊断试剂盒区分PEDV G1和G2亚型毒株；该单抗经标记后可以用来研制ELISA、抗原捕获ELISA、PEDV胶体金检测试纸条以及竞争ELISA，具备广阔的应用价值和研究价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效中和猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人以纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得1株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1B9。该杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：1000和1:100000。1B9单抗亚类为IgG2b，轻链为κ型。IFA(间接免疫荧光检测)检测发现，1B9单抗能够与PEDV-LNCT2发生反应，但Western blot结果显示，1B9单抗与PEDV粒子、S蛋白不发生反应，无特异性反应条带，上述两种结果表明该单抗所识别的抗原表位为构象表位。病毒中和实验表明，该单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，但不能中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单抗的生物学特性，1B9单抗可以用来鉴别G1和G2亚型毒株，以及建立一系列阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等诊断方法。

在本发明中，所述的一株能够稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1B9，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC No.12695，保藏时间为2016年7月21日。

附图说明

图1为电镜观察PEDV病毒粒子；

图2为IFA检测1B9单抗与PEDV-LNCT2的反应；

1为1B9单抗与接种LNCT2毒株的Vero-E6细胞反应结果；2为1B9单抗与健康Vero-E6细胞反应结果；

图3为Western-blot验证1B9单抗与PEDV蛋白组分的反应情况；

1：PEDV-LNCT2S蛋白；2：PEDV-LNCT2；3：PEDV-CV777；4：Vero-E6细胞；

图4为Western-blot鉴定1B9单抗的组成；

图5为1B9单抗与病毒中和实验测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1抗PEDV单克隆抗体的制备及鉴定

1材料与方法

1.1细胞、试验动物、抗体和试剂

SP2/0和Vero-E6细胞系由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队保存；RPMI1640培养液(Gibco)；HAT和HT培养基、PEG1450、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；BALB/c小鼠由本所实验动物中心代为购买。

1.2PEDV的培养和纯化

1.2.1PEDV-LNCT2毒株的培养

Vero-E6细胞长满形成单层后，弃去营养液，用PBS(磷酸盐缓冲溶液，pH7.2)洗涤三遍，接种PEDV-LNCT2毒株。病毒接种剂量按照5％浓度接种，接种病毒同时添加胰酶，胰酶的终浓度为10μg/ml。观察细胞病变，待80％～90％细胞出现病变时，将病毒冻存至-20冰箱，收毒，备用。

1.2.2PEDV-LNCT2的纯化

PEDV-LNCT2病毒液经5000g离心5min去除细胞碎片后，用超速离心机100000g离心2h，弃去上清液，收集沉淀。沉淀用蔗糖梯度密度离心纯化，共设置5个蔗糖浓度，20％、30％、40％、50％和60％。超速离心机SW32转子100000g离心2h后，收集50％～60％蔗糖层之间的样品，样品经SW32转子100000g离心2h进行脱糖处理，弃去上清液收集沉淀。沉淀即为纯化的病毒粒子。

1.3抗PEDV单克隆抗体的制备

1.3.1BALB/c小鼠的免疫

将纯化的PEDV-LNCT2病毒粒子与等量弗氏佐剂混合后腹腔接种6周龄BALB/c小鼠5只，每只接种抗原剂量为100μg。2周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原。细胞融合前3d，用等量不加佐剂的抗原(每只200μg)腹腔注射加强免疫1次，即可进行细胞融合。

1.3.2单克隆抗体筛选方法的建立

按常规方法建立间接IFA法。Vero-E6细胞形成单层后，接种PEDV-LNCT2，24h后观察细胞病变，待50％细胞出现病变时用4％的多聚甲醛固定细胞，4℃或-20℃保存备用。小鼠阴性血清、阳性血清或以后待检的杂交瘤细胞作为检样，以DyLight^TM>

1.3.3细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的建立

免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5：1比例混合后加PEG融合，于96孔培养板中37℃、CO2培养箱中培养。当杂交瘤细胞的培养液开始变黄，或杂交瘤细胞长满至孔底面积的1/10时，吸取上清液，经IFA法筛选阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法对阳性孔连续3次亚克隆，至所有单克隆孔均为阳性为止。将最终获得的单克隆扩大培养后建株，冻存。

1.3.4单抗腹水的制备及效价的测定

取8周龄BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(每只0.5ml)，7d后将生长状态良好的杂交瘤细胞，以每只约5×10⁵个腹腔注射BALB/c小鼠。7d左右小鼠腹部开始明显膨大，反复抽取腹水，以3000r/min离心10min除去细胞成分和其他沉淀，收集上清液。纯化后加入0.02％叠氮钠，分装，-70℃保存。将腹水用PBS递增稀释，以IFA测定单抗的效价。

1.3.5单抗的Western-blot分析

在非还原型SDS-PAGE方法下将纯化的PEDV-LNCT2病毒粒子蛋白质半干转印至NC膜，NC膜经2％的脱脂乳封闭后，与1:10000单抗腹水作用2h，洗涤3次，加入1∶10000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)作用1h，洗涤3次，扫描成像。

1.3.6亚型鉴定单抗亚型鉴定

采用Mouse MonoAb-ID Kit(HRP)鉴定单抗亚类，按试剂盒说明书对以上试验中得到的单克隆抗体进行亚型鉴定。

1.3.7阳性杂交瘤细胞株分泌单抗稳定性的测定

将冻存3个月的阳性杂交瘤细胞复苏，24孔细胞板培养，检测上清是否呈阳性来判定复苏的阳性细胞是否有分泌抗体的能力。将经过3次亚克隆的阳性率达100％的杂交瘤细胞进行体外连续传代培养3个月，每隔2周检测1次细胞上清液。

1.3.8单抗中和活性测定

单抗腹水经0.22μm滤膜过滤后，用RPMI1640培养液2倍倍比稀释；PEDV-LNCT2、PEDV-CV777、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms四株病毒稀释至每100μL病毒液含200个TCID₅₀，病毒液与抗体等体积混合，37℃反应1h，添加胰酶，胰酶的终浓度为10μg/ml，接种细胞，置于细胞培养箱5天，观察细胞病变情况。

2结果

2.1PEDV-LNCT2病毒粒子的纯化

经鉴定蔗糖梯度密度纯化后的病毒粒子主要集中在蔗糖的50％-60％层之间，样品经电镜观察结果见图1，可见完整的PEDV-LNCT2病毒粒子，用吸光光度计法测得其浓度为0.424mg/ml。

2.2抗PEDV单克隆抗体的制备

2.2.1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以纯化的PEDV-LNCT2病毒粒子为免疫原免疫BALB/c鼠，融合的杂交瘤细胞经IFA筛选阳性克隆后对阳性孔进行3次亚克隆，获得1株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1B9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No.12695。

2.2.2单抗的IFA分析

IFA检测发现，1B9单抗上清能够与接种PEDV-LNCT2毒株的Vero-E6细胞发生反应，与健康Vero-E6不反应，结果如图2所示。

2.2.3单抗的Western-blot分析

采用Western-blot试验验证该株单抗与PEDV反应情况，结果如图3所示，该结果表明，1B9单抗与PEDV-LNCT2、CV777以及健康Vero-E6细胞均不发生反应，与LNCT2S蛋白也不发生特异性反应，推测1B9识别的抗原表位为空间构象表位。

2.2.4单抗腹水采集与单抗亚型鉴定

待小鼠腹部膨大后抽取其腹水，3000r/min离心10min取上清。采用IFA方法检测上清和腹水抗体效价。结果表明：1B9单抗细胞上清液抗体效价高于1：1000，腹水抗体效价高于1：100000。将本试验制备的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果表明1B9单抗为IgG2b亚型，轻链为κ链。用HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体做Western-blot发现，该单抗由重链和轻链两部分组成，结果如图4所示。

2.2.5融合细胞株分泌单抗的稳定性测定

将冻存细胞株复苏后于24孔培养板中培养，间接ELISA检测细胞上清液，结果OD₄₀₅值仍很高。将细胞传代3个月，每隔2周检测1次上清液，结果显示OD₄₀₅值稳定。

2.2.6单抗中和效价测定

结果如图5所示，该结果表明PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY、PEDV-Hjms能够被1B9单抗中和，1B9单抗在1：160、1：80和1：160稀释时能够完全中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY、PEDV-Hjms三个毒株，但1B9单抗不能够中和PEDV-CV777毒株。