检测葛根及葛根提取物和含葛根制剂成分的UPLC方法

摘要

本发明提供了一种以葛根素为对照，定性和定量检测葛根、葛根提取物以及含葛根制剂中3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素-6”-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素苷和大豆苷6种成分含量的UPLC方法，包括制备对照品和供试品溶液，以0.1％醋酸为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为250nm；色谱柱为SB-C18，RRHD,1.8um，2.1*100mm；柱温为31℃；流速为0.4mL/min；进样量为1uL；将所得色谱图与葛根药材指纹图谱比较，主峰即为葛根素，其余成分一一对应，可对药材进行鉴别。同时结合相对校正因子(3’-羟基葛根素为1.253、葛根素为1.000、葛根素-6”-O-木糖苷为1.422、3’-甲氧基葛根素为1.297、芹糖基葛根素苷为1.332和大豆苷为1.030)和对照溶液中葛根素的峰面积即可计算葛根中6种成分的含量。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及中药材提取物及提取技术，以及制剂的UPLC快速分析方法。

背景技术

葛根是豆科植物野葛的干燥根，在全国多数省份都有分布，湖北是一个重要产区。将葛根深加工成提取物，可以产生较好的社会效应和经济效益。同时，葛根提取物中的主要成分是异黄酮类，药理作用比较广泛，对心脑血管疾病方面的作用比较突出，国内国外市场前景广阔。多种中成药处方中都将葛根作为主药，而且选择其中的葛根素作为质量控制指标。中药成分复杂，在治疗疾病的过程中这些成分多数时候产生协同作用。因此，决定中药材及其相应产品质量的应该是其中各种成分的一个组合。但是，过去由于条件的限制，控制中药材的质量往往选取其中一种易于检测的成分(指标性成分)，这样就会导致一些问题，一方面，药材的作用不一定由这一种成分产生，因此不能充分地反映药材的质量；另一方面，不法生产者为了牟取暴利，采用伪品或劣品中添加检验标准需要检测的成分，因此，选择药材材中的多种成分(指标性成分或活性成分)来建立相应的质量控制标准，这样就可以很好的预防人为的掺杂和掺假，也能指导工业生产，保证产品的质量。UPLC具有灵敏度高，分离效能高和速度快，溶剂消耗少的优势，可以在较短时间内同时完成分析，不仅能用于单一药材中多种成分的测定，还可以实现复方中多种组分的测定。

发明内容

本发明的任务是提供一种检测葛根或葛根提取物或含葛根制剂成分的UPLC方法。

本发明提供检测葛根或葛根提取物或含葛根制剂中成分的UPLC方法是：以葛根素为 对照，定性和定量检测葛根、葛根提取物以及含葛根制剂中3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素-6”-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素苷和大豆苷6种成分含量的UPLC方法，包括制备对照品和供试品溶液，以0.1％醋酸为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，检测波长为250nm；色谱柱为SB-C18，RRHD，1.8um，2.1＊100mm；柱温为31oC；流速为0.4mL/min；进样量为1uL；将所得色谱图与葛根药材指纹图谱比较，主峰即为葛根素，其余成分一一对应，可对药材进行鉴别，同时结合相对校正因子(3’-羟基葛根素为1.253、葛根素为1.000、葛根素-6”-O-木糖苷为1.422、3’-甲氧基葛根素为1.297、芹糖基葛根素苷为1.332和大豆苷为1.030)和对照溶液中葛根素的峰面积即可计算葛根中6种成分的含量。

本发明提供的检测葛根或葛根提取物或含葛根制剂成分的UPLC方法，包括以下步骤：

步骤一、制备对照品溶液：称取葛根素对照品适量于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至约125ug/mL；

步骤二、制备供试品溶液：称取葛根粉末(过三号筛)0.15g，加入40％乙醇50ml，称重，超声提取30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤即得；

步骤三、按以下方法进样检测：色谱仪：UPLC(Agilent 1290，DAD检测器)；

色谱条件：梯度洗脱，流动相A：0.1％醋酸流动相B：乙腈

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 92 8 0.5 88.5 11.5 3.5 88.5 11.5 7 77 23

10 50 50 12 10 90 14 10 90

检测波长：250nm；色谱柱：SB-C18，RRHD，1.8um，2.1＊100mm；柱温：31℃；流速：0.4mL/min；进样量：1uL；

步骤四、将所得色谱图与葛根药材指纹图谱比较，主峰即为葛根素，其余成分一一对应，可对药材进行鉴别。

在上述步骤四所述的将所得色谱图与葛根药材指纹图谱比较中，结合相对校正因子和对照溶液中葛根素的峰面积即可计算葛根中6种成分的含量；葛根中6种成分的相对校正因子为：3’-羟基葛根素为1.253；葛根素为1.000；葛根素-6”-O-木糖苷为1.422；3’-甲氧基葛根素为1.297；芹糖基葛根素苷为1.332；大豆苷为1.030。

本发明提供的方法可以准确快速的对葛根药材、提取物以及含有葛根的中成药制剂中的葛根来源成分进行质量控制，所需时间较短，14min以内即可完成分析。方法的灵敏度较高，具有较高的实际应用价值。

实验资料

1.分析方法的建立

色谱仪：UPLC(Agilent 1290，DAD检测器)

色谱条件：梯度洗脱，流动相A：0.1％醋酸流动相B：乙腈

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 92 8 0.5 88.5 11.5 3.5 88.5 11.5

7 77 23 10 50 50 12 10 90 14 10 90

检测波长：250nm；色谱柱：SB-C18，RRHD，1.8um，2.1＊100mm；柱温：31oC；流速：0.4mL/min；进样量：1uL

选取3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素-6”-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素苷和大豆苷等几种葛根中所含有的异黄酮作为标准品。各成分紫外吸收图谱(DAD扫描)见图1，混合对照品和样品图谱见图2，

2.分析方法验证

2.1样品的前处理

2.1.1提取溶剂的选择：精密称取0.15g葛根药材粉末(过三号筛)，分别加入不同浓度乙醇溶液(30％，40％，50％，60％和70％)50ml，称重，超声提取30min，取出放冷至室温，用对应浓度乙醇溶液补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤，取1ul进样，以峰面积/称样量进行比较。

表1溶剂浓度的选择

其中40％乙醇提取的比值均较大，故选择40％乙醇作为提取溶剂。

2.1.2超声时间的确定：精密称取0.15g葛根药材粉末(过三号筛)，分别加入40％乙醇 50ml，称重，考察超声不同时间(20min，30min，40min和50min)对提取的影响。见表2。

表2超声时间的确定

超声30min时，比值最大，确定超声时间为30min。

2.2溶液的制备：供试品溶液制备：称取葛根粉末0.15g，加入40％乙醇50ml，称重，超声提取30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤即得。(葛根提取物和中成药制剂的制备过程见后续实例)。对照品储备溶液制备：分别称取3′-羟基葛根素4.13mg，葛根素6.54mg，葛根素-6”-O-木糖苷4.78mg，3′-甲氧基葛根素4.34mg，芹糖基葛根素苷4.79mg，大豆苷6.10mg于25ml容量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，即得对照品储备溶液(各对照品含量分别为3′-羟基葛根素98.5％，葛根素95.5％，葛根素-6”-O-木糖苷98.0％，3′-甲氧基葛根素98.5％，芹糖基葛根素苷98.5％，大豆苷91.3％)。

2.3溶液稳定性：取葛根粉末(批号：A40805)0.15g，加40％乙醇50ml，称重，超声提取30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤即得。取1ul进样，即得0h峰面积，室温放置，在2h，4h，8h，12h和24h分别取1uL进样，结果见表3，分别比较了各时间点各成分相对于0h的变化率。

表3溶液室温稳定性考察

有上表可知：3′-羟基葛根素不稳定，室温(25oC)放置容易降解，应在12h内进样，如需长时间保存，应保存在冰箱中(实验证实，样品保存于冰箱稳定性良好)。

2.4专属性试验：取空白溶剂(40％乙醇溶液)，对照溶液和供试品溶液各1uL分别进样，按前述分析方法进样，记录色谱图。结果表明，样品溶剂对测定成分未造成干扰。

2.5线性、定量限和检测限：取对照品储备溶液，依次稀释2倍，5倍，10倍，25倍，50倍，100倍，250倍，625倍，分别取1uL进样。记录色谱图，结果见表4和表5。

表4各对照品浓度及对应峰面积

表5各成分线性关系、定量限和检测限

将上述各成分的线性方程截距设置为零，各成分的斜率分别为：3′-羟基葛根素8.3993，葛根素10.435，葛根素-6”-O-木糖苷7.3135，3′-甲氧基葛根素8.0432，芹糖基葛根素苷7.0811，大豆苷10.221，由于葛根素是葛根中的主要成分，易于制备，因此选择它作为参照物，确定其他成分相对于葛根素的相对校正因子。如大豆苷的相对校正因子为10.435/10.221＝1.021，相对校正因子是待测物和参照物单位浓度溶液的响应比值，类似于内标法，在缺少待测物对照品时，可通过参照物结合相对校正因子确定待测物的浓度。配制两条标准曲线，测定相对校正因子结果如下：

表6相对校正因子

2.6精密度试验：连续三天，每天称取葛根粉末三份，每份0.15g，同2.2项下制备供试品溶液，取1uL进样，记录色谱图，计算峰面积RSD实验结果见表7。

表7：峰面积日内和日间精密度

2.7准确度试验(加样回收率)：精密称取对照品葛根素-6”-O-木糖苷3.98mg于20ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度。另外称取对照品3′-羟基葛根素5.41mg，葛根素18.82mg，3′-甲氧基葛根素4.06mg，芹糖基葛根素苷4.33mg，大豆苷3.12mg于25ml容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，移取5ml前述的葛根素-6”-O-木糖苷对照溶液5ml，加甲 醇稀释至刻度即得准确度加标用母液。

量取2.2项下制备的供试品溶液5ml于10ml容量瓶中，共9份，前面3份加入0.4ml上述母液(80％浓度)，中间三份加入0.5ml(100％浓度)，最后三份加入0.6ml(120％浓度)，用40％乙醇溶液定容至刻度。摇匀，0.22um滤膜过滤后分别取1ul进样，记录色谱图，计算实验结果见表8(注：回收率＝(实测量-加入的供试液中的量)/加入对照品量＊100％)

表8：加样回收率

2.8耐用性试验取供试品溶液1ul进样，考察(1)调整流动相A中醋酸的浓度为0.09％，0.1％和0.11％；(2)调整流速为0.38ml/min，0.40ml/min和0.42ml/min；(3)调整柱温为29oC，31oC和33oC对各成分分离度的影响，每次仅改变一个条件，其它条件保持不变。 实验结果见表9

表9耐用性试验结果

3分析方法的应用

3.1葛根药材指纹图谱

收集不同省份(湖北、河南、广西、陕西、浙江和安徽等地)的葛根药材，称取粉末0.15g，加40％乙醇50ml，称重，超声30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤即得，分别取1ul进样，记录色谱。将色谱图导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，通过该系统建立葛根药材的对照指纹图谱，共有12个共有特征峰(其中7个特征峰得到指认)，结果见图3。

3.2葛根提取物的检测：购得2份市售葛根提取物(均标示葛根素含量＞10％，总黄酮＞40％)。分别称取各提取物30mg于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声溶解并定容至刻度，0.22um滤膜过滤后取1ul进样。另取葛根对照药材粉末(中国食品药品检定研究院批 号：121551-201103)0.15g，加40％乙醇50ml，称重，超声30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤后取1ul进样，结果见图4(两家公司生产的产品的检测结果一致，仅列出一家结果)，如图所示，葛根提取物中含有的6种异黄酮类成分(3’-羟基葛根素(1)；葛根素(2)；葛根素-6”-O-木糖苷(3)；3’-甲氧基葛根素(4)；芹糖基葛根素苷(5)；大豆苷(6))与葛根对照药材一致，表明该分析方法适用于葛根提取物的检测和真伪鉴别(若为伪品，则检测不出上述6种成分)。

以其中一个厂家的检测结果计算其中葛根素的含量以及上述几种已知黄酮的含量见表10。

表10两种计算方式比较

注：(1)由对照液计算各成分浓度通过将各成分峰面积带入相应的线性方程计算得到。

(2)由葛根素作参照计算公式：C成＝r成＊F成/(r葛对/C葛对)，：C成：某种待测成分的浓度；r成：该成分的峰面积；F成：该成分的相对校正因子；C葛对：对照液中葛根素的浓度；r葛对：对照液图谱中葛根素的峰面积。如3′-羟基葛根素的由葛根素作参照计算浓度 为：C＝121.18544＊1.253/(1234.49182/124.914)＝15.36ug/ml。

该批次提取物称样量为30.03mg，如果不考虑水分，则葛根素的含量为77.79＊50/1000/30.03＝12.95％＞10％，与标示量相符。由于总黄酮采用紫外分光光度法检测，此处不予验证。

3.3含葛根中成药制剂的检测

3.3.1玉泉颗粒(处方组成：天花粉、葛根、麦冬、人参、茯苓、乌梅、黄芪、甘草、地黄和五味子等)

供试品溶液制备：将玉泉颗粒研磨至粉，称取0.45g与50ml容量瓶中，加入40％乙醇适量，超声30min后放冷，用40％乙醇定容至刻度，0.22um滤膜过滤后取1ul进样检测。结果见图5。如图所示，玉泉颗粒中可检测到葛根对照药材中的6种异黄酮类成分，表明该分析方法适用于葛根作主药的中成药制剂检测和质量控制(通过葛根素以及总异黄酮(上述6种异黄酮成分总和)的含量来控制)。

3.3.2康馨片(主要含有大豆异黄酮、大豆磷脂、枸杞子、葛根、芦荟等)供试品溶液制备：将康馨片磨成粉，称取0.1g于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声后放冷至室温，用40％乙醇定容至刻度，摇匀。0.22um滤膜过滤后取1ul进样。记录色谱图，结果见图6。如图所示，康馨片中的6种异黄酮成分与葛根对照药材一一对应，6种成分之间以及制剂中含有的大豆异黄酮类成分分离良好，表明该方法适用于包含葛根和大豆异黄酮类成分的制剂的检测和质量控制。

3.3.3糖脉康颗粒(处方包括黄芪、地黄、赤芍、丹参、葛根、桑叶、淫羊藿等)。供试品溶液制备：将糖脉康颗粒研磨成粉，称取0.4g于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声30min后放冷至室温，40％乙醇稀释至刻度，摇匀，0.22um滤膜过滤，取1ul进样。记录色谱图，结果见图7。如图所示，糖脉康颗粒中可检测到7种葛根异黄酮类成分，葛根在该 制剂中未作主药，表明该方法的灵敏度较高。

综上，本发明提供的方法可以准确快速的对葛根药材、提取物以及含有葛根的中成药制剂中的葛根来源成分进行质量控制，所需时间较短，14min以内即可完成分析。方法的灵敏度较高，具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1、图2：选取3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素-6”-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素苷和大豆苷等几种葛根中所含有的异黄酮作为标准品，图1位各成分紫外吸收图谱(DAD扫描)。图2为混合对照品和样品图谱：A为混合对照品溶液，B为样品溶液。

图3葛根药材指纹图谱峰3：3’-羟基葛根素；峰5：葛根素；峰6：葛根素-6”-O-木糖苷；峰7：3’-甲氧基葛根素；峰8：芹糖基葛根素苷；峰9：大豆苷；峰12：大豆苷元(因对照品仅供鉴别用，未建立其标准曲线)》。

图4葛根提取物及葛根药材对照图谱。

图5玉泉颗粒与葛根药材的对照图谱。

图6康馨片和葛根药材对照图谱。

图7：糖脉康颗粒和葛根药材对照图谱。

具体实施方式

实施例1：葛根提取物的检测

购得2份市售葛根提取物(均标示葛根素含量＞10％，总黄酮＞40％)。分别称取各提取物30mg于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声溶解并定容至刻度，0.22um滤膜过滤后取1ul进样。另取葛根对照药材粉末(中国食品药品检定研究院批号：121551-201103)0.15g，加40％乙醇50ml，称重，超声30min，放冷至室温，用40％乙醇补足至原重，摇匀，0.22um滤膜过滤后取1ul进样，结果见图3(两家公司生产的产品的检测结果一致，仅列出一家结 果)，如图所示，葛根提取物中含有的6种异黄酮类成分(3’-羟基葛根素(1)；葛根素(2)；葛根素-6”-O-木糖苷(3)；3’-甲氧基葛根素(4)；芹糖基葛根素苷(5)；大豆苷(6))与葛根对照药材一致，表明该分析方法适用于葛根提取物的检测和真伪鉴别(若为伪品，则检测不出上述6种成分)

以其中一个厂家的检测结果计算其中葛根素的含量以及上述几种已知黄酮的含量见表10。

表10两种计算方式比较

注：(1)由对照液计算各成分浓度通过将各成分峰面积带入相应的线性方程计算得到。

(2)由葛根素作参照计算公式：C成＝r成＊F成/(r葛对/C葛对)，：C成：某种待测成分的浓度；r成：该成分的峰面积；F成：该成分的相对校正因子；C葛对：对照液中葛根素 的浓度；r葛对：对照液图谱中葛根素的峰面积。如3′-羟基葛根素的由葛根素作参照计算浓度为：C＝121.18544＊1.253/(1234.49182/124.914)＝15.36ug/ml。

该批次提取物称样量为30.03mg，如果不考虑水分，则葛根素的含量为77.79＊50/1000/30.03＝12.95％＞10％，与标示量相符。由于总黄酮采用紫外分光光度法检测，此处不予验证。

实施例2：含葛根中成药制剂玉泉颗粒的检测

玉泉颗粒(处方组成：天花粉、葛根、麦冬、人参、茯苓、乌梅、黄芪、甘草、地黄和五味子等)。供试品溶液制备：将玉泉颗粒研磨至粉，称取0.45g与50ml容量瓶中，加入40％乙醇适量，超声30min后放冷，用40％乙醇定容至刻度，0.22um滤膜过滤后取1ul进样检测。结果见图5。如图所示，玉泉颗粒中可检测到葛根对照药材中的6种异黄酮类成分，表明该分析方法适用于葛根作主药的中成药制剂检测和质量控制(通过葛根素以及总异黄酮(上述6种异黄酮成分总和)的含量来控制)。

实施例3：含葛根中成药制剂康馨片的检测

康馨片(主要含有大豆异黄酮、大豆磷脂、枸杞子、葛根、芦荟等。供试品溶液制备：将康馨片磨成粉，称取0.1g于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声后放冷至室温，用40％乙醇定容至刻度，摇匀。0.22um滤膜过滤后取1ul进样。记录色谱图，结果见图6。如图所示，康馨片中的6种异黄酮成分与葛根对照药材一一对应，6种成分之间以及制剂中含有的大豆异黄酮类成分分离良好，表明该方法适用于包含葛根和大豆异黄酮类成分的制剂的检测和质量控制。

实施例4：含葛根中成药制剂糖脉康颗粒的检测

糖脉康颗粒(处方包括黄芪、地黄、赤芍、丹参、葛根、桑叶、淫羊藿等)。供试品溶液制备：将糖脉康颗粒研磨成粉，称取0.4g于50ml容量瓶中，加入40％乙醇超声30min 后放冷至室温，40％乙醇稀释至刻度，摇匀，0.22um滤膜过滤，取1ul进样。记录色谱图，结果见图7。如图所示，糖脉康颗粒中可检测到7种葛根异黄酮类成分，葛根在该制剂中未作主药，表明该方法的灵敏度较高。