一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法

摘要

本发明涉及一种利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术检测22q11.2拷贝数缺失的方法，其包括检测CLTCL1、SNAP29、KLHL22、PI4KA和CFTR基因的步骤。本发明还提供该方法涉及的引物组合、试剂盒。其优点表现在：操作简便快捷，仅包括PCR反应及后续HRM分析过程，减短了检测周期；实现了闭管操作，由于在PCR反应中已加入荧光染料，检测片段扩增完成后不再需要其他处理，即可进行HRM曲线分析，有效避免污染；反应中仅需要常规PCR反应试剂及少量荧光染料，不需要特殊的检测及分析仪器；对99例患者及正常人对照样本进行检测，灵敏性与特异性均达到100％，体系的稳定性和准确性得到证实。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术检测22q11.2拷贝数缺失的方法。

背景技术

22q11.2微缺失综合征是临床最常见的遗传综合征，该综合征的发生是由于22号染色体长臂近着丝粒端微片段22q11.21-q11.23缺失引起的。其核心区域位于22q11.2区域上低拷贝重复序列LCR22-A至LCR22-D间，大小为3Mb，约90％的综合征患者表现为该片段一个拷贝数的整体缺失，亦有部分患者为不同低拷贝重复序列间的缺失组合。根据临床表现与特征，可对该综合征病人作初步诊断，而对22q11.2缺失片段的检测是该病确诊的重要依据。

目前拷贝数变异(Copynumbervariation,CNV)的检测方法主要有基于芯片的全基因组扫描技术和基于PCR技术的候选CNV检测技术两大类，不同方法的可靠性、操作难易度及经济性等指标均不尽相同。基于芯片的CNV检测技术主要包括比较基因组杂交、单核苷酸多态性芯片及新一代测序技术，这些技术适用于CNV的高通量检测，有利于发现与疾病有关的新的拷贝数变异，但较高的成本限制了它们的广泛使用。在对如22q11.2微缺失综合征等缺失片段较明确的疾病检测中，候选CNV检测技术更为适合。

限量dNTP竞争性PCR是在常规PCR基础上的一种改进，在同一反应管内，靶基因和参考基因进行同步扩增，其中dNTP的量是限定的，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，而扩增产物的比值和它们初始状态时模板的相对定量是一致的。

高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting，HRM)是美国犹他大学Wittwer等人在2003年首次提出的基因突变检测的新技术。该技术在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，通过饱和染料监控核酸的熔解过程，得到特征的熔解曲线，再根据熔解曲线的不同来判断核酸性质的差异。

中国专利文献CN101555528A公开了一种染色体22q11.2区微缺失、微重复的测定方法：抽提基因组DNA；进行多重荧光定量PCR复合扩增，复合扩增体系中包括了5个STR标记：D22S873，22D_5_1，22D_4_5，2D_4_4，22D_4_3和一个内参G6PDH；取PCR扩增产物变性使双链产物转化为可为毛细管电泳分析的单链，采用毛细管电泳对上述变性产物进行产物长度和产物量分析；采用量比值分析的方法和/或采用峰的位置及数量分析的方法判断是否为正常、微缺失或微重复。中国专利文献CN102533974A公开了一种检测22q11微缺失综合征的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针。但是关于本发明的灵敏性、特异性、稳定性和准确性高的利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术检测22q11.2拷贝数缺失的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测22q11.2拷贝数缺失的试剂盒。

本发明的再一的目的是，提供一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法。

本发明的另一的目的是，提供一种检测22q11.2拷贝数缺失的引物组合。

本发明的第四个目的是，提供所述的引物组合的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种检测22q11.2拷贝数缺失的试剂盒，所述的试剂盒含有以CFTR基因为对照基因，检测CLTCL1、SNAP29、KLHL22和PI4KA基因拷贝数的试剂。

进一步地，所述的试剂盒包含操作说明书，所述的操作说明书记载有以下内容：检测反应包括两个双重PCR反应和一个三重PCR反应，检测CLTCL1、CFTR基因组合为双重PCR反应体系，检测SNAP29、CFTR基因组合为双重PCR反应体系，检测KLHL22、PI4KA和CFTR基因组合为三重PCR反应体系。

进一步地，所述的试剂盒中的引物分别为：CLTCL1上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CLTCL1下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；SNAP29上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，SNAP29下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；KLHL22上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，KLHL22下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；PI4KA上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，PI4KA下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；CFTR上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，CFTR下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。

进一步地，所述的试剂盒包含Mg²⁺、Taq酶、dNTP、荧光染料和引物。

进一步地，所述的试剂盒中dNTP是限定含量的。

进一步地，所述的操作说明书记载有以下内容：PCR反应体系为：2mM MgCl₂、0.4UKlenTaq酶、6.25μM>Plus染料、基因组DNA 50ng，引物浓度分别为：CFTR 0.125μM；CLTCL10.5μM；SNAP291μM；KLHL221μM；PI4KA 0.5μM。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法，所述的方法包括以下步骤：先进行限量dNTP竞争性PCR反应，再进行HRM分析。

进一步地，PCR反应及HRM分析均在实时荧光定量PCR分析仪上进行，PCR反应条件为95℃1分钟预变性，35个循环的95℃变性10s、64℃退火30s；PCR扩增结束后，继续在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行65℃至95℃程序升温，温度每上升0.2℃记录一次荧光信号，荧光信号随温度的变化即形成高分辨率熔解曲线。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测22q11.2拷贝数缺失的引物组合，所述的引物组合包含用于检测CLTCL1、SNAP29、KLHL22、PI4KA和CFTR基因的引物，引物序列分别为：CLTCL1上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CLTCL1下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；SNAP29上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，SNAP29下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；KLHL22上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，KLHL22下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；PI4KA上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，PI4KA下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；CFTR上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，CFTR下游引物的序列如SEQID NO:10所示。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的引物组合在制备检测22q11.2拷贝数缺失的试剂或试剂盒中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明的检测方法操作简便快捷，整个检测过程仅包括PCR反应及后续HRM分析过程，减短了检测周期。

2、本发明的检测方法实现了闭管操作，由于在PCR反应中已加入荧光染料，检测片段扩增完成后不再需要其他处理，即可进行HRM曲线分析，有效避免污染。

3、本发明的检测方法成本低廉，在反应中仅需要常规PCR反应试剂及少量荧光染料，不需要特殊的检测及分析仪器，大大缩减了成本投入。

4、本发明选择了合适的基因，设计了恰当的引物序列，PCR反应体系和程序设置合理，采用本发明的检测方法对已知22q11.2拷贝数缺失患者及正常对照样本进行分析，并将结果与MLPA检测结果进行比对，进一步证实了该技术的高准确度与可行性，在22q11.2微缺失检测及大规模人群筛查中具有极大优势。

附图说明

附图1：22q11.2区域低拷贝重复序列分布及目标基因定位。

附图2：CLTCL1拷贝数检测结果，图中曲线分别为CFTR参考序列熔解峰及CLTCL1检测序列熔解峰。其中，曲线1为拷贝数缺失样本(拷贝数＝1)，曲线2为正常对照样本(拷贝数＝2)。-dF/dT：荧光相对于温度的一阶负导数。

附图3：SNAP29拷贝数检测结果，图中曲线分别为CFTR参考序列熔解峰及SNAP29检测序列熔解峰。其中，曲线1为拷贝数缺失样本(拷贝数＝1)，曲线2为正常对照样本(拷贝数＝2)。-dF/dT：荧光相对于温度的一阶负导数。

附图4：PI4KA及KLHL22拷贝数检测结果，图中曲线分别为CFTR参考序列熔解峰及PI4KA、KLHL22检测序列熔解峰。其中，曲线1为拷贝数缺失样本(拷贝数＝1)，曲线2为正常对照样本(拷贝数＝2)，曲线3为PI4KA基因拷贝数正常、KLHL22基因拷贝数缺失样本。-dF/dT：荧光相对于温度的一阶负导数。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术，建立了22q11.2拷贝数缺失快速检测方法，针对其核心区域上的特定基因进行拷贝数变异检测。为了在检测缺失的同时判断缺失片段长度范围，我们在引物设计时选择了位于不同低拷贝重复序列间的四个基因，不同拷贝数组合对应不同缺失范围。

实施例1检测方法

1、引物设计：

针对22q11.2拷贝数缺失疾病特点，选择位于染色体22q11.2区域不同低拷贝重复序列(Low copy repeats,LCR)间的基因(LCR22A-B:CLTCL1；LCR22B-C:KLHL22；LCR22C-D:PI4KA/SNAP29)作为检测对象(图1)，设计四对PCR扩增引物，分别用以扩增以上基因中的片段，同时选择位于不同染色体上的CFTR基因，设计引物以作为参考序列。引物设计时，将PCR产物长度控制在50-120bps，同时预测产物的熔解曲线和Tms值，将目标序列和参考序列之间的Tm差异设定在2℃和10℃之间。通过搜索人类基因组数据库确认目标和参考引物的特异性，同时使扩增片段尽量避开SNP位点。根据以上引物设计原则，选择符合条件的PCR引物，PCR引物序列及产物长度信息如表1所示：

表1 PCR引物序列及产物长度信息

2、PCR扩增体系：

PCR总体积为10μl，含上游与下游引物0.125μM-1μM，同时包括2mM MgCl₂，0.4UKlenTaq酶，6.25μM>Plus染料及基因组DNA 50ng。总检测体系共包括两个双重PCR反应及一个三重PCR反应，引物浓度分别为：CFTR 0.125μM；CLTCL10.5μM；SNAP291μM；KLHL221μM；PI4KA 0.5μM。

3、PCR扩增及HRM条件：

PCR及HRM反应均在Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪上进行，PCR反应条件为95℃1分钟预变性，35个循环的95℃变性10s、64℃退火30s。扩增结束后，继续在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行65℃至95℃程序升温，温度每上升0.2℃记录一次荧光信号，荧光信号随温度的变化即形成高分辨率熔解曲线。

实施例2检测方法的验证

材料

Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(Qiagen)，KlenTaq酶(Ab Peptides)，Plus染料(BioFire Defense)，引物(华大基因生物科技有限公司)，人基因组DNA样本(提取自22q11.2微缺失患者及正常对照人群)。

方法

为了验证实施例1的检测方法，我们利用所建立体系对99例22q11.2区域拷贝数缺失患者及正常人对照样本进行检测，每个标本均进行三次实验重复，并以多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification,MLPA)对结果进行验证。

结果

本研究利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术建立了一种22q11.2拷贝数缺失的快速检测方法，该体系利用三个竞争PCR反应检测位于22q11.2不同低拷贝重复序列间的四个基因的拷贝数情况，用以判断该染色体区域的缺失情况并确定缺失范围。CLTCL1基因及SNAP29基因位于LCR22A-LCR22B及LCR22C-LCR22D区域，分别与CFTR参考序列组合为双重PCR反应，KLHL22及PI4KA位于LCR22B-LCR22C及LCR22C-LCR22D区域，与CFTR参考序列组合为三重PCR反应体系用于拷贝数检测。多重PCR反应体系中，不同的扩增子由于Tm值的不同，荧光快速下降区域分布在不同的温度区间，相互间得以区分。同时，本研究通过降低dNTP浓度，有效和可靠的控制PCR扩增，不同扩增产物的相对定量信息可通过荧光信号的强弱得以体现，因而可在双重或三重PCR后，通过对位于不同染色体上的参考PCR产物进行标化来进行拷贝数相对定量。如图2、3、4分别为以上三个检测反应的结果图，每个检测过程均包括目标基因2拷贝的正常对照样本及1拷贝的缺失患者，通过对CFTR基因的标化，我们能明确识别CLTCL1、KLHL22、PI4KA及SNAP29的拷贝数情况。分析本方法对99例22q11.2区域拷贝数缺失患者与正常人对照样本(38例LCR22A-LCR22D缺失，3例LCR22A-LCR22B缺失，2例LCR22A-LCR22C缺失及56例正常对照样本)的检测结果可知，本体系对每例标本三次重复实验的结果均一致，且与MLPA结果相同，灵敏性与特异性均达到100％，证明了本体系的稳定性和准确性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

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