一种转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测引物、检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测引物、检测方法和试剂盒。本发明针对转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性序列(美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端邻接区序列)设计引物和TaqMan探针，建立转基因鲑鱼实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现，其具有特异性强，灵敏度高，检测灵敏度为60拷贝，检测重复性良好，可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定，满足监管部门对其转基因鲑鱼正确标识的需求。

说明书

技术领域：

本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及一种转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性检测引物、检测方法和试剂盒。

背景技术：

美国食品药品管理局(U.S.food and Drug Administration,FDA)2015年11月16日发布公告确定水优鲑鱼(三文鱼)(商品名AquAdvantage Salmon,AAS)与非转基因鲑鱼一样安全，这标志着转基因鲑鱼获得美国权威机构的最终批准，依法可以商业销售及食用。

转基因鲑鱼由加拿大水丰(AquaBounty)公司研发，自1995年水丰公司致函美国FDA申请调查开始，到获得批准所花时间约二十年。AAS经由显微注射构建的opAFP-GHc2(the regulatory sequences of an antifreeze protein(AFP)gene,opAFP,；theprotein coding domain of a growth hormone gene,GHc2)到野生鲑鱼鱼卵研发而成，所使用的转基因元件来自大鳞大马哈鱼(王鲑)的生长激素蛋白编码区和美洲绵鳚抗冻蛋白基因调控序列。重组后的生长激素基因可让鲑鱼的寒冷环境下仍然保持生长，使转基因鲑鱼达到上市规格的生长周期由3年缩短至18个月，大大降低了鲑鱼的养殖成本。

转基因鲑鱼直接食用的安全性和生态安全性是人们普遍担心问题。转基因鲑鱼可能与自然环境中的其他鱼种发生有性交配，导致转基因漂移到自然鱼中，影响物种遗传多样性，或产生其他的未知风险。目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specific PCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(Screening PCR)、基因特异性PCR(Gene-specific PCR)、构建特异性PCR(Construct-specific PCR)具有更加高的具有高有特异性，能用于检测鉴定转基因具体品系，是目前转基因检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性检测引物。

本发明的转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明还提供了相配套的检测探针，所述的检测探针为：5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

优选，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明的转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Aqu-F：5‘-CACGTTGTACTGCTGATA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Aqu-R：5‘-GTGGTTTAGTTCTCATACATC-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

所述的检测探针如下所示：

5‘-CCTCACGTTGTACTACTGATACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

本发明的转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA的作为模板；

(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；

(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因鲑鱼AquAdvantage品系。

优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：20μL体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品中是否为转基因鲑鱼AquAdvantage品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因鲑鱼AquAdvantage品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不为转基因鲑鱼AquAdvantage品系。

本发明还提供转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取转基因鲑鱼AquAdvantage品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物、检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；

(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始浓度的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到转基因鲑鱼AquAdvantage品系的标准曲线；

提取待检样品的DNA，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物、检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入转基因鲑鱼AquAdvantage品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因鲑鱼AquAdvantage品系的量。

本发明针对转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性序列(美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端邻接区序列)设计引物和TaqMan探针，建立转基因鲑鱼实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现，其具有特异性强，灵敏度高，检测灵敏度为60拷贝，检测重复性良好，可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定，满足监管部门对其转基因鲑鱼正确标识的需求。

附图说明：

图1是退火温度为60℃时A组、B组和C组引物探针扩增图，从左到右分别为A组、B组和C组扩增曲线；

图2是退火温度为58℃时A组、B组和C组引物探针扩增图，从左到右分别为A组、B组和C组扩增曲线；

图3是转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法特异性实验结果，阳性扩增曲线为AFP-Aqu质粒分子；阴性信号分别为：西洋鲑鱼、赤鮸鱼、带鱼、金线鱼、龙虾、鲈鱼、乌鲳鱼、鲳鱼、帝王蟹、青口贝和白虾、阴性对照和空白对照；

图4是灵敏度试验结果，阳性信号从左到右分别为：阳性对照，300、150和30copies/μL质粒DNA，阴性信号为阴性对照；

图5是可重复性测试扩增曲线，阳性信号从左到右分别为：300000、30000、15000、3000、1500、300、150和30copies/μL质粒DNA；

图6是标准曲线。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。

实施例1：

1材料与方法

1.1材料与试剂

大西洋鲑鱼、赤鮸鱼、带鱼、金线鱼、龙虾、鲈鱼、乌鲳鱼、鲳鱼、帝王蟹、青口贝和白虾由本实验室收集储备，转基因鲑鱼内源生长激素(growth hormone，GH)和AAS品系特异性双基因阳性质粒(将GH基因片段160bp序列和AAS品系特异性片段150bp序列构建到AmpR抗性的PUC57载体上，构建得到的质粒转入受体菌DH5a后-70℃保存。以下称AFP-Aqu质粒)为本实验室构建。

GH基因片段序列：CACGCATCCA CCCCACCATG CATCTCTCTC TGTCTCCCACAGGGGAGCCAGGATGGCGTA CTGAGCCTGG ATGACAATGA CTCTCAGCAT CTGCCTCCCT ACGGGAACTA CTACCAGAACCTGGGGGGCG ATGGCAACATCAGGAGAAAC TACGAACTGT。

AAS品系特异性片段序列：GTTGTACTGC TGATGCCTCT GATACCACACAGACTGGGCCTCACGTTGTA CTGCTGATAC CACACAGACT GGGCCTCACGTTGTACTACT GATACCACAC AGTAGTACAACGTTGGCAGA TGTATGAGAACTAAACCACT GACTGAACTT。

基因组DNA纯化试剂盒普洛麦格(北京)生物技术；Primex>

1.2仪器与设备

ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA。

1.3方法

1.3.1DNA提取

称取研磨后的100mg鱼肉样品，使用基因组DNA纯化试剂盒并按其操作步骤提取DNA，每次DNA提取均设置提取空白对照。微量分光光度计nanodrop2000c测定浓度。

1.3.2实时荧光PCR检测方法的建立与优化

根据转入的美洲绵鳚抗冻蛋白基因美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端邻接区序列(AAS品系特异性片段)，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。将设计的引物、探针经NCBI网站上使用BLAST数据库比对确定引物和探针的理论特异性；鲑鱼内源基因采用于鱼类生长激素(growth hormone，GH)，用于鲑鱼来源样品DNA的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1

表1实时荧光PCR的引物、探针

扩增反应20μL体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

1.3.3实时荧光PCR方法特异性测试

采用大西洋鲑鱼、赤鮸鱼、带鱼、金线鱼、龙虾、鲈鱼、乌鲳鱼、鲳鱼、帝王蟹、青口贝和白虾的DNA为模板，阳性样品为转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒，阴性对照为大豆DNA。对建立的实时荧光PCR检测方法的特异性测试。

扩增反应20μL体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃ 30s；95℃ 5s、60℃ 34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

1.3.4灵敏度测试

将转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒DNA用ddH₂O稀释至300、150和30copies/μL分别进行扩增，测定本方法的检测下限(limit>

扩增反应20μL体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

1.3.5可重复性测试及标准曲线建立

将分别将提取的质粒DNA(AFP-Aqu质粒)溶液稀释至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30、6copies/μL，加入2μL DNA作为模板，进行转基因鲑鱼实时荧光PCR检测，每个样品3个平行，根据其Ct值的计算标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)，并根据其线性范围建立标准曲线。，

扩增反应20μL体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

2结果与分析

2.1实时荧光PCR检测方法的建立与优化

退火温度为60℃时，A组、B组和C组的引物和探针终浓度配比结果如图1所示，A、B和C组引物与探针均得到良好的扩增曲线，Ct值分别为23.60±0.01、23.07±0.01、25.935±0.07，A和B组对应的Ct值无显著差异，但C组与A、B两组Ct值间存在极显著差异(P＜0.01)，结合扩增曲线、Ct值及经济性，拟选择B组作为体系反应的浓度。

退火温度在58℃时，A、B和C不同的引物和探针终浓度配比结果如图2所示，A组、B组和C组引物与探针均得到良好的扩增曲线，其Ct值分别为：23.23±0.01、23.97±0.04、26.85±0.14，同样的A和B组对应的Ct值差异不明显，如图2，但C组与A、B两组Ct值间存在极显著差异(P＜0.01)，结合扩增曲线、Ct值及经济性，选择B组作为体系反应的浓度。

B组引物探针在58℃和60℃检测的Ct值相差不明显，结合酶系推荐的最佳反应温度及方法的通用性，选择退火温度为60℃。

结合Ct值和扩增曲线最后确定的20μL反应体系如下：Premix Ex TaqTM 10μL，ROXReference Dye II 0.2μL，10μmol/L Aqu-F和Aqu-R各0.4μL，探针Aqu-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.2μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

2.2实时荧光PCR方法特异性测试

以大西洋鲑鱼等11种非转基因鲑鱼和转基因鲑鱼阳性质粒AFP-Aqu质粒的DNA为模板，采用ASS的品系特异异引物和探针Aqu-F/R/P进行实时荧光PCR扩增，如图3所示，只有转基因鲑鱼AFP-Aqu质粒的DNA成功扩增，其他11种DNA样本及阴性对照、空白对照无实时荧光扩增曲线。上述结果表明针对转基因鲑鱼品系特异性序列的引物与探针特异性良好。

2.3灵敏度测试

采用转基因鲑鱼质粒样品DNA(AFP-Aqu质粒)的30、150、300copies/μL梯度分别进行扩增，每个浓度20个重复，检测结果如表2，图4所示。以30copies/μL浓度时扩增20次均出现阳性扩增，因此本方法的LOD为60copies质粒DNA。随着DNA浓度降低，SD值逐渐变大，为得到稳定的扩增和定量结果，Ct值间的SD值应小于0.25。本研究中，当以60拷贝DNA为模板时，SD值为0.30，而以300拷贝DNA为模板时，SD值为0.13，故本研究建立的实时荧光PCR方法的LOQ为300拷贝的ASS质粒DNA。

表2转基因鲑鱼AAS品系特异性实时荧光PCR方法灵敏度测试

2.4可重复性测试及标准曲线建立

将分别将提取的质粒DNA(AFP-Aqu质粒)溶液稀释至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30、15copies/μL，加入2μL DNA作为模板，进行转基因鲑鱼实时荧光PCR检测，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，计算Ct值的标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)如表3所示。扩增图如图5所示，由表3可知，300000-30copies/μL的8个浓度梯度所得的Ct值表明，其SD介于0.06-0.35，RSD介于0.12％-1.01％均在可接受范围内。即在线性范围600000～60拷贝内可重复性良好。采用300000～30copies/μL的8个浓度梯度所得Ct建立标准曲线，其线性回归方程为：y＝-3.2194x+40.805,R²为0.997，大于0.98，扩增效率为104％(介于90％～110％)，表明其线性相关性良好，扩增效率高，均符合ENGL相关要求[Definition>

表3实时荧光PCR方法的可重复性测试

3、结论

转基因三文鱼是世界上第一个获批可直接食用的动物来源的转基因食品，相比其他商业化已经19年的转基因作物如大豆和玉米等食品，虽然直接食用是合法的，但目前还是主要用于饲料或食品添加剂，供消费者直接食用的转基因甜玉米至今尚未在美国超市销售。转基因大豆作为直接入口的食品是食用油。可以预测，转基因三文鱼被批准直接食用，将推动转基因作物食品的直接食用。此外，转基因三文鱼获得批准可商业化食用另一个重在影响，是将促进接踵而来的其他转基因动物性食品产业化，在水丰技术公司(AquabountyTechnologies)转基因鲑鱼等待审批的十几年中，其实已有20家30种转基因鱼和转基因动物正在研究开发之中，其中有几种已经向FDA申请商业化。批准了转基因鲑鱼商业化，为后面一大批送审的其他转基因食用动物打开一扇大门，其影响不可估量。可能在不久的将来，转基因鲑鱼将游上百姓的餐桌。为了保障消费者的知情权和选择权，为监管部门提供鉴定标识的技术支持，建立准确、高效、快速的转基因鲑鱼检测技术至关重要。本文针对美洲绵鳚抗冻蛋白基因启动子区域与鲑鱼基因组5’端邻接区序列建立的转基因鲑鱼品系特异性实时荧光PCR方法，可对转基因鲑鱼AquAdvantage进行品系特异性快速检测，满足检测监管部门对其进行标识的需求。