Rh血型不合溶血病治疗仪

摘要

本发明涉及医学领域的Rh血型不合溶血病治疗仪，其特征在于以渗透浓度为25和35mmol/L的PB裂解液交替洗涤含有人类共同Rh抗原的恒河猴红细胞，制成透析了血红蛋白但保留Rh抗原性的能吸附Rh抗体的血影细胞，与以免疫学制备的抗Rh抗体共同以特定配比固定于特制浓度的琼脂糖，继之装配高生物相容性材料制成的圆柱形吸附器，使之从进样端至出样端形成从高到低的抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度但血影细胞为均匀分布，而且近出样端因浓度渐高而分子微孔渐小的特制浓度的琼脂糖和吸附器出口处的网筛都能有效阻留溶血病患者的红细胞破坏产物，是一种仅去除致病抗体，不去除血浆成份的无毒副作用的母胎Rh血型不合溶血病的治疗新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于医学领域的Rh血型不合溶血病治疗仪，主要用于母胎Rh血型不合孕妇血浆中抗胎儿红细胞抗体及红细胞溶解产物的清除。

背景技术

胎儿继承父亲和母亲各一半的基因成分，胎儿红细胞可以携带来自父体的抗原，表现为胎儿的血型不同于母体。当胎儿的红细胞进入母体的血液循环后，诱导母体的免疫系统产生抗体，抗体经过胎盘进入胎儿血液循环系统，结合胎儿红细胞，使胎儿红细胞被破坏，导致胎儿和新生儿的母胎血型不合溶血性疾病。

人类红细胞血型有26种，包括ABO血型、Rh血型以及MN、Lew、Kell和Fya等血型，但能引起母胎血型不合溶血病的血型以Rh血型和ABO血型为最常见。Rh是恒河猴(RhesusMacacus)外文名称的头两个字母。1940年，兰德斯坦纳等科学家在用恒河猴的红细胞免疫豚鼠和家兔时，结果在豚鼠和家兔血清中产生抗恒河猴红细胞的抗体(凝集素)，再用含这种抗体的血清与人的红细胞混合，发现约有85％白种人的红细胞可被这种血清凝集，表明这些白种人的红细胞上具有与恒河猴相同的抗原，故称为Rh阳性血型；另约有15％白种人的红细胞不被这种血清凝集，称为Rh阴性血型，这一血型系统即称为Rh血型。Rh血型抗原是由1号染色体上3对紧密连锁的等位基因决定的，共有6种抗原，即C和c，D和d，E和e。由于D抗原最早被发现，抗原性最强，故临床上凡是D抗原阳性者称为Rh阳性，无D抗原者称为Rh阴性。Rh血型抗原的抗原性决定了溶血病的严重程度，D抗原可引起严重的溶血病，其次为E抗原，再次为C、c和e抗原，d抗原的抗原性最弱，目前尚无抗d抗体发现。在我国汉族和其它大部分民族，Rh阳性的人约占99％，Rh阴性的人只占1％左右，但在另一些少数民族中，Rh阴性的人较多，如苗族为12.3％，塔塔尔族为15.8％。

虽然ABO血型不合的发生率很高，但胎儿溶血发生率很低，即使发生溶血，症状亦较轻，极少发生核黄疸和水肿，妊娠期无需特殊处理。而Rh血型不合虽然少见，但其引起母胎血型不合溶血病的病情程度要重于ABO血型不合，所以对Rh血型不合的诊断及预防极其重要。Rh血型不合由于母体产生大量抗胎儿红细胞的Rh抗体(IgG抗-D)，进入胎儿体内后破坏大量的胎儿红细胞，使胎儿严重贫血、缺氧、心衰、肝脏损伤、低蛋白血症、全身水肿、胸水、腹水甚至胎死宫内。在新生儿时期，Rh血型不合溶血较ABO血型不合出现黄疸时间早，最早出现在出生后12小时内，多数出现在24小时内。由于溶血产生的大量胆红素不能及时从肝脏排除，使新生儿黄疸加重，大量的胆红素渗入脑细胞而引起核黄疸，常死于严重贫血、心力衰竭、核黄疸，死亡率很高。

虽然Rh抗体进入胎儿体内后通过破坏胎儿的红细胞可引发严重的溶血病，但某些孕妇也能通过预先注射Rh抗体来预防入侵的Rh(D)阳性红细胞致敏机体，进而能预防Rh溶血病的发生。由于目前大多数国家已禁止用志愿者进行D抗原免疫，多克隆Ig抗-D的来源已十分有限，而利用EB病毒转化人B淋巴细胞分泌Ig抗-D或EB病毒转化结合细胞融合制备Ig抗-D，因在体内使用EBV转化的B淋巴细胞株或杂交瘤细胞株分泌的Ig抗-D仍存在很多问题，如所含的EBV有潜在的致病性；可能带有HIV和肝炎病毒等病原体；用杂交瘤技术生产的Ig抗-D含鼠源蛋白、容易引起过敏反应、或带有鼠的癌基因，所以通过直接在体内注射Ig抗-D来预防Rh溶血病就受到了限制。

目前临床上对母胎血型不合溶血病的治疗主要有孕期血浆置换、胎儿输血、终止妊娠和新生儿换血治疗。抗-D效价在32以上需考虑宫内输血，胎儿输血包括胎儿腹腔内输血和胎儿血管内输血，均具有一定风险，且无一被证实有效；新生儿高胆红素血症者可采用蓝光照射、静脉注射免疫球蛋白等药物治疗，必要时换血治疗，换血治疗仍为治疗新生儿溶血病的主要方法；妊娠期间抗-D效价在64以上，需考虑血浆置换治疗，孕妇血浆置换就是在体外循环通路中以滤过法分离孕妇的血细胞和血浆，去除血浆并以等量的置换液(新鲜冰冻血浆或5％白蛋白)补充回输，每次置换量2 000～3 000ml、速度20～30ml/min、治疗时间2～4h、每1～3d治疗1次；或每次取孕妇全血约400ml，低温离心后去其血浆约300ml，补充等量同型新鲜血浆，还输自身红细胞(RBC)。血浆置换能与被去除的血浆量成比例地降低致病抗体的滴度(效价)，从而能延长胎儿在母体内的存活和生长发育时间、能延迟终止妊娠的时间，是母胎ABO、Rh或其它血型不合的孕妇在临床早期保胎治疗上的良好选择，具有较好的疗效，也无其他不良反应。但血浆置换只能去除血液中的部分抗体，不能中止抗体的继续产生，也不能逆转已发生的母胎血型不合溶血病，需要不间断地进行血浆置换才有效，仅适用于曾在妊娠20～22周前发生过胎儿水肿的孕妇，或配偶为致病抗原的纯合子者，特别是在去除部份致病抗体的同时，也一同去除了大量的血浆(多种有益成份)，虽然以置换液作了补充，但无法完全补足被去除血浆及其各种有益成份，而且替补的置换液量大、费用昂贵，补充异体血浆易致传染病和输液反应等各种副作用，这就限制了血浆置换的普遍开展。所以，迫切需要一种仅去除致病抗体、不去除血浆(多种有益成份)、无需使用血浆置换液的廉价、安全、无副作用的母胎血型不合溶血病的血浆置换治疗新方法。

凝胶中抗原-抗体沉淀反应于1905年首先应用于研究利泽甘氏现象，1932年应用于鉴定细菌菌株，1946年Oudin在试管中进行免疫扩散试验，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分别建立了琼脂双向扩散法，用于鉴定两种以上抗原或抗体。凝胶中抗原-抗体沉淀反应的介质凝胶琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝成凝胶，内部形成一种多孔的网状结构，而且孔径很大，可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度，琼脂浓度大，孔径相对较小，琼脂浓度小，孔径相对较大。1％琼脂凝胶的孔径约为85nm，由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性，凝胶后含水量大，透明度好，来源方便，易处理，因此是一种很好的扩散介质。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，在凝胶中基本呈自由扩散。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，这种沉淀就形成了一个“特异性屏障”，凡与其相同的抗原或抗体分子不能通过，而性质不同的分子可以通过这个屏障而继续扩散，直到形成它们自己的复合物为止。这样，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此种反应称为琼脂凝胶扩散，是目前用已知抗体检测未知量相应抗原的常规实验诊断项目，通常将一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人Ig抗血清的琼脂板，当待检血清在琼脂板中扩散时，在抗原和抗体比例合适处发生结合，形成肉眼可见的白色沉淀而不再扩散，另外当母胎血型不合产生抗胎儿红细胞抗体时，抗体与红细胞结合后在补体的参与下致红细胞破坏，产生较大分子的破坏产物，能被某些特定大小的微孔所阻留。但至今未见据上述机制设计治疗血型不合溶血病的报道。

发明内容

为了解决久攻不克的母胎Rh血型不合溶血病的治疗问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供Rh血型不合溶血病治疗仪；另一目的是要提供治疗仪的制备及应用方法。

本发明的目的是这样实现的：配制渗透浓度为25和35mmol/L的PH7.4的PB裂解液，交替洗涤含有人类共同Rh抗原的恒河猴红细胞，制成透析了血红蛋白但保留抗原性而能有效吸附Rh抗体的血影细胞，另以EB病毒永生化经Rh阳性红细胞致敏后能产生Rh抗体的B淋巴细胞，并将之与人和/或鼠骨髓瘤细胞溶合成为杂交瘤B淋巴细胞，制备Rh抗体，转而作为抗原免疫动物制备抗Rh抗体，分别以经100℃溶化后保温在42℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％琼脂糖配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效价梯度的应用抗体，并配入95％的血影细胞，按效价从低到高依次取55～65ml加入以高生物相容性材料制成的出入口特置了能阻挡特定微粒网筛的圆柱形容器内，使先加入的应用抗体冷却至半固体凝胶后才接着加下一次，制成使容器中的凝胶从进样端到出样端形成从高到低的抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度且血影细胞均匀分布的吸附器，当体外循环中分离的血浆滤出吸附器时，Rh抗体被固定在吸附剂中的血影细胞及抗Rh抗体结合成固定的复合物，被破坏的红细胞碎片及与之结合而成的大分子免疫复合物被近吸附器出口端浓度渐高而分子筛渐小的琼脂凝胶阻留，去除致病物质的血浆从吸附器滤出后回输体内。

Rh抗体是母胎Rh血型不合溶血病的致病因子，恒河猴红细胞含有人类红细胞共同的Rh抗原，是Rh抗体的免疫性抗原，而抗Rh抗体是Rh抗体的免疫性抗体，两者都能与Rh抗体发生免疫反应而形成复合物，本发明以恒河猴红细胞为原料，配制PB裂解液以透析制成去除有害于人体的血红蛋白但保留吸附Rh抗体的抗原性而且不吸附抗-A和抗-B的天然抗体的血影细胞，与以免疫学制备的抗Rh抗体共同以特定的组份固定于琼脂糖介质而制成吸附剂，能与滤过血浆中的Rh抗体发生结合而形成固定的免疫复合物从而被清除，而且琼脂凝胶所形成的滤孔随着琼脂糖浓度的增高而减少，近吸附器进口处的琼脂糖浓度低，滤孔就大，有利于血浆灌流及血影细胞和高滴度抗Rh抗体与Rh抗体的结合，而近出口处的浓度渐高，滤孔就渐小，易于阻留溶血病患者红细胞破坏所形成的碎片及与之结合而成的大分子免疫复合物，在吸附器出口处设置的能阻挡特定大小微粒的网筛也具有阻留红细胞破坏产物的作用，对致病物质形成了特异性免疫吸附和非特异性机械阻挡的双重屏障，特制琼脂糖介质冷却后凝成半固体，内部形成均匀多孔的网状结构，有利于游离抗原和抗体以及血浆成份的均匀扩散，避免了血浆液流的死腔，增加了血影细胞及抗Rh抗体吸附Rh抗体的均匀性和表面积，增强了吸附治疗的效果，吸附了Rh抗体后的血浆滤出吸附器后回输体内，实现了人工将Rh抗体从体内转移到体外的治疗，是一种仅去除致病抗体，不去除血浆及其多种有益成份的无需使用血浆置换液的廉价、安全、无副作用的母胎Rh血型不合溶血病的治疗新方法。

具体实施方式

图1是根据本发明提出的Rh血型不合溶血病治疗仪的应用示意图。

图2是根据本发明提出的血浆分离器的内部结构示意图。

图3是根据本发明提出的吸附器的内部结构示意图。

图1中，动脉血路管(1)的一端与动脉血管相连通，另一端经肝素泵(2)和血液泵(3)与血浆分离器(4)相连，血浆分离器(4)经血浆泵(6)和循环管路(7)与两个并联的吸附器(8)、吸附器(9)相连，然后依次与循环管路(10)、静脉管路(5)相连，静脉管路(5)的另一端与静脉血管相连。

图2中，1是血浆分离器，2是血浆分离器内腔，3是血浆分离器内腔管壁上的微孔，4是不能通过微孔(3)的血细胞，5是能通过微孔(3)的小分子血浆成份，6是血浆分离器外腔，7是血浆流出口，8是可开关的阀门。

图3中，1是进入吸附器后下移的Rh抗体，2是被固定在琼脂凝胶中的抗Rh抗体，3是被固定在琼脂凝胶中的抗Rh抗体结合了下移的Rh抗体后形成的固定结合物，4是被固定在琼脂凝胶中的Rh阳性恒河猴血影细胞，5是被固定在琼脂凝胶中的Rh阳性恒河猴血影细胞结合了下移的Rh抗体后形成的固定结合物，6是含有微孔的琼脂凝胶，7是被琼脂凝胶微孔阻留的Rh抗体。

下面结合图1、图2和图3，对本发明提出的Rh血型不合溶血病治疗仪的制备及应用的实施方案作详细的描述。

一、Rh(D)阳性恒河猴血影细胞的制备

1、原代红细胞：不被ABO血型系统的抗-A和抗-B血清凝集的Rh(D)阳性“O”型恒河猴红细胞。

2、主要试剂：30mmol/L PB缓冲液：甲液为0.04mol/L Na₂HPO₄(Na₂HPO₄.12H₂O14.328g溶解于1000ml去离子水中，室温储存备用)；乙液为0.04mol/L>2PO₄(NaH₂PO₄.2H₂O>

3、制备方法

(1)取足够量的新鲜Rh阳性O型恒河猴红细胞，分别在4℃和37℃的条件下，以1500r/min×5min的离心速度，以等体积的生理盐水清洗红细胞4～5次，以去除红细胞表面可能附着的ABO血型和Rh血型以及其他的免疫性抗体或天然抗体。

(2)以0.04mol/L Na₂HPO₄和0.04mol/L>2PO₄配制的渗透浓度为25和35mmol/L的PH7.4的PB裂解液，在4℃及2500r/min×10min的离心条件下，反复交替洗涤红细胞，通过渗透浓度的交替变化，促使血红蛋白透析出红细胞外而被去除。

(3)最后以生理盐水清洗直至上清液无色，以完全透析红细胞中对人体有害的血红蛋白，沉淀即为含D抗原的血影细胞。

(4)抗原性检测：①将血影细胞与抗-D标准品37℃孵育5min，离心取上清液检测抗-D标准品效价降低数值来确定血影细胞的抗原性。具体方法是：取试管10支，分别编号1～10，第1管加入血影细胞沉淀1.0ml，其他各管加生理盐水0.5ml，然后从第1管吸血影细胞沉淀0.5ml加入到第2管，混匀后吸0.5ml至第3管，以同样操作稀释至第10管，最后管吸出0.5ml弃去，每管加抗-D标准品0.5ml，37℃孵育5min，离心后轻轻混匀，以出现完全凝集、几乎无游离细胞的最大稀释倍数代表血影细胞的抗原性，稀释倍数越大，抗原性越强，吸附Rh抗体的能力越强。也可以用Rh(D)标准红细胞测定上清液抗体效价来确定血影细胞的抗原性；②用Rh(D)标准红细胞测定上清液抗体效价，抗-D标准品效价(已知)减去上清液抗体效价即为血影细胞的抗原性(效价)。上清液抗体效价检测方法为：取10支试管，分别编号1～10，各管加入生理盐水1ml，取上清液1ml加入到第1管混匀后移出1ml转至第2管，以同样操作稀释至第10管，最后管吸出1ml液体弃去，将稀释好的血清40μl与Rh(D)标准红细胞10μl混合，孵育10分钟，离心5分钟判读结果，最大稀释倍数的凝集管即为抗原性(效价)，效价应在1∶1500以上。

(5)血红蛋白含量检测：以低渗破坏血影细胞，以常规化学发光分析法或荧光分析法，定性和定量检测血影细胞中的血红蛋白含量，应低于正常人血浆的参考值低限。

(6)血影细胞形态：在显微镜下观察血影细胞的形态和完整性，应呈圈影、无反光。

(7)对于细胞形态呈圈影、无反光，高灵敏度常规血红蛋白定性检测为阴性，定量检测低于正常人血浆的参考值低限，吸附Rh抗体效价1∶1500以上的血影细胞，留取备用。

二、抗Rh抗体的制备

1、制备Rh阴性淋巴细胞

(1)原代细胞获取：购买浙江省血站新鲜浓缩Rh阴性白细胞300ml；另购买新鲜Rh阳性红细胞悬液300ml。(2)Rh阴性淋巴细胞分离制备(分离液避光4度保存，用前在37度水浴中加温，整个分离过程温度应控制在8-28度，温度过高或过低均影响分离质量)：无菌抽取20mL新鲜浓缩Rh阴性白细胞，PBS液稀释3～5倍，充分混匀后取6mL用滴管沿管壁缓慢叠加于已加入4mL淋巴细胞分离液的10mL离心管中水平离心机中水平离心(400r/min，20℃)35min；离心后管内分为3层，上层为血浆和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一条以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带为单个核细胞(PBMC)，用毛细吸管插到云雾层，吸取PBMC置入另一50mL离心管中，加入5倍以上体积PBS离心(300r/min，20℃)10min，弃上清，50mLPBS重悬细胞，离心(350r/min，20℃)15min，弃上清，加入Buffer (PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA pH7.2)2mL重悬细胞，主要为Rh阴性淋巴细胞(T细胞和B细胞)。

2、制备Rh阴性致敏淋巴细胞

将Rh阴性淋巴细胞和Rh阳性红细胞悬液以1000r/min离心5min，去上清，常规细胞培养液洗涤1～2次，将两种沉淀细胞等量混合，加5倍量的常规细胞培养液(RPMI-1640)，37℃，5％CO2培养24h，然后用RPMI-1640液洗涤离心(1000r/min，3min)，以去除细胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解红细胞，迅速离心(1000r/min，3min)，去除上清液内的裂解红细胞碎片，PBS洗涤离心3次，RPMI-1640洗涤离心1次，以清除混悬液中残存的Tris-NH4Cl，避免其影响细胞的存活，此时，混悬液中主要含有Rh阴性致敏淋巴细胞。

3、制备Rh阴性致敏B细胞株(EB病毒转化Rh阴性致敏淋巴细胞)

按常规EB病毒转化淋巴细胞技术，取Rh阴性致敏淋巴细胞，调节浓度为2x 10⁶后加入适量的EB病毒(EBV)原液，置于37℃，5％CO2培养过夜，制备待杂交的EB病毒转化的致敏淋巴细胞。(1)试剂：RPM1640培养基：内含20％胎牛血清(Gibco){56℃灭活30分钟}、1.6～1.8％HEPES、1.2％谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素；环胞酶素A(CyA)：5ml(250mg)/瓶，用1640培养基稀释成0.2mg/ml，使用时终浓度为2ug/ml(0.5％)；EB病毒(EBV)液：购自中国科学院遗传所，储存于零下80度，使用时从冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的滤膜过滤，不要超过0.5～1小时。(2)方法：取Rh阴性致敏淋巴细胞，加6ml1640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟；弃上清液，加入2ml>5/ml)。冻存管分装，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中)]。

4、筛选Rh阴性效应B细胞株(筛选产Rh抗体的EB病毒转化Rh阴性致敏淋巴细胞)

效应B细胞株是指能产生Rh抗体的B细胞株，以抗人球蛋白试验或常规ELISA法筛选产Rh抗体淋巴细胞：(1)直接抗人球蛋白试验：检测B淋巴细胞株(B细胞株)表面是否表达Rh抗体。购买抗人球蛋白血清和抗-D血清，以生理盐水洗涤1次并配成5％淋巴细胞株悬液，取1滴细胞悬液与2滴抗人球蛋白血清混匀，置室温5min后低速离心，轻轻混和，肉眼或镜下观察，发现淋巴细胞株凝集者为细胞表面表达有Rh抗体(同时配制未致敏的5％淋巴细胞悬液加抗人球蛋白血清做阴性对照；以Rh(D)阳性红细胞加抗-D血清做阳性对照)。(2)间接抗人球蛋白试验：检测淋巴细胞株培养上清液是否含有Rh抗体。以生理盐水洗涤2次并配成5％Rh(D)阳性O型红细胞悬液，各取红细胞悬液、淋巴细胞株培养上清液及抗人球蛋白血清1滴混匀，置室温5min后低速离心，轻轻混和，肉眼或镜下观察，发现红细胞凝集者为淋巴细胞株培养上清液含有Rh抗体(同时以红细胞悬液与抗人球蛋白血清混合管为阴性对照、以红细胞悬液与抗-D血清混合管为阳性对照)。以此直接或间接抗人球蛋白试验筛选出能分泌较高效价(较高倍数稀释后仍试验阳性)Rh抗体的B细胞株(孔)，继续传2～3代。

5、制备Rh阴性效应杂交瘤细胞(制备Rh阴性效应B细胞株杂交瘤细胞)

(1)培养基及主要试剂：DMEM培养基、HAT、HT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂。(2)骨髓瘤细胞准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3～4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。加入适量基础培养基到离心管中，轻轻敲打混匀后1000r/min离心5-10min，重复洗涤细胞2次。(3)待杂交Rh阴性效应B细胞株准备：以基础培养基调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸用于细胞融合，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。(4)细胞融合：将Rh阴性效应B细胞株与骨髓瘤细胞以5～10∶1的比例加入离心管中，混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，重复2次。在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL的50％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL的基础培养基在3～5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，1000r/min离心5min，弃去上清，加入50mL>

6、制备Rh抗体

(1)从Rh阴性效应杂交瘤细胞培养上清液中以常规方法分离、纯化Rh抗体。(2)Rh抗体单抗小鼠腹水的制备：低速离心收集培养后的Rh阴性效应杂交瘤细胞，经过基础培养基稀释细胞数为1×10⁷/mL，小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显臌起，用针头穿刺腹腔，离心管收集腹水，采集完毕，对小鼠腹腔注射适量基础培养基，间隔2～3天，同样方法再取腹水，收集到的腹水，10000r/min离心5min，吸取上清液，分装，-20℃保存。上清液中含有大量的Rh抗体，按常规方法分离、纯化Rh抗体、以抗人球蛋白试验或ELISA法测定抗体的效价。

7、制备抗Rh抗体

(1)实验动物：免疫用实验动物选用的是浙江大学动物学院杂交白山羊，体重30斤左右的健康青壮年母羊二只，免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记，采用随群圈养的饲养方式，每天保证羊只得到适量的运动，运动时间在傍晚，每次运动大概半小时左右，这样利于身体健壮，避免羊只过肥，增加机体的免疫力，饮水充足，并给予适量的精料、青草、玉米、麸皮、小麦、维生素等等，使其营养均衡。经常查看实验羊只健康状况。(2)免疫源：本发明制备的Rh抗体(Rh抗体即抗-D血清，有市售产品)接种前混合0.1mL抗原、1.9mL无菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐剂制成免疫原乳剂备用。(3)山羊的免疫：选取两只山羊，标记为山羊A、山羊B，接种抗原。免疫部位为前后腹股沟，每处腹股沟分2个点注射，总共有8个注射点，注射方式为皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每个注射点注射免疫原0.5mL，约含32μg抗原。免疫前两只山羊分别抽血10mL，标记为0dP1，-20℃保存；免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP1，以ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存，3～4周开始第二次免疫，免疫原为0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP2，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存。第三次免疫时间为6～8周后，免疫原为0.1mL抗原+1.9mL无菌PBS+2mL弗氏不完全佐剂(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分离血清，标记为7dP3，ELISA检测血清效价，剩余血清-20℃保存，如果此时血清效价没达到1∶10⁶以上，则需要再免疫一次；如果血清效价已达10⁶以上则不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分离血清，-20℃保存备用。(4)抗Rh抗体血清制备：一般每次免疫后7～10天即可于羊颈静脉采血检测，由助手协助保定动物，使其保持站立姿势，颈部剪毛、无菌棉球擦拭消毒后，寻找到颈静脉手持注射器采血，将注射器位置固定取血5～10mL。分离出血清后进行效价检测。在第三次免疫后7～10天，经效价检测合格后一次可取血30-50mL，在无菌条件下分离血清，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境(例如超净工作台)中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出(不能冰冻，否则产生溶血)，经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存，使用前须经过签定合格后再分装保存备用。(5)抗血清效价的测定：抗血清效价采用ELISA测定方法，包被时是将样品用包被液稀释到1∶1000的浓度后，在酶标板上每孔加100μL，然后放在铝盒中放入4℃冰箱里过夜，第二天早上拿出来拍干包被液，用PBST洗涤三次，每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入10％血清的封闭液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h，然后再拿出来拍干封闭液，用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀释，用4％牛血清的PBST稀释，放入37℃，水浴1～2h)，然后再拿出来拍干一抗液，PBST洗涤酶标板三次，每次间隔5分钟，最后一次用纱布拍干酶标板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h，再拿出来拍干二抗液用PBST洗涤酶标板3每次间隔五分钟，最后一次用纱布拍干，每孔加50μL底物显色液，闭光显色10～20分钟后加入2M的H2SO4溶液50μL终止反应，后用酶标仪测OD值(半小时内)。或以最大稀释倍数的抗人球蛋白试验结果阳性者作为抗体的效价。

本发明制备的Rh抗体即Ig抗-D，抗Rh抗体即抗Ig抗-D，按本发明的技术方案同样能制备Ig抗-A、Ig抗-B、Ig抗-E、Ig抗-C及抗Ig抗-A、抗Ig抗-B、抗Ig抗-E、抗Ig抗-C，并进一步制备免疫吸附治疗器。本发明在制备Rh抗体后，在进行抗Rh抗体的制备时，除了通过免疫山羊制备外，还可以通过免疫小鼠，然后取小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞溶合，然后按常规杂交瘤技术制备抗Rh抗体。

三、吸附剂的制备

1、含有抗Rh抗体的吸附剂的制备

取所制备的起吸附Rh抗体作用的抗Rh抗体，检测抗体效价，分别以经100℃溶化后保温在37～42℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％琼脂糖C1-4B生理盐水配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效价梯度的应用抗体，保温在37～42℃备用。

2、同时含有抗Rh抗体和Rh阳性血影细胞的吸附剂的制备

将所制备的起吸附Rh抗体作用的恒河猴血影细胞，分别以抗Rh抗体效价为1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100的吸附剂配制成95％Rh阳性血影细胞浓度的同时含有抗Rh抗体和Rh阳性血影细胞的吸附剂，保温在37～42℃备用。

四、吸附器的制备

1、材料

为与人类血管内皮接近的丙烯酸酯之类高分子材料，要求生物相容性好，无补体激活和炎症反应，能无白细胞、血小板、血氧分压、补体C3aC5a的改变，通过共价、接枝、聚合等方法改进材料表面的均匀性、亲水性，减少对凝血及氧化应激的影响。在吸附器内表面加亲水凝胶，通过控制湿纺过程而生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，可以提高生物相容性。将某些抗凝物质固化在载体或吸附器内表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至实现无肝素化，如将肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亚胺膜上，可减少过敏体质的过敏反应；将肝素共价结合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力学性能和提高吸附器内表面的抗凝血性能。在醋酸纤维膜上共价固化亚油酸膜，或将共价结合到聚丙烯酸的亚油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的组织相容性和抗凝血效果。

2、规格

制成50mm×60mm的底径小、顶径大的圆柱形容器，或制成方形、漏斗形，容积约200～300ml，上下部出入口均设有细胞筛网，顶径筛网目数为500目，底径筛网目数为50目，液体出口处设置目数为200目的细胞滤网，构成了防止细胞碎片进入循环的第二道防线，液体进出口与网筛之间设有缓冲区，有利于系统循环的稳定性。

3、方法

按抗体效价从低到高依次取55～65ml同时含有抗Rh抗体和Rh阳性血影细胞的吸附剂加入圆柱形容器内，使先加入的吸附剂冷却至半固体凝胶后才接着加下一次，制成使容器中的凝胶从进样端到出样端形成从高到低的抗体效价而从低到高的琼脂糖浓度且血影细胞均匀分布的吸附器，当体外循环中分离的血浆滤出吸附器时，Rh抗体被固定在吸附剂中的血影细胞及抗Rh抗体结合成固定的复合物，被破坏的红细胞碎片及与之结合而成的大分子免疫复合物被近吸附器出口端浓度渐高而分子筛渐小的特制琼脂凝胶及吸附器出口的筛网所阻留，去除致病物质的血浆从吸附器滤出后回输体内，从而达到避免孕妇Rh抗体进入胎儿血液和减轻病情的治疗目的。

五、血液分离器的制备

1、制备原理：根据人体血液中有形成份(细胞)的大小：正常红细胞大约为7微米(μm)，是双凹圆盘状的细胞；白细胞分为5种，中性粒细胞约12μm，嗜酸性粒细胞略大些，嗜碱性粒细胞与中性粒细胞接近，小淋巴细胞6-8μm，与红细胞近似，单核细胞最大，约15-20μm。血小板为圆盘形，直径1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直径为2-4微米，厚0.5～1.5微米。

2、血液分离器的材料与要求：同本发明的吸附器，选用聚醋无纺布、醋酸纤维、脱脂棉等，要求生物相容性好，通透性高，几乎不激活补体、不引起炎症反应和白细胞、血小板、血氧分压、C3a、C5a的改变。

3、血液分离器的型号与规格：本发明所涉及的血浆分离器可以从商家购买，或委托商家制备。血浆分离器用高分子聚合物制成的空心纤维型滤器，该孔可准许血浆滤过，但能阻挡所有的细胞成分。空心纤维膜直径为270～370μm，膜厚度为50μm，孔径为0.2～0.6μm，纤维长度为13.5～26μm。

六、Rh血型不合溶血病治疗仪的构件

1、关键构件

(1)血液分离器：用于分离血细胞和血浆。

(2)血浆吸附器：内含抗Rh抗体、恒河猴血影细胞和琼脂凝胶介质，用于清除Rh抗体、RBC碎片、Rh抗体与RBC碎片形成的复合物等。

2、附加构件：包括血泵、肝素泵、动静脉压和空气监测、温度控制系统、除气系统、电导率监测系统、超滤监测和漏血监测等部分组成。

(1)血泵(Blood Pump)：用来推动血液循环以维持血液吸附治疗的顺利进行，通常血泵部分往往具有转速检测功能，以监测病人的血流情况，因此血泵转轮与凹槽间距设定要精确，并需要经常调整，根据血路泵管的情况，一般将间距设定为3.2～3.3mm，不可太松，否则会造成血流检测不准；也不可太紧，否则会造成管路破裂。

(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相当于临床上应用的微量注射泵，用以持续向筛滤管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在体外循环与空气接触，容易发生凝血现象，使用肝素泵可以防止凝血的发生。

(3)动静脉压监测：动脉压监测主要用以动态监测血液分离器微孔的堵塞情况，另外用以监测体外循环血栓、凝固和压力的变化。当血流不足时，动脉压就会降低；当有凝血、血栓形成，特别是分离器微孔堵塞时，动脉压就会升高；静脉压监测用来监测管路血液回流的压力，当分离器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及静脉血回流针头脱落时，静脉压就会下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流针头发生堵塞时，静脉压就会升高。

(4)空气监测(Air Detector)：用来监测血液流路的空气气泡，一般用超声波探测的原理，为了避免病人发生空气栓塞而设置。当监测到有空气气泡时，检测系统会驱动动、静脉血路夹来阻断血流，防止危险的发生。

总之，在本发明关键构件和附加构件的基础上，引入计算机调控而制成操作的人性化、治疗的个性化、设计的安全性，以及模块化、自动监测及调控、液晶显示、自行判断警报原因及解除信号等微电脑处理的治疗仪。

七、Rh血型不合溶血病治疗仪的操作方法

1、安装：以无菌操作连接各部件，包括血浆分离器、吸附器及各循环管路等各部。

2、排气：以无菌生理盐水充液分离器、吸附器及各循环管路，排除分离器、吸附器及其循环管道内的气体、气泡，仔细检查，确认无气体、气泡后使用。

3、通液：将动脉血路管1接通动脉血管，在操作中再次仔细检查排气是否完全，液流是否通畅，并避免管内流液污染。

4、抗凝：从肝素泵向液流中注射抗凝剂(肝素)，初次为2500∪或20～30∪/kg。

5、启动：将动脉血路管(1)接通治疗者的动脉血管，将静脉管路(5)接通治疗者的静脉血管，然后打开血液泵，血流量为100～150ml/min，图1中，当动脉血液经动脉血路管(1)进入血浆分离器(4)，分离出来的血浆在血浆泵(6)的作用下经循环管路(7)到达吸附器(8)，待充满血浆、约10分钟，开始放出血浆，经循环管路(10)流出，同步向吸附器(9)灌注血浆，在吸附器(8)内的血浆将近流完时，再次开始灌注血浆，此时吸附器(9)开始放出血浆，两个并联的吸附器(8)、吸附器(9)交替进行。图2中，当待分离的血液进入血浆分离器(1)的内腔(2)时，经阀门(8)的作用，能通过微孔(3)的小分子血浆及其成份(5)进入分离器的外腔(6)，然后经血浆出口(7)流出，而不能通过微孔(3)的血细胞(4)经阀门(8)流出。图3中，当Rh抗体(1)进入吸附器时，分别被固定在琼脂凝胶中的抗Rh抗体(2)结合成固定的结合物(3)、被固定在琼脂凝胶中的恒河猴血影细(4)结合成固定的结合物(5)，被破坏的红细胞碎片及与之结合而成的大分子抗原抗体复合物不能通过凝胶微孔和吸附器外壳出口处的网筛而被阻留，净化后的血浆与血浆分离器分离的血细胞汇合后回输。如此直至事先设定的血浆循环量(通常为9L)，治疗才宣告结束，如果整个治疗过程均由电脑控制，并可随时检测工作状态，使用会更加方便、自动化和安全。

八、治疗仪功效的验证

1、血影细胞吸附Rh抗体功效的验证

为了解治疗仪的功效，本发明设计了简易的测试方法测试恒河猴血影细胞吸附Rh抗体的功效。取所制备的恒河猴血影细胞，加入到经100℃溶化后保温在37～42℃备用的1.0％琼脂糖C1-4B中，配制成95％血影细胞浓度的吸附剂；取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，吸取95％血影细胞浓度的吸附剂至200mm刻度，吸附剂冷却后成为半固体；购买中心血站新鲜冰冻血浆200mL，另购买Rh抗体(人抗D型血清干粉标准品，广州联泰生物技术有限公司)，以新鲜血浆配成1∶200、1∶300、1∶600抗体滴度，按常规Rh(抗D)滴度检测方法(参考说明书)，进一步检测确认上述所配制的抗体滴度是否相符，称为滤前(Rh)抗体(滴度)，然后各取10ml滤前抗体分别注入3支血沉管的上端空管，待流经血沉管下层的含有血影细胞的吸附剂后，收集流出液，称为滤后(Rh)抗体，按常规Rh(抗D)滴度检测方法确认滴度，再分别将滤后抗体经含有血影细胞的吸附剂中作第2次滤出，如此重复3次滤过及抗体滴度检测，结果(表1)说明，Rh抗体滤过简易吸附器后，大部分Rh抗体已被相应的含有血影细胞的吸附剂吸附，经第1次、第2次、第3次滤过后，Rh抗体的平均滴度分别从滤前的1∶367降为滤后的1∶183、1∶58、1∶29，说明随着滤过次数的增加，Rh抗体会不断地被血影细胞吸附清除，从而达到降低孕妇(新生儿)血浆Rh抗体滴度而治疗母胎血型不合溶血病的目的。

表1 Rh抗体滤过含有血影细胞的吸附剂前后滴度检测结果(1/x)

2、抗Rh抗体吸附Rh抗体功效的验证

为了解治疗仪的功效，本发明设计了简易的测试方法测试抗Rh抗体吸附Rh抗体的功效。取所制备的抗Rh抗体，加入到经100℃溶化后保温在37～42℃备用的1.0％琼脂糖C1-4B中，混合后滴度为1∶300～500；取灭菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，分别吸取1.0％琼脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷却后琼脂糖成为半固体；购买中心血站新鲜冰冻血浆200mL，另购买Rh抗体(人抗D型血清干粉标准品，广州联泰生物技术有限公司)，以新鲜冰冻血浆配成1∶128、1∶256、1∶512抗体滴度，按常规Rh(抗D)滴度检测方法(参考说明书)，检测确认抗体滴度，称为滤前(Rh)抗体，然后各取10ml滤前抗体分别注入3支血沉管的上端空管，待流经血沉管下层的含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖C1-4B并从血沉管内流出后，收集流出液，称为滤后(Rh)抗体，按常规Rh(抗D)滴度检测方法确认滴度，再分别将滤后抗体经含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖血沉管滤出，如此重复3次滤过及抗体滴度检测，结果(表1)说明，Rh抗体滤过简易吸附剂后，部分Rh抗体已被相应的抗Rh抗体吸附，经第1次、第2次、第3次滤过后，Rh抗体的平均滴度分别从滤前的1∶298降为滤后的1∶149、1∶48、1∶17，说明随着滤过次数的增加，Rh抗体会不断地被清除，从而达到降低Rh抗体滴度而治疗母胎血型不合溶血病的目的。

表1 Rh抗体滤过含有抗Rh抗体的1.0％琼脂糖简易吸附剂前后滴度检测结果(1/x)

总之，上述简易的验证实验表明，血浆中游离的Rh抗体，能被本发明的吸附剂(恒河猴血影细胞和抗Rh抗体)吸附清除，证明以血液分离器和吸附器为关键部件构成的Rh血型不合溶血病治疗仪具有显著的治疗功效。