二氢白藜芦醇用于治疗急性胰腺炎和相关肺损伤的方法

摘要

本发明涉及使用反式3,5,4’‑三羟基联苄(也被称为二氢白藜芦醇)治疗有需要的受试者急性胰腺炎的方法。更具体而言，本发明涉及使用二氢白藜芦醇和/或化学变体用作治疗剂的方法。本发明特别涉及改善组织损伤以达致治疗受试者急性胰腺炎相关的肺损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及使用二氢白藜芦醇治疗有需要的受试者急性胰腺炎的方法。更具体地，本发明涉及将芪类化合物家族的多酚衍生物、即反式3,5,4’-三羟基联苄、也被称为二氢白藜芦醇用作治疗剂的方法。本发明特别涉及改善组织损伤以达致治疗受试者急性胰腺炎相关的肺损伤。

背景技术

急性胰腺炎是由于胰腺外分泌部内发生蛋白水解酶原过早激活导致突然发病而产生的炎症。异常激活的酶原逃逸到胰脏的间质内并导致腺体自身消化，如Grady T,Mah’Moud M,Otani T,Rhee S,Lerch MM,Gorelick FS所报道。胰腺腺泡细胞内的酶原蛋白水解与细胞损伤有关。Am J Physiol.1998；275:G1010-7。多数急性胰腺炎病例是由于过量饮酒和胆结石引起的。在一些情况下遗传可能是一个因素，如Whitcomb DC,Gorry MC,PrestonRA,Furey W,Sossenheimer MJ,Ulrich CD等人所报道。遗传性胰腺炎是由阳离子胰蛋白酶基因突变而引起的。Nat Genet.1996；14:141-5；然而，该诱因有时是自发性的。虽然急性胰腺炎是起源于胰腺的炎症过程，但是它通常会导致影响远端器官的多器官功能障碍综合征。严重形式的急性胰腺炎伴随15-20％的高死亡率，此后在临床处理中仍然是复杂的问题，如Charbonney,E.,Nathens,A.B.2008.Severe acute pancreatitis:a review.SurgInfect(Larchmt)9,573-578所报道。肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的进展是最常见的并发症并且是急性胰腺炎全身性并发症的潜在严重病例。急性肺损伤的确是重症急性胰腺炎患者死亡的主要病因，如McFadden,D.W.1991所报道。胰腺炎中器官衰竭和多器官系统衰竭。Pancreas 6Suppl 1,S37-43。不幸的是，依然没有有效的治疗方法，重症急性胰腺炎的死亡率仍然相对较高。

本发明的一个目的是提供了使用二氢白藜芦醇治疗受试者中急性胰腺炎的方法。

本申请的此部分或任何其他部分中的任何参考文献的引用或标识不应当被解释为承认这样的参考文献可用作本申请的现有技术。

发明内容

因此，本发明的目的涉及使用有效量的二氢白藜芦醇或其芪类衍生物和/或化学变体作为治疗剂用于治疗和/或减轻有需要的受试者的炎性病症例如急性胰腺炎和相关的全身性并发症包括肺损伤的方法。二氢白藜芦醇有效降低了胰腺和肺中的高淀粉酶血症、腺泡萎缩、肺泡壁增厚和间质水肿的形成。此外，二氢白藜芦醇抑制了促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生成和髓过氧化物酶(MPO)活性，同时恢复了胰腺的谷胱甘肽水平。重要的是，在动物实验中口服施用二氢白藜芦醇显示没有不利的影响。

在本发明的第一个方面的第一个实施方案中，提供了通过向有需要的受试者施用包含有效量的芪类衍生物治疗胰腺急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，所述芪类衍生物包含结构式(1)的化合物，

其中R₁、R₂和R₃各自独立地选自烷基。术语“烷基”，可为单独或与其他基团组合，包括涉及具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链烷基。通过例如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基、己基等及其衍生物或化学变体；或所述化合物的混合物、其衍生物和/或化学变体进一步举例说明该术语。

在本发明的第一个方面的第二个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述芪类衍生物是反式3,5,4’-三羟基联苄或二氢白藜芦醇，其是结构式(2)的化合物：

及其衍生物或化学变体；或所述化合物的混合物、其衍生物和/或化学变体。

在本发明的第一个方面的第三个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述受试者是人或动物。

在本发明的第一个方面的第四个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物是口服施用的。

在本发明的第一个方面的第五个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述胰腺的急性炎性病症包括所有形式的急性胰腺炎和相关的全身性并发症，包括肺损伤。

在本发明的第一个方面的第六个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物以不低于20mg/kg给所述受试者施用，每日不少于3次。

在本发明的第一个方面的第七个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物以不低于3.24mg/kg给所述受试者施用，每日不少于3次。

在本发明中的第二个方面的第一个实施方案中，提供了用于制备分子式C₁₄H₁₄O₃和式(2)的化合物的方法，

其是通过反式白藜芦醇的氢化得到化学名称为反式3,5,4’-三羟基联苄的芪类衍生物。

在本发明的第二个方面的第二个实施方案中，提供了制备分子式C₁₄H₁₄O₃的和式(2)的化合物的方法，其中反式白藜芦醇的氢化包括以下步骤：

在室温下在5个大气压氢气压力下在10％的Pd/C存在下搅拌反式白藜芦醇在无水乙醇(EtOH)中的溶液8小时；

从搅拌的溶液中滤出催化剂；

在真空下蒸发滤液以产生残余物；

使用硅胶色谱利用石油醚和乙酸乙酯(1:1)洗脱残余物以产生二氢白藜芦醇。

本领域技术人员将理解的是，本文所述的本发明易于进行除了具体描述的那些之外的变化和修改。

本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括说明书中所涉及或指出的所有步骤和特征，单独或一起，以及任何和所有的组合或步骤或任何两个或更多个步骤的或特征。

在本说明书中，除非上下文另有要求，否则单词“包括(comprise)”或变型例如“包含(comprises)”或“含有(comprising)”将被理解为包括所述整数或一组整数，但不排除任何其他整数或整数组。也指出，在本公开内容中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包括(comprises)”、“包含(comprised)”、“含有(comprising)”等可具有美国专利法中赋予的含义；例如，它们可意指“包括(includes)”、“包含(included)”、“含有(including)”等；并且该术语例如“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“基本上由......组成(consisting essentially of)”具有本领域常规赋予的含义，例如，它们允许未明确列举的元素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本或新颖特性的元素。

此外，在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单词“包括(include)”或变型例如“包含(includes)”或“含有(including)”将被理解为包括所述整数或或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

本文所用的所选术语的其他定义可在本发明的详细描述中发现并全文应用。除非另有定义，否则本文使用的所有其他技术术语与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的含义相同。

通过随后的描述总结，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图说明

通过本发明的以下描述并结合附图，本发明的上述和其他目的和特征将变得显而易见，其中：

图1示出了大鼠胰腺的含水量增加是由蛙皮素诱导的急性胰腺炎以导致胰腺水肿造成的结果。所得重量以胰腺重量对身体重量的百分比率来表达。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图2A至2F示出了通过苏木素和伊红(H&E)染色，对照组(图2A)、蛙皮素组(图2B)和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)(图2C至2F)的胰腺组织结构和形态的改变。图像用50μm的比例尺表示。

图3A至3E示出了通过H&E染色，对照组(图3A)、蛙皮素组(图3B)和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)(图3C至3E)的肺组织结构和形态的改变。图像用200×的放大倍数表示。

图4A示出了通过比色分光光度法测定MPO活性，其代表了对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中的中性粒细胞隐蔽(sequestration)。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图4B示出了通过比色分光光度法测定的MPO活性，其代表了对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)肺组织中的中性粒细胞隐蔽。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图5A示出了通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中的TNF-α水平。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图5B示出了通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)肺组织中TNF-α水平。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图6A示出了通过比色分光光度法测定，对照组、蛙皮素组和二氢白藜芦醇治疗组(D-Res)胰腺组织中的谷胱甘肽水平。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与对照组相比*p<0.05，而与蛙皮素组相比#p<0.05。

图6B示出了二氢白藜芦醇(D-Res)和反式白藜芦醇降低大鼠在蛙皮素诱导的急性胰腺炎中胰腺的含水量以达致改善胰腺水肿的作用。所得重量以胰腺重量对身体重量的百分比率来表达。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。与盐水处理的对照组(Con)相比*p<0.05，而与蛙皮素处理的对照组相比#p<0.05。

图7示出了通过MTT细胞增殖测定经二氢白藜芦醇和反式白藜芦醇处理的胰腺细胞中的代谢率。与未经二氢白藜芦醇或反式白藜芦醇处理的细胞相比*P<0.05。

具体实施方式

本发明不限于本文所述的任何具体实施方式的范围。下面的实施方式仅以举例说明的方式给出。

在所建立的几种动物模型中，重复腹膜内(i.p.)注射胆囊收缩素促分泌素是最广泛使用、且是具高度复制性的方法以用于创建实验性急性胰腺炎。加上单次注射脂多糖(LPS)后，经常观察到急性胰腺炎相关并发症的肺损伤，其特征为肺组织中性粒细胞的隐蔽和肺泡膜屏障通透性的增加。急性胰腺炎发病时，大量的消化酶即α-淀粉酶渗漏入血液，所以α-淀粉酶的渗漏是诊断急性胰腺炎主要的病理学参数。为了评估急性胰腺炎和相关肺损伤的严重程度，将器官结构的形态学改变包括间质水肿、细胞损伤、白细胞浸润和出血作为特征组织学和/或病理学参数。除了组织学检查之外，通常测量异常的MPO活性以评估中性粒细胞介导的炎性病症的严重程度。受影响的组织中高水平的促炎性细胞因子进一步证实局部和全身炎症反应。此外，防御机制谷胱甘肽的耗竭是评估组织损伤程度最常用的参数之一。

通过本发明的方法治疗的受试者可以是人或动物。本发明可适用于各种形式的急性胰腺炎，尤其是急性胰腺炎相关的全身性并发症包括肺损伤。

二氢白藜芦醇，也称为反式3,5,4’-三羟基联苄，是多酚衍生物，属于芪类化合物家族，通常是从植物提取物中得到。事实上，二氢白藜芦醇是一种植物抗毒素用于抵抗生物性和非生物性的胁迫，多种植物物种包括兰科(Orchidaceae)和大麻(Cannabis sativa L)都能生产这抗毒素、特别是在真菌感染的情况下，如Fritzemeier,K.H.,Kindl,H.1983所报道。9,10-二氢菲是兰科植物的植物抗毒素。体外和体内的生物合成研究证明了是从L-苯丙氨酸到二氢间香豆酸、二氢异喹啉和二氢菲的路线。Eur J Biochem 133,545-550。

本发明涉及具有结构式1的芪类化合物家族的多酚衍生物在改善胰腺和肺组织损伤中的用途：

其中R₁、R₂和R₃各自独立地选自烷基。术语“烷基”，可为单独或与其他基团组合，包括涉及具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链烷基。通过例如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基、己基等这样的基团进一步示例性的说明该术语，以减轻胰腺和肺的组织损伤。

本发明进一步涉及包含反式3,5,4’-三羟基联苄也称为二氢白藜芦醇的芪类化合物在改善胰腺和肺组织损伤中的用途，参见化合物2：

在本发明中，该具体的芪类衍生物是通过反式白藜芦醇氢化得到的，为白色粉末。

此外，本发明涉及用于制备上述化合物、含有这类化合物的药物制剂的方法以及该化合物在制备药物制剂中的用途。

口服施用不少于20mg/kg的适当剂量的二氢白藜芦醇显著改善了蛙皮素-处理的大鼠中急性胰腺炎和相关肺损伤的严重程度。就病理学参数而言，急性胰腺炎大鼠的胰腺水肿减轻因而胰腺含水量减少(图1)、血浆内α-淀粉酶水平降低(表1)、腺泡形态变得完整(图2C至2F)和肺泡壁增厚和出血的情况减少(图3C至3E)。

表1：血浆α-淀粉酶活性表示为U/μl/min。小于0.05的p值被认为是统计学显著性的，S.D表示标准偏差。与对照组相比*P<0.05，而与蛙皮素组相比#P<0.05。

通过施用二氢白藜芦醇，蛙皮素诱导的中性粒细胞隐蔽水平的升高、其被量化为MPO活性、在胰腺和肺组织中被显著抑制(图4A和4B)。通过施用二氢白藜芦醇，胰腺和肺中蛙皮素诱导的TNF-α水平的升高也显著地被抑制(图5A和5B)。

谷胱甘肽耗竭是组织损伤的标志性信号。蛙皮素诱导的胰腺谷胱甘肽水平的下降通过施用二氢白藜芦醇而显著地被恢复(图6A)。

在本发明中，二氢白藜芦醇完全并容易地溶解在0.5％(重量/体积，w/t)甲醇中，而反式白藜芦醇，在剧烈振摇下溶解在2.5％(w/t)甲醇中(表2)。因此，二氢白藜芦醇的溶解度比反式白藜芦醇至少高5倍。就减少蛙皮素诱导的大鼠急性胰腺炎胰腺水肿的结果中胰腺含水量而言，二氢白藜芦醇的改善效果比反式白藜芦醇更佳(图6B)。

表2：二氢白藜芦醇和反式白藜芦醇在甲醇中的溶解度

反式白藜芦醇二氢白藜芦醇所需甲醇(w/v)2.5％0.5％

通过MTT法评估线粒体代谢率，二氢白藜芦醇在胰腺腺泡细胞中的细胞毒性被测定为约500μM，而反式白藜芦醇的为约250μM(图7)。因此，二氢白藜芦醇的细胞毒性比反式白藜芦醇低50％。

实验

二氢白藜芦醇的制备和结构鉴定。二氢白藜芦醇的分子式被确定为C₁₄H₁₄O₃，其是通过反式白藜芦醇的氢化得到的，为白色粉末。在室温下5个大气压氢气压力下在10％Pd/C(0.2g)的存在下搅拌在无水乙醇(150ml)中的反式白藜芦醇(10g，43.8mmol)的溶液。8小时(h)后终止反应，过滤除去催化剂。将滤液真空蒸发，并将残余物进行硅胶色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯洗脱(1:1)得到二氢白藜芦醇，为白色无定形粉末(9.6g，产率95％)：HR-ESIMS([M+1]+m/z>14H₁₅O₃)；¹H>13C>

生物学活性评价。将体重范围70～90g的28天龄Sprague-Dawley大鼠随机分成6组，每组6至8只。在23±2℃的环境温度下、相对湿度60-80％和12小时光照/黑暗循环中饲养大鼠。实验之前，将大鼠禁食过夜，但允许自由饮水。通过6个小时内每小时向大鼠腹腔内注射最大刺激剂量(50μg/kg)的蛙皮素，然后在最后1次蛙皮素注射之后1小时注射单剂量7.5mg/kg的LPS创建实验性急性胰腺炎，并将该组大鼠命名为蛙皮素组。对照组以相同的体积在相同的时间腹腔注射0.9％盐水代替蛙皮素。给予蛙皮素和口服剂量的二氢白藜芦醇的(10、20或50mg/kg)的治疗组被命名为蛙皮素+D-res 10或20或50mg/kg。第一次蛙皮素注射之后进行30分钟的治疗干预，连续三个小时。处死后，立即取出胰腺，称重，减掉脂肪并在4℃的4％多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水中固定过夜。然后处理样品，包埋在石蜡中，切片并进行H&E染色。使用商售的ELISA试剂盒测量胰腺和肺样品中的TNF-α水平。将组织匀浆进行生化分析，用于MPO活性和谷胱甘肽含量的评估。

以轻度剪切力及胶原酶消化后，从胰腺组织分离出功能完好的腺泡。在37℃的5％CO₂、95％空气湿润的气氛下在补充了5％胎牛血清(GIBCO)、1％青霉素-链霉素(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中培养腺泡。将LTC-14细胞以1×10⁴个/孔的密度接种在96孔板上，并与不同浓度的二氢白藜芦醇或反式白藜芦醇(溶解在DMSO中)一起孵育24小时。在24小时的处理期结束时将MTT试剂加入到细胞中。3小时的反应时间后，将MTT产物溶解在DMSO中并测定570nm处的吸光度。

结果

蛙皮素诱导后，由于胰腺水肿的发生，与未用蛙皮素诱导的对照相比较，急性胰腺炎大鼠的胰腺重量相对身体重量的比率急剧增加了约60％。口服施用不低于20mg/kg的适当剂量二氢白藜芦醇后，胰腺水肿显著降低了，这从显著降低的胰腺重量相对身体重量比率中反映出来。与公认的抗氧化剂反式白藜芦醇相比，二氢白藜芦醇对降低胰腺水肿有更佳的改善效果。关于人用剂量，基于Reagan-Shaw S,Nihal M,Ahmad N(2008)Dosetranslation from animal to human studies revisited.FASEB J 22(3):659-661的标准剂量转换，剂量为3.24mg/kg。

当口服施用二氢白藜芦醇时，蛙皮素诱导的急性胰腺炎大鼠的小叶间隔局部肿胀、细胞质收缩和胰腺炎实质中白细胞浸润均明显减少，同时肺组织中肺动脉壁增厚和出血得到显著改善。

就胰腺和肺的炎性病症的减轻而言，通过口服施用二氢白藜芦醇，胰腺和肺组织中的促炎细胞因子TNF-α水平以及MPO活性被显著降低。

相比于非蛙皮素处理的对照组，蛙皮素诱导的胰腺组织中的谷胱甘肽水平显著减少50％以上。口服施用二氢白藜芦醇对抑制蛙皮素诱导的胰腺中谷胱甘肽的耗竭显著减少。

二氢白藜芦醇在甲醇性溶剂中的溶解度是反式白藜芦醇的5倍以上。通过评估腺泡的线粒体代谢率，二氢白藜芦醇的细胞毒性显示为约500μM，而反式白藜芦醇的为约250μM。因此，二氢白藜芦醇的细胞毒性比反式白藜芦醇低50％。

在本发明的第一个方面的第一个实施方案中，提供了通过向有需要的受试者施用包含有效量的芪类衍生物的组合物治疗胰腺急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，所述芪类衍生物包含结构式(1)的化合物，

其中R₁、R₂和R₃各自独立地选自烷基。术语“烷基”，可为单独或与其他基团组合，包括涉及具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链烷基。通过例如甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基、己基等及其衍生物或化学变体；或所述化合物的混合物、其衍生物和/或化学变体进一步举例说明该术语。

在本发明的第一个方面的第二个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述芪类衍生物是反式3,5,4’-三羟基联苄或二氢白藜芦醇，其是式(2)的化合物：

及其衍生物或化学变体；或所述化合物的混合物、其衍生物和/或化学变体。

在本发明的第一个方面的第三个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述受试者是人或动物。

在本发明的第一个方面的第四个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物是口服施用的。

在本发明的第一个方面的第五个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述胰腺的急性炎性病症包括所有形式的急性胰腺炎和相关的全身性并发症，包括肺损伤。

在本发明的第一个方面的第六个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物以不低于20mg/kg给所述受试者施用，每日不少于3次。

在本发明的第一个方面的第七个实施方案中，提供了治疗胰腺的急性炎性病症和相关的全身性并发症的方法，其中所述组合物以不低于3.24mg/kg施用给所述受试者施用，每日不少于3次。

在本发明中的第二个方面的第一个实施方案中，提供了用于制备分子式C₁₄H₁₄O₃和式(2)的化合物的方法，

其是通过反式白藜芦醇的氢化得到的具有化学名称为反式3,5,4’-三羟基联苄的芪类衍生物。

在本发明的第二个方面的第二个实施方案中，提供了制备分子式C₁₄H₁₄O₃的和式(2)的化合物的方法，其中反式白藜芦醇的氢化包括以下步骤：

在室温下在5个大气压氢气压力下在10％的Pd/C存在下搅拌反式白藜芦醇在无水乙醇(EtOH)中的溶液8小时；

从搅拌的溶液中滤出催化剂；

在真空下蒸发滤液以产生残余物；

使用硅胶色谱利用石油醚和乙酸乙酯(1:1)洗脱残余物以产生二氢白藜芦醇。

工业实用性

本发明的化合物，芪类衍生物反式3,5,4’-三羟基联苄，也被称为二氢白藜芦醇，是用于制备有效治疗急性胰腺炎的药物制剂的有效治疗剂。本发明特别涉及改善组织损伤以达致治疗急性胰腺炎和相关的全身性并发症包括肺损伤。