一种微流控芯片及其在病原体的鉴定与药敏实验中的应用

摘要

本发明公开一种微流控芯片，及其在病原体的鉴定与药敏实验中的应用，利用琼脂培养基具有高温溶解低温凝固的特性，将鉴定培养基置于芯片中层，利用上层芯片浓度梯度发生器，将待研究药物引入。并分隔于不同培养池，借助于培养池阵列的空间分辨力，实现多重病原体分析，根据特异性显色结果实现病原体鉴定，通过实时显色强度分析实现病原体定量，依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定药物敏感性。本发明所述的微流控芯片特别适合于医疗资源匮乏条件下的病原体分析，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于病原体的鉴定与药敏实验技术领域，具体涉及一种微流控芯片，及使用该微流控芯片同步实现宫颈病原体检测与药敏实验的方法。

背景技术

近年来宫颈癌的生物学因素方面取得了突破性进展，大量的流行病学及分子生物学等研究认为有些病原体尤其是通过性传播的病原体与宫颈癌的发生有密切关系，在妇科疾病中，发病率最高的一种疾病就是慢性宫颈炎以及阴道炎。目前对于这些疾病的治疗，大多数医院还是以西医治疗为主，但随着社会的不断发展，中药也逐渐被应用到慢性宫颈炎以及阴道炎的治疗过程中，利用中药对患有妇科疾病的患者进行治疗效果显著，这为患者健康的恢复奠定了基础。

现有的检测病原体的方法主要通过直接涂片染色镜下观察，或者将病原体分离培养鉴定，传统的药敏实验是在96孔板的液体培养基中稀释或使用纸片法形成梯度的方法。确定最小抑菌浓度指导方针的方法是由临床和实验室标准研究所公布的，这些标准化的测试是可靠的，但是操作繁琐，孵育时间较长(通常为16至20小时)，直到MIC可以通过视觉检测培养的浊度或菌落生长。这不利于及时诊断和抗生素选择指导。

传统的细菌鉴定方法是将病人体液标本涂布在含有培养基的琼脂平板上培养增菌，继而挑选优势细菌培养鉴定并且进行药敏实验，这种方法存在的问题在于样品消耗量大和检测时间长，经常无法有效满足临床工作的需求，此外，传统细菌鉴定方法大多依赖于众多的大型专业化设备，限制了该技术在基层医疗单位的推广。

Mohan等在Biosensors and Bioelectronics杂志上第49期公开了一篇名为Amultiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing的文章，制作了一种集成了24个微室的高通量微流控芯片。其微室中设有微型阀片用来促进菌液和药物溶液的混合，通过往微室中注入不同浓度的抗生素与细菌充分混合、反应，并监测不同种类及不同浓度抗生素作用下的细菌生长状态，以筛选出有效的抗菌药及最佳的药物浓度。Sun等在Biosensors and Bioelectronics杂志上的2011年第26期发表一篇名为High-throughput microfluidic system for long-term bacterial colony monitoringand antibiotic testing in zero-flow environments的文章，设计了一个由7条平行主通道和多个平行微室构成的芯片，主通道与微室间通过“梅花形”的微型柱状结构相连，这一设计既能减少液流产生的剪切力对微室中细菌的影响，又能确保将细菌限制于微室内与泵入的药物持续反应。

近年发展起来的微流控芯片细菌分析技术，较之传统方法具有很多优势。首先，芯片细菌分析平台小巧便携，操作简便，非常适合于现场快速检测，其次，芯片微分析平台有利于提高测试通量和降低试样消耗量，便于实现高通量分析；此外，大多数芯片细菌分析方法可以免去预增菌步骤，因而可以显著缩短分析时间。因此，微流控芯片技术为细菌分析提供了一种理想的解决方案。然而，目前报道的微流控芯片细菌分析大多只针对单一种类细菌检测，无法满足临床上对病原菌的分析需求。

目前微流控芯片中常用的免疫分选方式是通过在固相载体上修饰特异性抗体等生物探针进行的。根据探针固定的载体不同，主要分为：微通道免疫分选、免疫磁珠分选以及免疫微珠分选等。但是微通道免疫分选由于微通道直接固定法处理步骤较为繁琐，且因其比表面积较低导致探针的固定数量相当有限，而影响芯片的分选效率。免疫磁珠分选相对于微通道免疫分选法，磁珠有更大的比表面积，能将更多的探针固定于一定表面上，同时无论从设计角度，或是从操作的自动化角度，微流控芯片磁分选相对于大平台上的磁分选而言更具灵活性。磁珠的使用无论是从价格方面或是从分选设备方便都不利于批量生产，甚至电磁场产热还有导致蛋白变性的可能而影响分选效率。免疫微珠分选方式研究是在芯片特定微腔内填充微珠，且使微腔的高度与微珠直径尺寸相近，因而微珠在微腔中呈单层排列，这种设计有效防止了由于微珠在腔内重叠造成光信号的阻滞和因堆砌的微珠导致流体传输阻力的增加。但芯片中为限定微珠于微腔内而设计的“阶梯样”或“堰堤”结构加大了芯片模具的制备难度。

用于细菌鉴定的最现代的仪器的分析是基于完善的表型检测，即根据颜色变化进行鉴别。Holt JG等在Baltimore,MD:Williams&Wilkins上发表Bergey’s manual ofdeterminative bacteriology，使用一个常用的含有发酵糖的试验测试平台检测未知的细菌。pH指示剂或荧光染料显示了不同糖发酵的结果。将代谢结果通过与已知的制得的数据库表进行对比，从而对一个病原体作出鉴别。

本方法简便快速，实验所用试剂简单易得，尤其适于医疗资源匮乏条件下的细菌快速分析。该项技术是将现代化学合成技术、细菌代谢组学与微流控技术相结合应用于病原体检验领域的一项新技术。显色培养基克服了传统培养基在各种细菌分离、鉴别、计数等操作过程中比较复杂(需要有经验的技术人员)、敏感性低和特异性差的缺点。显色培养基与微流控技术结合，节约了试剂的使用量，减少了待检标本的需要量。传统检测细菌，需培养24小时才能通过肉眼观察菌落颜色进行定性或定量分析。本实验既不需要使用磁珠或者微珠作为载体，也不需要使用普通货荧光显微镜来进行结果判定。将待检样品引入芯片并分隔于不同培养池，借助于培养池阵列的空间分辨力，实现多重病原体分析，根据特异性显色结果通过肉眼观察菌落颜色变化实现细菌鉴定，通过实时显色强度Tt值分析实现细菌定量确定病原体的浓度，依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定抗生素敏感性。既缩短了检测时间，又免除了增菌等过程，极大提高了工作效率，节省了能源。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种具有新型结构的微流控芯片，同时提供一种利用所述芯片在病原体的鉴定与药敏实验中的使用方法，具体方案如下：

首先，本发明所述具有新型结构的微流控芯片，包含3层PDMS结构，微流控芯片顶层、微流控芯片中层和微流控芯片底层，其中：

微流控芯片底层为平板结构；例如载玻片；

微流控芯片中层有培养池；所述培养池为16个通孔，排列为4列×4行的矩阵；

微流控芯片顶层设置有入口、液体通道、凹槽和废液孔；

所述入口为两个并列设置的通孔，通孔贯穿微流控芯片顶层；所述的凹槽为16个，排列为4列×4行的矩阵，两个入口和凹槽之间通过液体通道联通；此液体通道嵌合于流控芯片顶层，每一列之内的4个培养池通过液体通道连通；且通过液体通道的设置，使得按照同样速度向入口加样品的时候，相邻列的样品浓度呈梯度变化；

所述废液孔有4个，分别对应的设置于4列凹槽的下游，且通过液体通道相连通；其还具有排气孔的作用。

微流控芯片顶层、中层与底层载玻片封接后形成图3结构；顶层的凹槽与中层的培养池吻合，培养池用于盛装培养基，凹槽相当于培养基的盖子，凹槽内的空间可以使培养基处于厌氧环境。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述液体通道在纵向上的通道数由入口的2个分为3个、再由3个分为4个，最终此4个液体通道分别和4×4的凹槽的每列首个凹槽相连通。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述液体通道深度小于微流控芯片顶层厚度，凹槽深度小于微流控芯片顶层厚度。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述的平板结构为载玻片。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述凹槽直径为3mm；废液孔直径1mm；培养池直径为3mm，培养池高为2mm；液体通道的高为50μm，宽为150μm。

本发明的另一方面，在于公开利用上文所述的微流控芯片在病原体的鉴定与药敏实验中的应用，其方法包括如下步骤：

(1)芯片各层经灭菌后，将底层与中层封接，向培养池中加入液状的显色培养基，待培养基冷却凝固后将上层封接，制得完整芯片；封接后的芯片置于4℃保湿盒中储存，使用前使用紫外灯照射芯片表面1h；

(2)向芯片的两个入口，都注入无水乙醇并使之充满整个液体通道，静置10分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗芯片液体通道，后将芯片进行高压及紫外照射灭菌处理后使用；

(3)向两个入口分别加入稀释液和药物，二孔同时加样，且加样速度一致，使液体通过液体通道后，分别经由凹槽流至各个培养池，待全部培养池充盈后，将废液孔中流出的多余药液去除；

(4)从两个入口同时以50μL/min流速加入待检标本，待全部培养池充盈后，将废液孔中流出的多余菌液去除，进样后将芯片置于温箱中培养，最后观察培养结果。

本发明提供了一种微流控芯片的病原体分析技术，用于多重病原体鉴定与抗生素敏感性测试，利用琼脂培养基具有高温溶解低温凝固的特性，将鉴定培养基置于芯片中层，利用上层芯片浓度梯度发生器(两个入口和凹槽之间通过液体通道又称为浓度梯度发生器)，将待研究药物引入。并分隔于不同培养池，借助于培养池阵列的空间分辨力，实现多重病原体分析，具有操作简便、耗时短、低消耗和高通量的优势，根据特异性显色结果实现细菌定性鉴定，实验使用的琼脂培养基中含有特异性的显色底物，可以在细菌产生酶的作用下发生显色反应；实验通过实时显色强度分析实现细菌定量测定，依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定抗生素敏感性，因此在芯片上实现了多重细菌的同时定性与定量分析和AST。

本发明所述的的微流控芯片特别适合于医疗资源匮乏条件下的病原体分析，后续工作将进一步扩展检测对象范围，以提高该技术的实际应用性能

附图说明

图1：微流控芯片顶层示意图，1是入口，2是加样通道，3是凹槽，4是废液孔。两个入口都是加样口，其一加入山楂核提取液药物，另一入口加入生理盐水，要求向两个入口加样的速度一致；经浓度发生器在第1、2、3、4列形成0:1:2:3浓度梯度的药物(即：第1列为原浓度的稀释液，第4列为原浓度的药液，第2列为药液经过2倍稀释的药液，第3列为药液经过1倍稀释的药液)，以加样时，右侧入口山楂核提取液浓度是25mg/ml为例，在第1、2、3、4列将形成0、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL浓度梯度；所有液体均经废液口排出。

图2：微流控芯片中层示意图；含有16个培养池；

图3：微流控芯片三层结构组合示意图；

图4：实时强度定量参考值。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明实施例中使用的试剂有：

山楂核提取液，步长红核妇洁洗液10ml购自山东步长神州制药有限公司

本发明实施例中用到的白色念珠菌鉴定培养基、金黄色葡萄球菌鉴定培养基、大肠杆菌鉴定培养基、粪肠球菌培养基均购自青岛海博试剂公司；

实施例1

本发明所述的微流控芯片包含3层PDMS结构：

微流控芯片顶层有入口、液体通道、凹槽、废液孔；微流控芯片中层有培养池，微流控芯片底层为平板结构，例如：载玻片；其中：

所述微流控芯片中层的培养池为16个通孔，排列为4列×4行的矩阵，培养池直径3mm，培养池高2mm。

所述微流控芯片顶层的入口有两个；所述的凹槽为16个，排列为4列×4行的矩阵，直径3mm。两个入口和凹槽之间的液体通道称为浓度发生器，所述浓度发生器在纵向上的通道数由入口的2个分为3个、再由3个分为4个，最终此4个液体通道分别和4×4的凹槽的每列首个凹槽相连通。所述废液孔有4个，直径1mm，分别对应的设置于4列凹槽的下游，且通过液体通道相连通；其既是废液孔也是排气孔。

本发明使用自行搭建的微型化细菌培养装置。采用软刻蚀工艺加工成微流控芯片。

微流控芯片顶层、中层与底层载玻片封接后形成图3结构；顶层的凹槽与中层的培养池吻合，培养池用于盛装培养基，凹槽相当于培养基的盖子，凹槽内的空间可以使培养基处于厌氧环境。所述微流控芯片顶层的两个入口分别通过液体通道(内径的高为50μm；宽为150μm)和4列×4行的培养池相连通，每一列之内的4个培养池通过液体通道连通；且通过液体通道的设置，使得按照同样速度向入口加样品的时候，相邻列的样品浓度呈梯度变化。

实施例2

芯片封接过程：

芯片各层经高压121℃灭菌30min。在无菌条件下完成芯片封接，首先将芯片的中层与下层分别经过等离子处理，然后封接，再向培养池中加入液状的特异性显色培养基，所述液状的特异性显色培养基是指，培养基先经过高温高压灭菌后，在其尚未冷却时，所呈现的状态为液体状态(大约45℃以下)；待培养基冷却凝固后将上层与中层等离子处理封接，制得完整芯片。封接后的芯片置于4℃保湿盒中储存，使用前使用紫外灯照射芯片表面1h。

其中，所述的培养基种类分别为：第一行加入白色念珠菌鉴定培养基，第二行加入大肠杆菌鉴定培养基，第三行加入金黄色葡萄球菌鉴定培养基，第四行加入粪肠球菌培养基。

实施例3

本发明所述的微流控芯片在宫颈病原体的鉴定与药敏实验中的应用

每次实验前，首先向芯片的两个入口，都注入无水乙醇并使之充满整个液体通道，静置10分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗芯片液体通道3次。

微量注射器和聚四氟乙烯毛细管在75％酒精中浸泡6h后，用灭菌蒸馏水冲洗3次，置于紫外灯下照射30min。

使用时，在超净工作台上将微量注射器与聚四氟乙烯毛细管连接。选取山楂核提取液作为药敏实验测试药物，在浓度发生器的两个入口，右侧入口泵入山楂核提取液(25mg/mL)，另一孔泵入生理盐水，二孔同时加样，且加样速度一致，使其通过液体通道的浓度发生器，分别经由凹槽流至各个培养池。待全部培养池充盈后，将废液孔中流出的多余药液去除，从两个入口同时加入待检标本，待检标本为采集的使用生理盐水稀释后的宫颈分泌物悬液，进样时，通过微量注射泵向毛细管中吸入1mL稀释液，然后将毛细管与芯片进样通道连接，并以50μL/min流速灌注入芯片。待全部培养池充盈后，将废液孔中流出的多余菌液去除，进样后将芯片置于含有一定湿度的便携式培养装置中，37℃培养18h。

实验过程中，每2h使用佳能Lide 100扫描仪扫描微流控芯片一次并成像，扫描仪的设置为自定义分辨率600DPI的彩色照片。将得到的图像载入到Photoshop CS5中读取平均显色强度值。软件的图像模式为灰度，并用矩形选择工具选定显色区域，读取平均显色强度值。

检测结果：

第一行白色念珠菌鉴定培养基：呈绿色；第一列至第四列绿色颜色呈浓度梯度递减，证明药物浓度为0，病原体正常生长，并起到鉴定待检标本是否存在该病原体的作用，药物浓度越高，病原体存活率越低。

第二行金黄色葡萄球菌鉴定培养基：呈蓝绿色；第一列至第四列蓝绿色颜色呈浓度梯度递减，证明药物浓度为0，病原体正常生长，并起到鉴定待检标本是否存在该病原体的作用，药物浓度越高，病原体存活率越低。

第三行大肠杆菌鉴定培养基：呈黄色；第一列至第四列黄色颜色呈浓度梯度递减，证明药物浓度为0，病原体正常生长，并起到鉴定待检标本是否存在该病原体的作用，药物浓度越高，病原体存活率越低。

第四行粪肠球菌培养基：呈粉红色；第一列至第四列粉红色颜色呈浓度梯度递减，证明药物浓度为0，病原体正常生长，并起到鉴定待检标本是否存在该病原体的作用，药物浓度越高，病原体存活率越低。

以金黄色葡萄球菌作为质控菌株，由于细菌初始数量与显色时间存在相关性，在含有金黄色葡萄球菌鉴定培养基的芯片上分别接种系列浓度金黄色葡萄球菌，分别在培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h检测平均显色强度，拍照结果显示细菌显色时间值与初始细菌密度相关(图4)。根据图4，可以判断细菌初始浓度。在本实验中，在培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h后，可根据标准曲线的回归方程分别计算微流控通道中样品的四种病原体的含量，从而判断病原体对药物的敏感性。

将本法应用于临床实际的宫颈标本中病原体的同时测定。

本实验比较了芯片和传统病原体培养方法中细菌的生存率与增殖率，以金黄色葡萄球菌为例，在分别培养0，2，4，6，8，10，12、14、16、18、20、22、24h后，显微镜下计数结果显示使用两种方法培养的细菌数量在此阶段均不断增加，呈现指数增殖状态，细菌生存率均为100％.芯片组细菌的增殖率总体上要高于培养瓶组，得益于芯片微小培养池中充足的养分和良好的氧气供应，

由于本实验使用的细菌特异性显色培养基种类有限，芯片方法细菌鉴定仅限于四种病原体，本领域技术人员可以根据本发明所述的技术方案，按照各自实际培养的病原菌种类，在不脱离本发明精神的前提下，在实验中增加显色培养基种类加以解决。