一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒

摘要

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒。

背景技术

沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的人兽共患病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介，它不但可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎，还可以作为食源性疾病的病原体，引起人类胃肠炎和食物中毒。在我国，细菌性食物中毒中，约有70％～80％是由沙门菌引起的。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌目前的血清型有2600种以上，中国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。

传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生化特性及血清学鉴定很费力、耗时，需4-7天才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门菌的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得沙门菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒及其制备和应用。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括tcpS基因检测引物、lygD基因检测引物和flhBinner基因检测引物。

优选地，所述tcpS基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

优选地，所述lygD基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

优选地，所述flhBinner基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物。

本发明的试剂盒采用多重PCR检测技术进行tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌或者都柏林沙门菌之一。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR>

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR>

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有tcpS基因、lygD基因或flhBinner基因表达的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因表达的DNA样本。

本发明的第二方面，提供了前述多重PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测引物；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃40s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃10min。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于分别检测和筛选肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌或者都柏林沙门菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究，首次发现tcpS基因仅存在于肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林这三种血清型沙门菌中，lygD基因仅存在于肠炎沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因相较于其它血清型沙门菌flhB缺少中间的核苷酸片段，因而，以三对特异性引物通过PCR技术验证了tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因在不同血清型沙门菌及其它细菌中的分布。本发明的试剂盒能快速高通量分别鉴定肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林血清型沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为这三种特定血清型沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。

附图说明

图1：为利用tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因区分肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的示意图；其中，tcpS基因仅存在于肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林这三种血清型沙门菌中，lygD基因仅存在于肠炎沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因相较于其它血清型沙门菌flhB缺少中间的核苷酸片段(flhBinner)，即鸡白痢/鸡伤寒沙门菌不能扩增出flhBinner片段。

图2：为多重PCR鉴定tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道C50041和C50336：tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)；泳道S06004、9855和SG9：tcpS基因；泳道SL5928：tcpS基因、flhBinner片段；C50041和C50336为肠炎沙门菌，S06004和6508为鸡白痢沙门菌，SG9为鸡伤寒沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，T3为乌干达沙门菌，T9为火鸡沙门菌，T8为鸭沙门菌，G2为伦敦沙门菌，ZX为罗森沙门菌，Y7为德尔卑沙门菌，Y8为鼠伤寒沙门菌，C500为猪霍乱沙门菌；H37Rv为结核分枝杆菌，11168和110为空肠弯曲菌，S19为布鲁氏菌，EGDe和JS15为李斯特菌，1314和1352为大肠杆菌。

图3：为鉴定肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1、4、7、10、13、16为肠炎沙门菌C50041基因组，泳道2、5、8、11、14、17为鸡白痢沙门菌S06004基因组，泳道3、6、9、12、15、18为都柏林SL5928基因组；泳道1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18基因组浓度依次为58.5ng/μl、5.85ng/μl、585pg/μl、58.5pg/μl、5.85pg/μl、585fg/μl。

图4：为PCR鉴定1～24株猪场分离的沙门菌样品中的肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～24为猪场分离的沙门菌；可扩增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三条目的条带的泳道为肠炎沙门菌。

图5：为PCR鉴定1～24株鸡场分离的沙门菌样品中的肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～24为鸡场分离的沙门菌；可扩增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三条目的条带的泳道为肠炎沙门菌，仅扩增出tcpS基因(882bp)的泳道为鸡白痢沙门菌。

图6：为PCR鉴定1～11株牛场分离的沙门菌样品中的肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～11为牛场分离的沙门菌；可扩增出tcpS基因(882bp)、flhBinner片段(155bp)两条目的条带的泳道为都柏林沙门菌。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1生物信息学方法鉴定tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因的分布

在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因，搜索结果表明tcpS基因仅存在于肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌中，lygD基因仅存在于肠炎沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因相较于其它血清型沙门菌flhB缺少中间的核苷酸片段，即鸡白痢和鸡伤寒沙门菌中没有flhB中间片段flhBinner，根据这三个基因的分布特点可将这三种血清型沙门菌区分开(图1)。

实施例2试剂盒的制备

引物设计与合成：分别以tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳检测用引物对，其中，tcpS引物扩增其全长序列(882bp)，lygD引物扩增部分序列(339bp)，flhBinner引物扩增非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的flhBinner片段，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

所述tcpS引物能够扩增出的tcpS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

ATGTCTATAAGCACCACAATGTCAAATATCAACAGAATACAAAAAGACATTGCTAGTCTACAAAAACAACTTTCTGATGAGCAGCGTAAAGAGGCCCAACTTTCAGGAAAAATCAATCAAATAAAGCGTAGCGTCACTAAGTCAACGTCTTTAAGCACATTGAATTCCAAAATGTCAGAGATCTCTCGTCATAAAAATGATATTTCAAGATGTAACTCTAAAAAAGCAGATATTAATAAAAAAATAACAGCAAAAACTGGAGACTTACACCGTTATCAATTACAACTCATTAAAGAGCAAGAGAATGACCAGAAAAAAAGAATTGCTGCACAGAAGAAACTTGAAAAAGAACAATTAGATTACCAGAAGAAAATCACACGAGAATTGAAATCGCAGAAAAGGGCAATATCTCCAAGCCATAAATTCAATCGTCCAGTCATCAACAAATCTGATGAGACAGAAGATATTACAGAGAGTTATGATGTTTTTATCTCTCATGCAACAGAAGATAAAGATAGTTTTGTCCGTCCCCTTGCTGAGTTGTTAAGAGCAAAAGGGATAAATGTATGGTATGACGAATTCTCTTTAGGCTGGGGTAAAAGTCTACGTAAGACAATCGATTATGGATTAGCAAATTCTCGGTTTGGAGTTGTTGTTTTATCTAAATCCTTTATCAAAAAGGACTGGACAGAGTATGAATTAAATGGTTTGACTGCTAGAGAGATGAGCGGTGAAAACCAAGTAATACTGCCTATCTGGCACGAAGTATCTAAATCTGATATTTTAAAATTCAGCCCTACACTAGTAGATAAAATGGCATTAAATACATCGATAAATACCATTGATGAAATTGCTGAACAGCTTGAATCATTATTGAAATGA。

所述lygD引物够扩增出的lygD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

TCACTGATTTTTTAGGCGCTTTTGTGCAGCGAGCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTATATAGCTCATTCTGACCTTTAAGCCGGTCAATGAGTTTTTCTTTCTCAGATTCAGGGAGTATATCAAAAAGGTTTAGTAAATCAGCCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCACCACCTTCGAAGTTGTCATCGTAAGTACCAGAAGAACGAACGTAGTTCATTAGATCGGCCAAATCCGGTCGTAACTCTTCGGGTTTAACTCTCAATAGAACAGAAAATTTTAAGGCCGCATCAGTGTTGAGAGGTGCCTTACCGTTCAAATAGTGACTGACGGTAGATTGTGTCTCAAAGCCCATAAGATCAGCGGCGATCTCCTGAGTAAGTTTGAGGTCTCGCTTTTTGGCGTCCCAGATGGCGCGTAAGCGCTGGGTAGCTTCTGGTGGAGCTATTTCTTCACGTTTTTTTCTCAT。

所述flhBinner引物够扩增出的flhBinner基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

GCAGCGCCGCATGATGGAAGATGTGCCGAAAGCGGACGTCATTGTCACTAACCCGACGCACTATTCCGTGGCGCTGCAGTATGACGAAAACAAAATGAGCGCGCCGAAAGTGGTCGCGAAGGGGGCTGGATTAATAGCGCTGCGCATTCGCGAGATCGGCGCTGAACATCGGGTTCCCACTTTAGAAGCGCCGCCGC。

上述各引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物在多重PCR最终体系中的浓度为80nM。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各引物对，也可以是含有配置好的含有各引物对的PCR检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有无菌水(ddH₂O)、dNTP、PCR>

实施例3试剂盒检测肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的特异性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的三组引物对，以不同血清型沙门菌和其它细菌的基因组分别为模板，多重PCR方法检测肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的特异性。

PCR反应体系为(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O补至25μL。

PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30个循环；72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明以肠炎沙门菌基因组为模板的泳道可扩增出三条带，分别为tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)；以鸡白痢和鸡伤寒沙门菌基因组为模板的泳道仅扩增一条带，为tcpS基因；以都柏林沙门菌基因组为模板的泳道可扩增出两条带，分别为tcpS基因、flhBinner片段(图2)。表明以实施例2所述试剂盒中特定的tcpS、lygD和flhBinner扩增引物，可以通过多重PCR方法快速鉴定未知细菌是否为这三种血清型沙门菌。

实施例4试剂盒检测肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的灵敏性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的三组引物对，将肠炎沙门菌C50041基因组、鸡白痢沙门菌S06004基因组和都柏林沙门菌SL5928基因组依次10倍稀释，分别以稀释的基因组为模板，鉴定试剂盒检测肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的灵敏性。

PCR反应体系为(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O补至25μL。

PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30个循环；72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明基于tcpS、flhBinner和flhBinner的多重PCR检测试剂盒可检测58.5pg/μl的肠炎沙门菌基因组、鸡白痢沙门菌基因组和都柏林沙门菌基因组(图3)。

实施例5试剂盒在猪场的应用

采用实施例2中试剂盒，检测24株猪场分离的沙门菌样品，可快速准确地分别检测出肠炎沙门菌。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本试验中样品采自江苏某猪场，样品的采集、增菌及沙门菌的分离和生理生化鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次试验共分离鉴定了24株沙门菌。

2)多重PCR方法检测样本中肠炎沙门菌

将24株沙门菌分别接种到LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养，次日，使用细菌基因组提取试剂盒提取各株细菌的基因组，以基因组为模板同时扩增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反应体系为(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O补至25μL。PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30个循环；72℃10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三条目的条带的泳道为肠炎沙门菌。结果显示24株沙门菌中共有3株可同时检测到这三条带，分别是9、17和21(图4)，这些沙门菌分离株即为肠炎沙门菌。

3)沙门菌的传统血清型鉴定

本次试验分离的24株沙门菌的血清型鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鉴定结果表明24株沙门菌中共有3株肠炎沙门菌，分别为9、17和21，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。

在本实施例中，采用血清型鉴定的方法，将24株沙门菌中的肠炎沙门菌筛选出来，需要至少2天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，仅需3个小时，即可将24株沙门菌中的肠炎沙门菌准确筛选出来，且正确率为100％。

实施例6试剂盒在鸡场的应用

采用实施例2中试剂盒，检测24株鸡场分离的沙门菌样品，可快速准确地检测出肠炎沙门菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本试验中样品采自江苏某鸡场，样品的采集、增菌及沙门菌的分离和生理生化鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次试验共分离鉴定了24株沙门菌。

2)多重PCR方法检测样本中肠炎沙门菌以及鸡白痢和鸡伤寒沙门菌

将24株沙门菌分别接种到LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养，次日，使用细菌基因组提取试剂盒提取各株细菌的基因组，以基因组为模板同时扩增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反应体系为(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O补至25μL。PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30个循环；72℃10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)三条目的条带的泳道为肠炎沙门菌，仅扩增出tcpS基因(882bp)的泳道为鸡白痢沙门菌。结果显示24株沙门菌样品中共有5株可同时检测到tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，分别是6、8、17、22和24，这些沙门菌即为肠炎沙门菌；共有11株仅检测到tcpS基因，分别是3、5、7、10、12、13、14、16、18、20和21(图5)，这些沙门菌即为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

3)沙门菌的传统血清型鉴定

本次试验分离的22株沙门菌的血清型鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鉴定结果表明22株沙门菌中共有5株肠炎沙门菌，分别为6、8、17、22和24，共有11株鸡白痢沙门菌，分别为3、5、7、10、12、13、14、16、18、20和21，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。

在本实施例中，采用血清型鉴定的方法，将24株沙门菌中的肠炎沙门菌以及鸡白痢和鸡伤寒沙门菌筛选出来，需要至少2天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，仅需3个小时，即可将24株沙门菌中的肠炎沙门菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门菌准确筛选出来，且正确率为100％。

实施例7试剂盒在牛场的应用

采用实施例2中试剂盒，检测11株牛场分离的沙门菌样品，可快速准确地检测出都柏林沙门菌这三种血清型。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本试验中样品采自江苏某牛场，样品的采集、增菌及沙门菌的分离和生理生化鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，本次试验共分离鉴定了11株沙门菌。

2)PCR方法检测样本中都柏林沙门菌

将11株沙门菌分别接种到LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养，次日，使用细菌基因组提取试剂盒提取各株细菌的基因组，以基因组为模板同时扩增tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段，PCR反应体系为(25μL)：dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，tcpS-F 80nM，tcpS-R 80nM，lygD-F 80nM，lygD-R 80nM，flhBinner-F 80nM，flhBinner-R 80nM，模板2μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O补至25μL。PCR程序为94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃40s，30个循环；72℃10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出tcpS基因(882bp)、flhBinner片段(155bp)两条目的条带的泳道为都柏林沙门菌。结果显示11株沙门菌中仅7号样品同时含tcpS基因和flhBinner片段(图6)，该沙门菌即为都柏林沙门菌。

3)沙门菌的传统血清型鉴定

本次试验分离的11株沙门菌的血清型鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鉴定结果表明11株沙门菌中共有1株都柏林沙门菌，为7号分离菌，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。

在本实施例中，采用血清型鉴定的方法，将11株沙门菌中的都柏林沙门菌筛选出来，需要至少2天的时间。而采用本发明实施例2的检测试剂盒，仅需3个小时，即可将11株沙门菌中的都柏林沙门菌准确筛选出来，且正确率为100％。

综上所述，本发明试剂盒相较于传统血清型鉴定方法的优势：

传统血清型鉴定需购买特定的沙门菌血清型鉴定试剂盒，价格昂贵，步骤繁琐，尤其在大样本中分离特定的血清型沙门菌(如肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌或者都柏林沙门菌)时，需耗费大量时间(至少两天)，且工作量庞大，其结果是由肉眼进行判断，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，整个鉴定过程在三小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。

因此，本发明的一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒，有利于简化沙门菌血清型鉴定的传统步骤，为在大量样本中筛选肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林血清型沙门菌提供了一种快速鉴定的新方法。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。