用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合及其方法和应用

摘要

本发明提供了一种用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合，其包括组合SSR16‑InDel2和/或组合SSR48‑InDel2，引物对SSR16的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，引物对SSR48的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，引物对InDel2的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。将SSR标记和InDel标记进行组合，采用双重PCR技术检测小型西瓜品种“琼丽”杂交种纯度，扩增出的多态性条带能够准确地将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来，进一步提高了检测效率和检测的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合及其方法和应用。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai)原产非洲地区，属于葫芦科西瓜属一年生蔓生草本植物，其果实味甜多汁，富含多种营养成分，在热带、亚热带地区广泛栽培。我国不仅是西瓜的生产大国，而且是消费大国。选育适应不同栽培模式和市场需求的西瓜新品种是当今西瓜育种的主要目标。小型西瓜外形美观，含糖量高，品质优良，生长期短，早熟，单瓜重1.0-2.5kg，适宜多样化栽培，经济效益远远高于普通西瓜，栽培面积呈现稳定增长的趋势。

种子是实现农业科技进步的载体，作为重要的生产资料，其质量的好坏直接影响农作物的产量。种子纯度是影响种子质量的主要因素，开展杂交种纯度检测对于保障优良品种的增产潜力具有重要意义。田间种植鉴定和同工酶电泳技术常用于作物杂交种纯度检测。但田间种植纯度鉴定周期较长，需要耗费大量的人力、物力资源，容易受环境条件和鉴定者经验的影响，鉴定结果准确性较差。同工酶鉴定多态性不够丰富，并且具有组织和器官特异性。随着西瓜新品种的不断增加，传统鉴定技术难以快速、准确检测亲缘关系较近的杂交种的纯度。分子标记技术能够从基因组水平上揭示不同材料间的遗传变异，多态性丰富，不受环境条件影响，无组织、器官及发育特异性，能够在植株生长的任何时期进行检测，并且鉴定时间较短。西瓜全基因组测序及部分材料重测序的完成推动了分子标记的开发和应用，使得从基因组水平上检测小型西瓜杂交种纯度成为可能。

“琼丽”是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所经多年研究选育出的早熟小果型西瓜品种，于2013年通过海南省品种认定。该杂交组合全生育期冬播72-78d，夏播60-63d，果实发育期为26-28d，第一雌花节位为5-6节，雌花间隔节位4-5节；果实短椭圆形，果型指数为1.27，外观清秀，深绿果皮覆墨绿细齿条带13-15条，瓜瓤橙红色，色泽均匀，中心可溶性固形物为12.0％-12.5％，最高可达13％，肉质细腻无纤维，具有特殊清香味，口感极佳。果皮薄，皮厚0.4-0.5cm，种子卵圆形，千粒重40g，植株抗病性强，易座果，适于保护地栽培，也可露地栽培。

SSR(Simple Sequence Repeats)标记，也称为微卫星DNA，是根据基因组序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型，依据重复单位数目的不同检测遗传多态性。SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、在染色体上均匀分布、扩增的稳定性和重复性较好、不受环境因素和植株发育阶段的影响等优点。InDel(Insertion/Deletion)标记，通过比较两份材料基因组的差异，检测插入或缺失位点，根据插入缺失位点两端的序列设计引物检测遗传多态性。近年来，随着西瓜基因组测序和部分材料重测序研究的开展，丰富的序列资源为西瓜SSR和InDel标记的开发提供了便利条件。目前利用SSR和InDel标记基于双重PCR技术建立小型西瓜杂交种纯度鉴定方法尚未见报道。

发明内容

传统的作物杂交种纯度检验方法具有鉴定周期较长、鉴定结果易受环境条件和鉴定者经验的影响，准确性较差、需要大量的人力，物力资源、成本较高等缺点，在一定程度上限制了良种的及时销售。针对以上问题，本发明的目的是开发用于“琼丽”小型西瓜杂交种纯度检测的SSR、InDel分子标记，并建立双重PCR技术，进一步提高检测效率和检测结果的准确性。

本发明的第一个方面是提供一种用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的引物组合，所述引物组合包括组合SSR16-InDel2和/或组合SSR48-InDel2，其中

引物对SSR16的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，

引物对SSR48的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，

引物对InDel2的核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。

本发明的第二个方面是提供一种用于检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组合。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含组合SSR16-InDel2和/或组合SSR48-InDel2。

本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物对或本发明第二个方面所述的试剂盒在检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度中的应用。

本发明的第四个方面是提供一种检测“琼丽”小型西瓜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：

步骤1，取样品播种，从作物中提取DNA；

步骤2，用本发明第一个方面所述的引物组合、或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，检测扩增产物，并作出判断。

本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。

本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的PCR扩增的反应体系为：总反应体系为10μL，其中包括小型西瓜(“琼丽”)单株DNA30ng，引物组合40ng，0.2mM dNTPs，Taq DNA聚合酶0.6U，10×PCRBuffer 1μL，最后用无菌超纯水补齐至10μL。所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，50℃或56℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；72℃终延伸6min。在一个优选的实施方式中，退火温度为56℃。

本发明中，对所述PCR扩增产物进行检测的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，通过凝胶电泳进行检测，根据多态性条带的扩增结果鉴定小型西瓜品种“琼丽”的纯度。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得检测结果。在一个优选的实施方式中，电泳缓冲液最佳浓度为0.5×TBE。

其中，在PCR反应体系中，各引物对的浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次即可，一般为0.1～0.5μM之间。因此，在本发明中，不对引物对SSR16、引物对InDel2和SSR48的比例进行限定。

但根据发明的一些具体示例，在一个优选的实施方式中，所述PCR扩增的反应体系中：如果存在组合SSR16-InDel2，则引物对SSR16和引物对InDel2的浓度比为1-100:1；如果存在组合SSR48-InDel2，则引物对SSR48和引物对InDel2的浓度比为1-100:1。

进一步优选地，如果存在组合SSR16-InDel2，则引物对SSR16和引物对InDel2的浓度比为10:1；如果存在组合SSR48-InDel2，则引物对SSR48和引物对InDel2的浓度比为10:1。

本发明的第五个方面是提供一种引物对，所述引物对为SSR16，其核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。

本发明的第六个方面是提供一种引物对，所述引物对为SSR48，其核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，所述引物对为InDel2，其核苷酸序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。

作物杂交种田间纯度鉴定周期较长，易受多种因素影响，准确性较差。分子标记技术的发展，为快速、准确鉴定小型西瓜杂交种纯度提供了技术支撑。本发明结合全基因组比对和比较基因组学原理开发了特异性较高的西瓜SSR和InDel分子标记，利用在“琼丽”亲本间表现多态性的SSR和InDel分子标记，结合双重PCR技术，以“琼丽”单株DNA为模板进行PCR扩增，根据多态性条带的扩增结果检测杂交种的纯度。共显性的SSR标记SSR16和SSR48、InDel标记InDel2扩增出的多态性条带能够准确地将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来，将SSR标记(SSR16和SSR48)分别和InDel标记(InDel2)进行组合，优化扩增条件和电泳条件，采用双重PCR技术检测小型西瓜品种“琼丽”杂交种纯度，进一步提高了检测效率和检测的准确性。

附图说明

图1为SSR、InDel标记组合SSR16-InDel2、SSR48-InDel2在亲本材料及部分“琼丽”单株中的扩增结果。其中M代表DL2000 DNA Marker，1为“琼丽”母本材料MN-123，2为“琼丽”父本材料FR-59-1，3-24为“琼丽”单株。检测结果表明，18号、23号单株为母本自交株。

图2为SSR标记SSR16、SSR48，InDel标记InDel2在亲本材料及部分“琼丽”单株中的扩增结果。其中M代表DL2000 DNA Marker，1为“琼丽”母本材料MN-123，2为“琼丽”父本材料FR-59-1，3-11为“琼丽”单株。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明做进一步详细说明，以更好地理解本发明。以下如无特殊说明，本发明所涉及设备及耗材均为市售设备及耗材。

本发明所需主要仪器设备为：液氮罐，研钵，水浴锅，旋涡混匀器，高速冷冻离心机，96孔板离心机，梯度PCR仪，垂直电泳槽，电泳仪，摇床，观片灯箱。

本发明所需主要试剂为：CTAB、氯化钠、EDTA、Tris、盐酸、氯仿、苯酚、异戊醇、无水乙醇、超纯水、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、溴酚蓝、去离子甲酰胺、二甲苯青FF、硼酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DL2000 DNAMarker、过硫酸铵、TEMED、硝酸银、无水碳酸钠、氢氧化钠、甲醛。

(1)参考西瓜品系97103基因组序列，利用软件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)通过设置重复单位长度参数搜索西瓜基因组序列中的微卫星，根据微卫星两侧的序列设计引物，结合全基因组比对分析，开发特异性较高的SSR分子标记。采用SOAPindel(http://soap.genomics.org.cn/)软件通过比对西瓜品系PI296341-FR和97103基因组序列，并结合比较基因组学原理，开发InDel标记。

(2)以母本材料MN-123和父本材料FR-59-1基因组DNA为模板，利用开发的SSR和InDel引物进行PCR扩增，筛选在“琼丽”亲本间表现多态性的SSR和InDel引物。其中2对SSR引物(SSR16和SSR48，见表1)在“琼丽”亲本间能扩增出明显的多态性(图2)，分别位于西瓜第2和6号染色体上，带型为双亲互补带型。1对InDel引物(InDel2，见表1)在“琼丽”亲本间能扩增出明显的多态性(图2)，位于西瓜1号染色体上，带型为双亲互补带型。这3对引物可用于“琼丽”杂交种纯度鉴定。

表1 SSR16、SSR48和InDel2的核苷酸序列

引物名称正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)SSR16CCTCCTTCTCCATTCTCAACTTTACATGATACTAATTGAGTTGTAAAAGSSR48ATATTCGCAACTCCTAACTTCATATCATTCTAAACAATGTTTTGTCAAGInDel2CAATGGATTCAAGCAACTATCTGAAGGTTCTTCACTCTAGAGATGATCA

(3)将小型西瓜品种“琼丽”母本材料MN-123、父本材料FR-59-1及245粒“琼丽”的种子播种于育苗盘中，待植株长2～3片真叶时进行取样，迅速冻于液氮中，采用改良的CTAB法分别提取不同单株的基因组DNA。采用改良的CTAB法提取小型西瓜叶片基因组DNA的具体步骤如下：

配制2％CTAB提取液(0.05M EDTApH 8.5，0.1M Tris pH 7.0，0.7M NaCl，2％CTAB)，于121℃高温灭菌30min，使用前添加2％巯基乙醇，并于65℃水浴锅中预热20min；

利用液氮将西瓜叶片研磨成粉末并迅速转入1.5mL离心管，样品达到离心管1/3处为宜，每管加入CTAB提取液650μL并于65℃水浴30min(每隔5min摇动一次)；

水浴结束后轻轻打开离心管盖，加入苯酚/氯仿/异戊醇抽提液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)650μL充分混匀10min，4℃10000rpm离心15min；

轻轻吸取上清液并转入新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇进行二次抽提(氯仿：异戊醇＝24:1)充分混匀8min，4℃10000rpm离心10min；

轻轻吸取上清液转入1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，置4℃冰箱中沉淀10min；

利用枪头将絮状DNA沉淀挑出并置于1.5mL离心管中，采用75％的乙醇溶液漂洗3遍，自然晾干；

加入200μL灭菌的超纯水，轻轻摇动，将DNA母液贮于-20℃冰箱中备用。将DNA母液稀释20倍即可用于PCR扩增反应。

(4)以“琼丽”单株基因组DNA为模板，扩增在“琼丽”亲本间表现多态性的引物。

PCR扩增反应体系及程序为：总反应体系为10μL，其中包括“琼丽”单株DNA30ng，引物组合40ng(组合SSR16-InDel2和组合SSR48-InDel2，引物对SSR16和引物对InDel2的浓度比为10:1；引物对SSR48和引物对InDel2的浓度比为10:1)，0.2mM dNTPs，0.6U Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer 1μL，最后用无菌超纯水补齐至10μL。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；72℃终延伸6min。PCR产物保存于4℃。

(5)扩增产物检测：将2μL扩增产物与2μL上样缓冲液(98％去离子甲酰胺，0.01MEDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯青FF)混合，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1)电泳，电泳缓冲液的浓度采用0.5×TBE，200v恒定电压电泳5h，银染显色统计带型。

(6)根据多态性条带扩增结果鉴定“琼丽”小型西瓜杂交种纯度。“琼丽”品种纯度(％)＝(1-a/A)×100％，其中A为待检测“琼丽”植株数目，a为单独具有母本条带特征或单独具有父本条带特征或扩增条带既不同于父母本条带特征也不同于“琼丽”条带特征的植株数目。检测结果显示，243个“琼丽”单株同时具有双亲的特异谱带，属于真实的杂交种，18号、23号单株仅具有母本多态性条带，不具有父本多态性条带(附图1)，说明18号、23号单株为母本自交株，小型西瓜“琼丽”杂交种的纯度为99.18％。而且单独使用引物对SSR16、SSR48和InDel2进行扩增，也能根据多态性条带扩增结果鉴定“琼丽”小型西瓜杂交种纯度(附图1和附图2)。

(7)分子鉴定结果与田间鉴定结果比较分析

将取材后的母本材料MN-123、父本材料FR-59-1及“琼丽”单株幼苗按照顺序移栽到实验基地，参照小型西瓜田间栽培技术进行水肥管理及病虫害防治，在果实成熟期依据品种的特征特性逐株进行纯度鉴定，其中母本MN-123果实圆形，果肉黄色，中心含糖量12.5％左右，皮厚0.4cm左右，较脆。父本FR-59-1果实长椭圆形，果肉红色，中心含糖量为12.0％左右，皮厚0.5cm左右，较韧。“琼丽”果实短椭圆形，果肉橙红色，中心含糖量12.0％-12.5％，皮厚0.5cm左右，较韧。18号、23号植株与母本性状一致，果实圆形，果肉黄色，其余待检测“琼丽”单株果实短椭圆形，果肉橙红色，田间种植形态学鉴定结果与标记SSR16-InDel2、SSR48-InDel2检测结果一致，该结果说明基于SSR、InDel标记的双重PCR技术可以快速、准确地鉴定“琼丽”小型西瓜杂交种纯度。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。