莫海威芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法

摘要

本发明涉及莫海威芽孢杆菌的应用及其降解萘的方法，属于环境微生物应用领域。本发明的莫海威芽孢杆菌B1811，保藏编号为CGMCCNo.12805；保藏时间为2016年7月21日；属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；其应用为降解萘（NAP）；对萘的降解率可高达99.6%。采用本发明的莫海威芽孢杆菌B1811降解萘的方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与萘接触。本发明降解萘的方法，与本发明之前细菌、真菌降解萘的方法相比，在菌种来源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及莫海威芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法，属于环境微生物应用领域。

背景技术

萘(naphthalene,NAP)是环境中普遍存在的具有代表性的一类重要持久性有机污染物(persistentorganic pollutants，POPs)。大量研究已经证明，萘具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，是环境中一类危险而且需重点研究的、也是各国优先控制的污染物。由于大气沉降、污水灌溉、固体废弃物填埋渗漏、油田开采和石油产品大量使用等，造成全球范围内地方土壤萘污染，在我国许多地方已出现较严重污染的情况。萘由于性质稳定、难于降解，在土壤环境中呈不断积累的趋势，严重危害着土壤的生产和生态功能、农产品质量和人类健康。目前，治理污染土壤的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。其中生物修复技术因具有成本低、无二次污染、可大面积应用等独特优点而越来越受到人们的重视，是目前最具潜力的土壤修复技术之一。

莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）主要应用在脂肪酶的发酵，目前未见有关利用莫海威芽孢杆菌降解萘的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够降解萘的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解萘的方法。

技术方案

本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；是杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种莫海威芽孢杆菌（Bacillus>）；命名为莫海威芽孢杆菌B1811；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号为CGMCCNo.12805；保藏时间为2016年7月21日。

本发明的莫海威芽孢杆菌B1811能够降解萘（NAP）；莫海威芽孢杆菌B1811对NAP的降解率可高达96.4-99.6%。

采用本发明的莫海威芽孢杆菌B1811降解NAP的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与NAP接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM 基础盐液体培养基存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与NAP接触；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物3-8g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。

具体的，是将NAP 加入改良BSM 基础盐液体培养基；将莫海威芽孢杆菌B1811种子液接种于改良BSM 基础盐液体培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

上述方法，优选的，改良BSM 基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6g/L。

上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃，其他条件相同情况下，此条件下菌B1811的降解率最高。

上述方法，莫海威芽孢杆菌B1811种子液相对于改良BSM 基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的NAP降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中NAP含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。

上述方法，所述莫海威芽孢杆菌B1811种子液是由莫海威芽孢杆菌B1811培养获得的。在获得莫海威芽孢杆菌B1811的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得莫海威芽孢杆菌B1811种子液。

本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。

本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。

有益效果：

（1）首次分离培养出能够降解萘的莫海威芽孢杆菌B1811；

（2）莫海威芽孢杆菌B1811对萘的降解率最高为99.6%；

（3）本发明降解萘的方法，与本发明之前细菌、真菌降解萘的方法相比，在菌种来源上具有新意，其对萘的降解效果显著，降解周期短，操作简单。

保藏说明：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中国科学院微生物研究所

保藏日期：2016年7月21日

保藏编号：CGMCCNo.12805

分类命名：莫海威芽孢杆菌（Bacillus>）。

附图说明

图1为本发明中所述莫海威芽孢杆菌B1811的显微镜下形态特征；图1中，莫海威芽孢杆菌B1811为杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；

图2为采用紫外分光光光度法获得的吸光值（OD）-萘浓度的标准曲线；

图3为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的16S rDNA序列系统发育分析；

图4为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的recA序列系统发育分析。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1菌株B1811的鉴定

菌株B1811分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。

(1)16S rDNA 序列分析：

16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；

16s rDNA反向引物1541R：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′，如SEQ ID NO.2所示；

扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1461bp。将该扩增所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株Bacillus mojavensis RO-H-1T/JH600280同源性达99.8％。

(2)gyrB基因序列分析

gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQ ID NO.4所示；

gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQ ID NO.5所示；

扩增所得gyrB基因序列如SEQ ID NO：6所示，序列全长为887bp。将该扩增所得gyrB基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株B.malacitensis>

因此可以判定B1811为一种全新的莫海威芽孢杆菌。经过鉴定确认其所属菌种后，莫海威芽孢杆菌B1811于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12805；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。

实施例2 莫海威芽孢杆菌B1811液体摇瓶培养液制备

（1）斜面培养：莫海威芽孢杆菌B1811接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、琼脂 1.8g、蒸馏水余量，pH为中性，115℃灭菌20 min。

（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175 rpm、30℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液；所述种子培养基，每1L中含有的成分为：硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、琼脂粉15g、酵母提取物5g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。

（3）将5.0mg 的NAP 以无菌操作加入含有50mL的改良BSM 基础盐液体培养基的摇瓶中，将莫海威芽孢杆菌B1811的种子培养液以1mL的接种量接种到摇瓶中，在175r/min、30℃的条件下恒温震荡培养72h；所述改良BSM 基础盐液体培养基，每1L中含有的成分为：酵母提取物5.0g、硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌15min。

实施例3 NAP 标准曲线制定与含量测定

（1）以正己烷为溶剂配制400mg/L 的萘母液，分别稀释20 倍、25 倍、30 倍、35 倍、40 倍、80 倍、100 倍、200倍以备用，取2.5mL不同稀释倍数的萘溶液置于3mL 石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定275nm波长下的吸光值，并以吸光值为纵坐标，萘的浓度作为横坐标绘制标准曲线；标准曲线如图2所示；进而获得吸光值-浓度方程：y=0.0424x-0.0033，x为萘的浓度，y为吸光值。

（2）取2.5mL实施例1获得的发酵液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定275nm波长下的吸光值；然后根据吸光值-浓度方程计算出萘的浓度。

（3）降解率的计算公式：降解率%= (C0-C)/C0*100%，C0 为用莫海威芽孢杆菌B1811降解之前的NAP质量浓度（mg/L）（即实施例1步骤（3）发酵培养之前摇瓶中混合液的NAP质量浓度89.29mg/L）中，C 为发酵液中的NAP 残留浓度（mg/L）。经计算，实施例1的降解率为98.1%。

实施例4 莫海威芽孢杆菌B1811降解萘条件（接种量）的优化

将实施例2步骤（3）中的种子液接种量依次改为2、3、4、5、6mL，其他操作同实施例1。按照实施例3的步骤测定发酵液的NAP浓度，进而计算NAP的降解率。在不同接种量条件下，NAP降解率如表1所示。

实施例5 莫海威芽孢杆菌B1811降解萘条件（改良BSM 基础盐液体培养基的酵母提取物的含量）的优化

将实施例2步骤（3）中所用改良BSM 基础盐液体培养基的酵母提取物的含量依次修改为3、4、5、6、7、8g/L；其他操作同实施例2。按照实施例3的步骤测定发酵液的NAP浓度，进而计算NAP的降解率。在不同酵母提取物的含量条件下，NAP降解率如表2所示。

表1

种子液接种量（mL）NAP降解率（%）00198.1298.3398.9499.2599.5699.5

；

表2

酵母提取物的含量（g/L）NAP降解率（%）00396.4496.7598.1699.6799.2899.2

<110>北京工商大学

<120>莫海维芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG20

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

AAGGAGGTGA TCCAGCC17

<210>3

<211>1461

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ATACATGCAG TCGAGCGGAC AGATGGGAGC TTGCTCCCTG ATGTTAGCGG CGGACGGGTG60

AGTAACACGT GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC GGGGCTAATA120

CCGGATGCTT GTTTGAACCG CATGGTTCAA ACATAAAAGG TGGCTTCGGC TACCACTTAC180

AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAATG GCTCACCAAG GCAACGATGC240

GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC300

GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT360

GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTACCGTTCG420

AATAGGGCGG TACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG480

CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GGGCTCGCAG540

GCGGTTCCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT600

GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA660

GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC720

GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT780

GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT AACGCATTAA GCACTCCGCC840

TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT900

GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG960

ACAATCCTAG AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC1020

GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA1080

GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG TGACAAACCG GAGGAAGGTG1140

GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGAC1200

AGAACAAAGG GCAGCGAAAC CGCGAGGTTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG1260

GATCGCAGTC TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT1320

GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT1380

AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTAT GGAGCCAGCC GCCGAAGGTG GGACAGATGA1440

TTGGGGTGAA GTCGTAACAA G1461

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ggTgTWRgKg CNgTCgTAAA Cg22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CCSgCAgART CACCCTCTAC g21

<210>6

<211>887

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

AACGCGTTAT CAACAGAGCT TGATGTGACT GTTCACCGTG ACGGAAAAAT CCATCGCCAA60

GTCTATAACC GCGGTGTCCC GGTTTCTGAT CTTGAGGTTA TTGGCGAAAC GGATCATACA120

GGAACGACTA CACACTTTGT TCCAGATCCT GAAATCTTCA CGGAAACAAC TGAGTATGAA180

TATGATTTGC TTGCTAACCG TGTTCGCGAA CTAGCCTTTT TGACAAAAGG CGTAAACATC240

ACGATTGAAG ATAAACGTGA AGGCCAAGAG CGCAAAAATG AGTATCATTA CGAAGGCGGA300

ATTAAAAGCT ATGTAGAGTA TTTAAACCGC TCCAAAGAAG TTGTCCATGA AGAGCCGATT360

TATATTGAAG GCGAAAAGGA CGGCATTACG GTTGAAGTCG CTCTGCAATA CAATGACAGC420

TACACAAGCA ATATTTACTC ATTTACAAAC AATATCAACA CGTACGAAGG CGGTACCCAC480

GAAGCCGGTT TTAAAACGGG GCTGACTCGT GTCATCAATG ATTACGCCAG AAAAAAAGGA540

CTCATAAAAG AAAATGATCC AAACTTAAGC GGAGATGATG TGAGAGAAGG GCTTACCGCG600

ATTATCTCGA TCAAACACCC GGATCCGCAG TTCGAAGGCC AAACGAAAAC AAAACTAGGC660

AACTCAGAGG CGCGGACGAT CACAGATACG TTATTTTCTG CTGCGTTGGA AACCTTTATG720

CTGGAAAATC CAGATGCGGC CAAAAAAATC GTTGACAAAG GCTTAATGGC AGCAAGAGCA780

AGAATGGCTG CGAAAAAAGC GCGTGAATTA ACGCGCCGCA AAAGTGCTTT GGAGATTTCA840

AACCTTCCTG GTAAATTAGC GGACTGCTCT TCGAAAGACC CGAGCAT887

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