一种人类表皮生长因子受体‑2浓度的检测方法

摘要

本发明公开了一种人类表皮生长因子受体‑2浓度的检测方法，包括以下步骤：将金电极打磨、清洗、干燥；将金电极插入多肽溶液中自组装，巯基己醇封闭；取不同浓度HER‑2分别滴加至上述金电极表面进行反应，然后与适配体反应；将钼酸盐滴加在金电极表面反应得多根待测金电极；用方波伏安法分别对金电极进行测定，得多条方波伏安曲线，将各曲线中的峰电流与对应的HER‑2浓度做标准曲线；取待测HER‑2滴加至组装有多肽的金电极表面反应，再与适配体反应，将钼酸盐滴加在金电极表面，用方波伏安法测定得方波伏安曲线，将峰电流与标准曲线对照，测得HER‑2的浓度。该检测方法方便快捷、选择性好、灵敏度高、检测范围宽。

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及一种人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2；HER-2)是一种受体络氨酸激酶，在多种人类癌症中都有着高度的表达。它是乳腺癌的特殊标志蛋白质，与乳腺癌的转移性密切相关，可以有效判断乳腺癌的愈后情况。

表皮生长因子相关蛋白家族的受体络氨酸激酶在几种癌症中作为主要的治疗目标在上皮增长中起着重要作用。过度表达和突变的EebB(HER)家族成员会导致大量的恶性肿瘤，传统的测定HER-2的方法有表面等离子体共振、免疫组化，酶联免疫法等。这些检测方法虽然在一定程度上灵敏有效，但对技术要求高，耗时耗力，且对仪器有一定的要求，各自具有一定的局限性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种方便快捷、选择性好、灵敏度高、检测范围宽的人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法，包括以下步骤：

(1)将金电极进行打磨、清洗、干燥后得到经过预处理的金电极；

(2)将经过预处理的金电极插入能与人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的多肽溶液中进行自组装，自组装完成后进行冲洗，然后用巯基己醇封闭，再次进行冲洗，得到组装有多肽的金电极；

(3)取不同浓度的人类表皮生长因子受体-2分别滴加至多根步骤(2)所得组装有多肽的金电极表面进行反应，反应完后进行冲洗，然后与能和人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的适配体反应，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到多根修饰后的金电极；

(4)将钼酸盐溶液滴加在步骤(3)所得修饰后的金电极表面进行反应生成磷钼酸盐沉淀，得到多根待测金电极；

(5)用方波伏安法分别对步骤(4)所得多根待测金电极进行测定，得到多条方波伏安曲线，然后将各方波伏安曲线中的峰电流与对应的人类表皮生长因子受体-2浓度做标准曲线；

(6)取未知浓度的待测人类表皮生长因子受体-2滴加至步骤(2)所得组装有多肽的金电极表面进行反应，反应完后进行冲洗，然后与能和人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的适配体反应，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到未知浓度人类表皮生长因子受体-2修饰后的金电极；

(7)将钼酸盐溶液滴加在未知浓度人类表皮生长因子受体-2修饰后的金电极表面进行反应生成磷钼酸盐沉淀，得到未知浓度人类表皮生长因子受体-2待测金电极；

(8)用方波伏安法对步骤(7)所得未知浓度人类表皮生长因子受体-2待测金电极进行测定，得到方波伏安曲线，然后将该方波伏安曲线中的峰电流与步骤(5)所得标准曲线进行对照，即测得步骤(6)所述未知浓度的待测人类表皮生长因子受体-2的浓度。

本发明的检测方法将“金电极表面预处理”-“多肽自组装”-“巯基己醇封闭”-“适配体修饰”-“磷钼酸盐沉淀”-“扫方波伏安曲线”等多个步骤相结合对HER-2浓度进行检测，操作方便、选择性好、灵敏度高，而且检测范围较宽。本发明采用能与HER-2进行特异性识别的多肽在金电极表面进行自组装，多肽中含有巯基，巯基中的S与金电极通过Au-S键结合，得到组装有多肽的金电极；用巯基己醇对金电极表面进行封闭，防止在金电极表面发生非特异性吸附；然后在金电极表面滴加能和HER-2进行特异性识别的适配体进行反应，该适配体是一种单链DNA，具有高亲和力和特异性，能特异性结合目标分子HER-2，适配体中含有大量的磷酸基团，这些磷酸基团能与钼酸盐反应生成磷钼酸盐沉淀，产生电化学信号，HER-2的浓度与产生的电化学信号中的峰电流强度成正比(如图2)；在传统的检测方法中适配体通常只作为目标识别探针分子，而在本发明中适配体不仅起到了目标识别探针分子的作用，还作为信号探针分子，大大简化了检测步骤。通过对不同浓度HER-2金电极扫方波伏安曲线进行分析处理后得到标准曲线，该标准曲线为一条直线(如图3)，HER-2的浓度越大则对应的方波伏安曲线中的峰电流也越大；再对未知浓度的HER-2金电极扫方波伏安曲线，将所得方波伏安曲线中的峰电流与标准曲线对照，测得未知浓度HER-2的浓度。本发明利用能与HER-2进行特异性识别的多肽代替传统检测方法中的一抗，利用能与HER-2进行特异性识别的适配体代替传统检测方法中的二抗，简化了检测步骤，降低了检测成本，提高了检测选择性和灵敏度。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(2)中，所述能与人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的多肽序列为CKLRLEWNR。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(4)和步骤(7)中，所述钼酸盐为钼酸钠或钼酸钾，所述钼酸盐的浓度为1-5mmol/L，所述反应的温度为32-42℃，反应时间为0.5-1h。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(3)和步骤(6)中，所述适配体序列为GCAGCGGTGTGGGG。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(5)和步骤(8)中，所述方波伏安法的具体测定条件为：以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V电压范围内，以15Hz的频率进行测定。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(1)中，所述将金电极进行打磨、清洗、干燥的具体过程为：先将金电极用粒径为0.3μm的抛光粉打磨4-6min，然后用粒径为0.05μm的抛光粉进行二次抛光，将经过二次抛光后的金电极用二次水清洗，然后用无水乙醇超声1-3min，再次进行冲洗，然后用二次水超声1-3min，超声完毕后取出金电极，再用氮气吹干。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(2)中，所述将经过预处理的金电极插入至能与人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的多肽溶液中进行自组装的具体过程为：将经过预处理的金电极倒置插入装有8-12μg/mL能与人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的多肽溶液的离心管中，32-42℃条件下反应8-24h进行自组装。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(2)中，所述用巯基己醇封闭的具体步骤如下：将经过自组装后的金电极倒置插入装有0.8-1.2mmol/L巯基己醇的离心管中，32-42℃条件下封闭0.4-0.6h。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(3)中，所述取不同浓度的人类表皮生长因子受体-2分别滴加至组装有多肽的金电极表面进行反应具体是指：取浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL和5ng/mL的人类表皮生长因子受体-2分别滴加至多个组装有多肽的金电极表面，反应0.8-1.2h。

上述的检测方法，优选的，所述步骤(3)中，所述与能和人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的适配体反应的具体过程为：将能和人类表皮生长因子受体-2进行特异性识别的适配体以10000-14000rpm的转速离心处理1-3min，然后用二次水溶解，得到适配体溶液，再将所得适配体溶液滴加到金电极表面，反应0.8-1.2h。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明选用能与HER-2进行特异性识别的多肽通过自组装结合在金电极的表面，由于多肽分子中含有巯基，该巯基能与金电极通过Au-S键进行自组装，将多肽组装到金电极表面，该多肽可以特异性捕获目标分子HER-2蛋白，免除了现有检测方法中繁琐的修饰一抗步骤，并且该方法选择性好。

(2)本方法可测浓度为0.01ng/mL-5ng/mL的HER-2，而人类正常细胞中HER-2的浓度为2-15ng/mL，乳腺癌患者中HER-2浓度高达15-75ng/mL，本发明的方法对经过稀释后的乳腺癌患者血清具有足够的检测灵敏度。

(3)本发明采用能与HER-2进行特异性识别的适配体对经过HER-2修饰后的金电极再次进行修饰，用该适配体代替传统检测方法中的二抗，该适配体在本检测方法中不仅作为HER-2的目标识别探针分子，而且作为电化学信号探针分子，使得该检测方法操作更加简单，成本更低。

(4)本发明的检测方法检测范围宽，无需借助精密仪器设备，并且可推广至其他适配体传感器，用于对不同蛋白或小分子的浓度进行检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的检测方法的原理示意图。

图2为实施例1中不同浓度HER-2修饰后的金电极的方波伏安曲线。

图3为实施例1中不同浓度HER-2修饰后的金电极对应的标准曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本发明人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法的一种实施例，其原理示意图如图1所示。该检测方法具体包括以下步骤：

(1)金电极预处理：先将多根金电极用粒径为0.3μm的抛光粉打磨5min，然后用粒径为0.05μm的抛光粉进行二次抛光，抛光后的金电极先用二次水(经过两次蒸馏后的水)清洗，再用无水乙醇超声2min，然后用二次水超声2min，确认金电极表面无残余抛光粉后取出金电极用二次水进行冲洗，然后用氮气吹干，得多根经过预处理的金电极。

(2)多肽自组装：将多根经过预处理的金电极倒置插入装有100μL，浓度为10μg/mL的序列为CKLRLEWNR的多肽溶液的离心管中，保证每根金电极都垂直插入溶液中且与溶液充分接触，固定之后在37℃条件下反应12h进行自组装，自组装完成后冲洗掉金电极表面未组装上的多肽，然后将经过自组装后的金电极倒置插入装有1mmol/L巯基己醇的离心管中，37℃条件下封闭0.5h，封闭完后洗去金电极表面多余的巯基己醇，得到多根组装有多肽的金电极。

(3)金电极修饰：取浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL和5ng/mL的HER-2分别滴加至多根组装有多肽的金电极表面进行反应1h，反应完后进行冲洗，然后将序列为GCAGCGGTGTGGGG的适配体以12000rpm的转速离心处理2min，用二次水溶解，得到适配体溶液，再将所得适配体溶液滴加到金电极表面，反应1h，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到多根修饰后的金电极。

(4)生成磷钼酸盐沉淀：取5μL浓度为1mmol/L的钼酸钠溶液分别滴加在上述多根修饰后的金电极表面，42℃下反应30min，生成磷钼酸钠沉淀，得到多根待测金电极。

(5)做标准曲线：以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V范围内，以15Hz的频率，用方波伏安法分别对多根待测金电极进行测定，得到多条方波伏安曲线，然后以各方波伏安曲线中的峰电流为纵坐标，以对应的HER-2浓度为横坐标做标准曲线。其中，不同浓度HER-2修饰后的金电极的方波伏安曲线如图2所示；不同浓度HER-2修饰后的金电极对应的标准曲线图如图3所示，由图3可见，该标准曲线为一条直线，HER-2的浓度与对应方波伏安曲线中的峰电流值成正比。

(6)待测HER-2金电极修饰：取未知浓度的待测HER-2滴加至步骤(2)所得组装有多肽的金电极表面进行反应1h，反应完后进行冲洗，然后将序列为GCAGCGGTGTGGGG的适配体以12000rpm的转速离心处理2min，用二次水溶解，得到适配体溶液，再将所得适配体溶液滴加到金电极表面，反应1h，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到未知浓度HER-2修饰后的金电极。

(7)待测HER-2金电极生成磷钼酸盐沉淀：将钼酸钠溶液滴加在上述未知浓度HER-2修饰后的金电极表面进行反应生成磷钼酸钠沉淀，得到未知浓度HER-2待测金电极。

(8)测得HER-2浓度：以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V范围内，以15Hz的频率，用方波伏安法对上述未知浓度HER-2待测金电极进行测定，得到方波伏安曲线，然后将该方波伏安曲线中的峰电流与步骤(5)所得标准曲线进行对照，即测得未知浓度的待测HER-2的浓度，该待测HER-2的浓度即为标准曲线中测得的峰电流值对应的横坐标浓度值。

实施例2

本发明人类表皮生长因子受体-2浓度的检测方法的一种实施例，其原理示意图如图1所示。该检测方法具体包括以下步骤：

(1)金电极预处理：先将多根金电极用粒径为0.3μm的抛光粉打磨6min，然后用粒径为0.05μm的抛光粉进行二次抛光，抛光后的金电极先用二次水(经过两次蒸馏后的水)清洗，再用无水乙醇超声3min，然后用二次水超声3min，确认金电极表面无残余抛光粉后取出金电极用二次水进行冲洗，然后用氮气吹干，得多根经过预处理的金电极。

(2)多肽自组装：将多根经过预处理的金电极倒置插入装有100μL，浓度为12μg/mL的序列为CKLRLEWNR的多肽溶液的离心管中，保证每根金电极都垂直插入溶液中且与溶液充分接触，固定之后在42℃条件下反应8h进行自组装，自组装完成后冲洗掉金电极表面未组装上的多肽，然后将经过自组装后的金电极倒置插入装有1.2mmol/L巯基己醇的离心管中，42℃条件下封闭0.6h，封闭完后洗去金电极表面多余的巯基己醇，得到多根组装有多肽的金电极。

(3)金电极修饰：取浓度为0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL和5ng/mL的HER-2分别滴加至多根组装有多肽的金电极表面进行反应1.2h，反应完后进行冲洗，然后将序列为GCAGCGGTGTGGGG的适配体以14000rpm的转速离心处理3min，用二次水溶解，得到适配体溶液，再将所得适配体溶液滴加到金电极表面，反应1.2h，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到多根修饰后的金电极。

(4)生成磷钼酸盐沉淀：取5μL浓度为5mmol/L的钼酸钾溶液滴加在上述修饰后的金电极表面，42℃下反应60min，生成磷钼酸钾沉淀，得到多根待测金电极。

(5)做标准曲线：以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V范围内，以15Hz的频率，用方波伏安法分别对多根待测金电极进行测定，得到多条方波伏安曲线，然后以各方波伏安曲线中的峰电流为纵坐标，以对应的HER-2浓度为横坐标做标准曲线。

(6)待测HER-2金电极修饰：取未知浓度的待测HER-2滴加至步骤(2)所得组装有多肽的金电极表面进行反应1.2h，反应完后进行冲洗，然后将序列为GCAGCGGTGTGGGG的适配体以14000rpm的转速离心处理3min，用二次水溶解，得到适配体溶液，再将所得适配体溶液滴加到金电极表面，反应1.2h，反应完后冲洗掉未反应的适配体，得到未知浓度HER-2修饰后的金电极。

(7)待测HER-2金电极生成磷钼酸盐沉淀：将钼酸钾溶液滴加在上述未知浓度HER-2修饰后的金电极表面进行反应生成磷钼酸钾沉淀，得到未知浓度HER-2待测金电极。

(8)测得HER-2浓度：以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V范围内，以15Hz的频率，用方波伏安法对上述未知浓度HER-2待测金电极进行测定，得到方波伏安曲线，然后将该方波伏安曲线中的峰电流与步骤(5)所得标准曲线进行对照，即测得未知浓度的待测HER-2的浓度，该待测HER-2的浓度即为标准曲线中测得的峰电流值对应的横坐标浓度值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。