一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法

摘要

本发明涉及一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。该方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(190.1±46.7)×108个(n＝12)，细胞扩增达182.5±46.8倍；其中，CD3+细胞约占98.55％±2.24％，CD3+CD8+细胞约占76.11％±6.88％，CD3+CD4+细胞约占24.09％±6.73％，CD3+CD56+细胞约占53.36％±9.47％，而CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞仅占2.87％±1.65％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达60.57％±5.34％(4h51Cr释放法，效/靶＝40：1)；与不对凝块进行处理时相比，本发明可使收获的TIL细胞数量多出约30％。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是在肿瘤组织或肿瘤区域淋巴结中存在的一个异质性淋巴细胞群，包括被肿瘤抗原预活化的CD3⁺CD4⁺Th细胞(T>+CD8⁺CTL细胞(cytotoxic>+CD4⁺或CD3⁺CD8⁺T细胞；少量的CD3^-CD56⁺NK细胞(natural>+CD25⁺FoxP3⁺Tregs(regulatory>

在美国国立卫生研究院癌症研究所进行的一项临床研究中[Rosenberg SA,etal.Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastaticmelanoma using T-cell transfer immunotherapy.Clinical Cancer Research，2011，17(13)：4550-4557]，从手术切除或活检取得的恶性黑色素瘤组织或其区域淋巴结中分离并大量扩增制备TIL细胞，然后联合淋巴预清除方案将其过继输注晚期恶性黑色素瘤患者体内，治疗有效率(CR+PR)高达52％，CR患者最长缓解期超过82个月；在治疗有效的病例中，客观的肿瘤消退几乎发生在所有的转移病灶中，如脑、肺、肝、骨、淋巴结、皮下组织等。这表明，TIL细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有巨大的临床应用潜力。

但是，从肿瘤组织或区域淋巴结中分离制备TIL细胞，需经历手术切块的剪切、酶解以及细胞分离、培养筛选、大规模扩增等一系列繁琐、漫长过程；同时，复杂的体外操作使TIL细胞面临非常高的污染风险，极易导致培养失败；而且，绝大多数晚期肿瘤患者并不具备手术条件，无法从手术切块获得TIL细胞；有的患者虽能实施手术或进行活检，但获取的肿瘤组织通常太少，难于从中扩增出足量的TIL细胞，无法满足临床治疗的需要。所以，通过肿瘤组织获取TIL细胞进行过继输注抗肿瘤治疗在临床实施过程中面临诸多难于克服的困难。

肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌或卵巢癌等患者常因肿瘤胸腹腔转移而出现恶性胸腹水，大量临床研究证据表明恶性胸腹水中存在肿瘤抗原反应性TIL细胞，具有潜在的提取利用价值。然而，恶性胸腹水中存在一个由Tregs、iDCs以及IL-10、TGF-β、VEGF等细胞因子构成的免疫抑制性微环境；同时，作为免疫逃逸的一个重要机制，肿瘤细胞通常低表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子，无法有效递呈各类肿瘤抗原，造成肿瘤反应性TIL细胞活化不足，或不同的肿瘤反应性T淋巴细胞克隆活化不均衡、数量稀少且普遍存在功能缺陷。

一方面，从恶性胸腹水中提取制备TIL细胞进行过继输注抗肿瘤治疗时，输注细胞中肿瘤特异性TIL细胞的比例、数量以及参杂的Tregs细胞的数量均是影响临床疗效的重要因素。中国专利文献CN104946589A利用PD-1、LAG-3或TIM-3的抗体包被磁珠对恶性胸/腹水中分离的单个核细胞进行筛选，然后用OKT3和IL-2刺激筛选细胞扩增，该法不能解决因肿瘤细胞低表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子和免疫抑制性微环境的存在而造成的恶性胸/腹水中肿瘤特异性TIL细胞活化不足、数量稀少的问题，难于筛选出高丰度的肿瘤特异性TIL细胞；况且，由于Tregs及其他肿瘤抗原非特异性TIL细胞上也有PD-1、LAG-3或TIM-3等分子表达，它们也会随着免疫磁珠而进入到筛选细胞中并得到大量扩增，会影响到培养终产品中肿瘤特异性TIL细胞的纯度及抗瘤效果。至于另外一些TIL细胞制备方法，例如中国专利文献CN103468641A和CN1560234A，利用非特异活化剂如抗OX-40或OKT3、PHA、IL-2等刺激胸腹水中淋巴细胞的增殖，导致在扩增得到的TIL细胞中，除了含有肿瘤抗原特异性的CD3⁺CD4⁺Th1细胞和CD3⁺CD8⁺CTLs细胞外，还含有大量的肿瘤抗原非特异性的CD3⁺CD4⁺或CD3⁺CD8⁺T细胞、NK细胞以及具有免疫抑制作用的Tregs细胞，收获的TIL细胞对患者肿瘤细胞的杀伤效率低，难于持续地、高效地在患者体内发挥抗肿瘤作用。

另一方面，由于恶性胸腹水为组织渗出液、含有高浓度纤维蛋白原，导致极易发生凝固，所以在采集时需要加入足量肝素钠或EDTA-K2进行抗凝。然而，有些恶性胸腹水在离体时即已发生凝固，表现为在新鲜引流液中可见大小不一的纤维凝块。抗凝剂对于抑制恶性胸腹水离体后的凝固具有一定作用，但却无法消除已经形成的凝块。另外，有些恶性胸腹水(尤其是血性恶性胸腹水)，虽已经过充分地抗凝处理，未发现任何凝固迹象，但在其离心后形成的细胞沉淀中仍会出现不易解离的凝块。大量研究表明，恶性胸腹水的凝块中含有大量TIL细胞。在进行密度梯度离心时，这些凝块会干扰分层，影响单个核细胞的分离；同时，由于凝块由于随红细胞、粒细胞等高比重细胞成分一起沉于离心管管底、导致被舍弃，这可能造成TIL细胞的大量丢失。

然而，现有技术中未见利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的报道。

因此，研究利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法具有重要意义。

发明内容

为此，本发明提供一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集含凝块的恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为11.0～16.5U/mL；

(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离：将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤，使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于AIM-V完全培养基-Ⅰ中在适宜的条件下培养3～5天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，离心；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶～3.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，并培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液至少1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。

优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集含凝块的恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为12.5～15.0U/mL；

(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离：将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤，使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于AIM-V完全培养基-Ⅰ中在适宜的条件下培养3～5天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶～3.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶～2.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。

优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(3)凝块的分解与游离细胞的释放和步骤(6)TIL细胞的定向诱导活化中，所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有IFN-γ、IL-2和灭活血清；

所述步骤(7)TIL细胞的优势扩增中，所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有IL-2、IFN-γ、抗CD3单克隆抗体和灭活血清。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集含凝块的恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为12.5～15.0U/mL；

(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离：将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤，使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于AIM-V完全培养基-Ⅰ中在适宜的条件下培养3～5天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，离心；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为2.2×10⁶个/mL，在适宜的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.5×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离中，利用微孔过滤器将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，所述微孔过滤器的孔径为70μm，所述微孔过滤器为尼龙微孔过滤器。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(3)凝块的分解与游离细胞的释放和步骤(6)TIL细胞的定向诱导活化中，所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有500～1000U/mL IFN-γ、10～100U/mL IL-2和3％灭活血清；

所述步骤(7)TIL细胞的优势扩增中，所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有500～2000U/mL IL-2、100～300U/mL IFN-γ、20～50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(4)单个核细胞的分离中，用AIM-V无血清培养基、RPMI1640无血清培养基或PBS缓冲液将沉淀细胞重悬。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(5)单个核细胞的洗涤中，所述单个核细胞为淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞的混合物。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(5)单个核细胞的洗涤中，还包括重复至少一次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，混匀，离心，弃去上清液。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(8)TIL细胞的收集中，所述0.9％NaCl混合溶液含有IL-2、人血Alb和葡萄糖。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，

所述步骤(8)TIL细胞的收集中，所述0.9％NaCl混合溶液含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖。

进一步优选地，本发明上述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，所述步骤(3)凝块的分解与游离细胞的释放、步骤(6)TIL细胞的定向诱导活化和步骤(7)TIL细胞的优势扩增中，所述适宜的条件是指：37℃、5％CO₂和饱和湿度。

本发明还提供上述方法制备得到的TIL细胞。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：

(1)本发明所述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，通过先将将含凝块的恶性胸腹水进行过滤，然后将过滤得到的凝块在适宜的条件下进行培养、过滤，从而可以分离到更多的单个核细胞，进而显著提高制备的TIL细胞的数量，然后在诱导肿瘤细胞和DC细胞上调表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子、增强肿瘤抗原递呈的基础上，使恶性胸腹水中新鲜分离的肿瘤反应性淋巴细胞首先经历特异活化、克隆扩增的过程，然后再利用特定的细胞因子组合刺激其大规模扩增，同时抑制Tregs细胞的活化与增殖，使最终得到的细胞产品中含有高比例的肿瘤特异性TIL细胞，从而确保所制备的TIL细胞对患者自体肿瘤细胞具有特异的、高效的杀伤活性；

(2)本发明所述利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(190.1±46.7)×10⁸个(n＝12)，细胞扩增达182.5±46.8倍；其中，CD3⁺细胞约占98.55％±2.24％，CD3⁺CD8⁺细胞约占76.11％±6.88％，CD3⁺CD4⁺细胞约占24.09％±6.73％，CD3⁺CD56⁺细胞约占53.36％±9.47％，而CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞仅占2.87％±1.65％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达60.57％±5.34％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)；

(3)与不对凝块进行处理时相比，本发明可使收获的TIL细胞数量多出约30％。

具体实施方式

本发明以下实施例中，

AIM-V无血清培养基：GIBCO，批号：1678674；

Ficoll分层液：GE Healthcare，批号10024695；

IL-2：山东泉港药业，批号：201501005；

IFN-γ：上海凯茂生物医药，批号：G20150101；

抗CD3单克隆抗体：eBioscience，批号：E06305-1691；

人血Alb：四川远大药业，批号：201504045A。

实施例1

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌导致的1000mL含凝块的恶性胸水1000mL，并加入1.5万U肝素；

(2)含凝块的恶性胸水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将所述含凝块的恶性胸水进行过滤，使恶性胸水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有750U/mL IFN-γ、55U/mLIL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养3天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有750U/mL IFN-γ、55U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为85.7×10⁶个，调节细胞密度为2.2×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1250U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、35ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.5×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.62×10¹⁰个，共扩增189.0倍；其中，CD3⁺细胞占99.32％，CD3⁺CD8⁺细胞占77.56％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占3.42％；对肿瘤细胞的杀伤活性为66.84％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

实施例2

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性腹水的收集：无菌条件下，收集胃癌导致的含凝块的恶性腹水1200mL，并加入1.8万U肝素；

(2)含凝块的恶性腹水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将所述含凝块的恶性腹水进行过滤，使恶性腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有500U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养4天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有500U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为112.5×10⁶个，调节细胞密度为1.5×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养6天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第7天起，用含有500U/mL IL-2、300U/mL IFN-γ、50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第28天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.95×10¹⁰个，共扩增174.1倍；其中，CD3⁺细胞占97.34％，CD3⁺CD8⁺细胞占79.10％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占3.44％；对肿瘤细胞的杀伤活性为61.18％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

实施例3

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌所导致的含凝块的恶性胸水1000mL，并加入1.5万U肝素；

(2)含凝块的恶性胸水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将所述含凝块的恶性胸水进行过滤，使恶性胸水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有500U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、10U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为86.6×10⁶个，调节细胞密度为3.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养4天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第5天起，用含有2000U/mL IL-2、100U/mL IFN-γ、20ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为2.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为2.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.78×10¹⁰个，共扩增205.5倍；其中，CD3⁺细胞占96.54％，CD3⁺CD8⁺细胞占75.22％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占3.28％；对肿瘤细胞的杀伤活性为60.07％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

实施例4

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性腹水的收集：无菌条件下，收集结肠癌导致的含凝块的恶性腹水1500mL，并加入2万U肝素；

(2)含凝块的恶性腹水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将所述含凝块的恶性腹水进行过滤，使恶性腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为136.8×10⁶个，调节细胞密度为3.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1000U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、25ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为3.27×10¹⁰个，共扩增239.0倍；其中，CD3⁺细胞占99.52％，CD3⁺CD8⁺细胞占81.49％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占2.02％；对肿瘤细胞的杀伤活性为68.83％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

实施例5

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌导致的含凝块的恶性胸水700mL，并加入1万U肝素；

(2)含凝块的恶性胸水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将所述含凝块的恶性胸水进行过滤，使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养3天，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为75.6×10⁶个，调节细胞密度为3.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有2000U/mL IL-2、300U/mL IFN-γ、50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.66×10¹⁰个，共扩增219.6倍；其中，CD3⁺细胞占99.33％，CD3⁺CD8⁺细胞占74.64％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占3.38％；对肿瘤细胞的杀伤活性为58.26％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

实施例6

本实施例利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：

(1)含凝块的恶性胸水的收集：无菌条件下，收集乳腺癌导致的含凝块的恶性胸水1000mL，并加入1.5U肝素；

(2)含凝块的恶性胸水中游离细胞与凝块的分离：利用孔径为70μm的尼龙微孔过滤器将将所述含凝块的恶性胸水进行过滤，使恶性胸水中的凝块与游离细胞分离，得游离细胞-A；

(3)凝块的分解与游离细胞的释放：将所述凝块置于含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ中在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养4天，过滤，得游离细胞-B；

(4)单个核细胞的分离：将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；

(5)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；

(6)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，细胞计数总量为65.4×10⁶个，调节细胞密度为3.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；

(7)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1000U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、25ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×10⁶个/mL，在37℃、5％CO₂和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×10⁶个/mL；

(8)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。

通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.28×10¹⁰个，共扩增195.7倍；其中，CD3⁺细胞占97.12％，CD3⁺CD8⁺细胞占78.87％，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞占1.64％；对肿瘤细胞的杀伤活性为67.82％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1)。

对比例1

收集2000mL含凝块的恶性胸腹水，均分为2份，1000mL/份，一份不对凝块进行特殊处理，直接进行单个核细胞的分离(对照组，n＝12)；另一份按实施例6的实验方法进行操作(实验组，n＝12)；然后，实验组和对照组均将分离得到的单个核细胞均悬浮于含IL-2、IFN-γ和抗CD3单克隆抗体的AIM-V培养基中，在相同的条件进行单个核细胞的洗涤、TIL细胞的定向诱导活化、TIL细胞的优势扩增和TIL细胞的收集。

通过检测可知，实验组制备得到的TIL细胞数量比对照组多出约30％[(190.1±46.7)×10⁸vs(144.4±38.2)×10⁸；p＜0.01；t检验]；而且，与对照组相比，实验组制备得到的TIL细胞和对照组制备得到的TIL细胞具有相同的肿瘤细胞杀伤活性(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40:1；靶细胞溶解率：60.57％±5.34％vs>

综上，本发明利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(190.1±46.7)×10⁸个(n＝12)，细胞扩增达182.5±46.8倍；其中，CD3⁺细胞约占98.55％±2.24％，CD3⁺CD8⁺细胞约占76.11％±6.88％，CD3⁺CD4⁺细胞约占24.09％±6.73％，CD3⁺CD56⁺细胞约占53.36％±9.47％，而CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Tregs细胞仅占2.87％±1.65％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达60.57％±5.34％(4h⁵¹Cr释放法，效/靶＝40：1)；与不对凝块进行处理时相比，本发明可使收获的TIL细胞数量多出约30％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。