一种羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系及其在羊痘病毒分离培养和增殖中的用途

摘要

本发明公开了一种羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系及其在羊痘病毒分离培养和增殖中的用途。本发明的细胞系是通过对羔羊睾丸原代细胞进行分离和纯化得到羔羊睾丸支持细胞后，经过自然传代得到的一种羔羊睾丸支持自然传代细胞系。研究发现，该细胞系对于接种羊痘病毒较为敏感，用该细胞系所增殖的病毒滴度较新生羊睾丸原代细胞、Vero细胞以及BHK21细胞分别高约1.5、2.5以及2.3个病毒滴度。利用该细胞系分离羊痘病毒可保证病毒的均一、稳定，同时可防止因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其他病原的风险。此外，利用该传代细胞系制备疫苗简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，并且保证了疫苗质量稳定，对疫苗规模化生产具有一定的现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于羊痘病毒增殖和疫苗制备的传代细胞系及其制备方法和应用，特别涉及一种通过自然传代得到的可以传代的羔羊睾丸支持细胞系及利用该细胞系增殖培养羊痘病毒方法。本发明属于兽用疫苗制备技术领域。

背景技术

羊痘病毒(Capripox virus,CPV)是最重要的动物痘病毒，在分类地位上属于痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)中的羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员，包括山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheep poxvirus,SPPV)和牛结节疹病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类传染病。其发病率可达75％以上，死亡率可达50％以上，羔羊死亡率可达100％，同时还可导致母羊流产。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘。后来，陆续在世界其他地区报道了该病。该病广泛分布于非洲、中东、印度次大陆、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等，特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、孟加拉、尼伯尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病的流行。近几年我国的江苏、广东、贵州、山东、浙江、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病流行。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降，活畜及畜产品贸易停滞，给养羊业的发展造成极大的经济损失。

对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以高效扩繁该病毒的细胞(系、株)是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。要预防羊痘在国内泛滥和流行，免疫接种羊痘疫苗是预防羊痘唯一行之有效的措施。羊痘病毒(GTPV、SPPV)可在羊睾丸原代细胞、肾细胞、BHK₂₁和Vero细胞上生长，并产生细胞病变(CPE)，但是病毒滴度较低，尤其传代细胞(如BHK₂₁、Vero细胞)制备的病毒液达不到制备疫苗所需的病毒滴度。在国内，羊痘弱毒苗都采用新生羊睾丸原代细胞生产，其制造工艺复杂、落后，繁殖羊痘弱毒抗原必须用新生羊睾丸原代细胞，但制备这种细胞程序复杂，生产成本过高，生产效率较低下，这就给疫苗厂规模化生产羊痘疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊痘弱毒抗原所用的新生羊睾丸品种不一，这就很难使所生产的弱毒疫苗的质量保持稳定，此外，新生羊睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此，研发一种适于羊痘病毒增殖的传代细胞系，对疫苗企业具有一定的现实意义。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明提出了一种用于羊痘病毒分离培养和增殖，且同时能够用于羊痘疫苗制备的细胞系，该细胞系是通过对羔羊睾丸原代细胞进行分离和纯化后，经过自然传代得到的一种羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。

在本发明中，优选的，所述的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系为羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，分类命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120，保藏时间为2016年6月3日。

本发明的一种用于羊痘病毒分离培养和增殖的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系是通过以下步骤制备得到的：

(1)羔羊睾丸组织收集、处理及消化；

(2)分离、纯化羔羊睾丸支持细胞；

(3)羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)的建立。

其中，步骤(1)中羔羊睾丸组织来自健康母羊所生的1月龄公羔羊；健康母羊，口蹄疫、布氏杆菌病、结核，检测为阴性；羔羊屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75％酒精消毒)置恒温箱内，2小时内送回实验室。无菌分离睾丸实质用混合酶消化法制备细胞悬液。

其中，步骤(2)中分离纯化羔羊睾丸支持细胞所用方法为：将步骤(1)制备的细胞悬液按细胞浓度1～5×10⁵/ml分装到细胞瓶，进行反复差速贴壁法结合高温培养法进行分离纯化羔羊睾丸支持细胞。

其中，步骤(2)中羔羊睾丸支持细胞分离纯化培养所用的培养液为DMEM/F-12细胞培养液加2～10％胎牛血清，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调PH至7.0～7.2。

步骤(3)建立的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，是用步骤(2)分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的睾丸支持细胞的第3到13代)的传代细胞，该传代细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(羔羊睾丸支持细胞LSC)。

其中，步骤(3)建立的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(羔羊睾丸支持细胞LSC)，可有限传代约30代其生长特性不改变。

进一步的，本发明还提出了所述的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系在用于羊痘病毒分离培养和增殖中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种制备羊痘疫苗的方法，包括使用本发明所述的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系培养和增殖羊痘病毒的步骤。

再进一步的，本发明还提出了一种羊痘病毒的培养方法，包括以下步骤：

(1)选生长良好布满单层的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的5-15％接种羊痘病毒液，吸附10-30分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养；

(2)培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后，用Reed-Muench法测定病毒毒价，即可得到羊痘病毒液；

其中，所述的细胞系为羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120。

本发明通过试验发现，所获得的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)，对接种羊痘病毒较为敏感，用该细胞系所增殖的病毒滴度较采用羔羊睾丸原代细胞高约1.5个病毒滴度；比Vero细胞高2.5个病毒滴度；比BHK₂₁细胞高2.3个病毒滴度。利用该细胞系分离羊痘病毒(GTPV或SPPV)可以保证病毒的均一、稳定，同时可以避免因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其他病原的风险。同时利用该传代细胞系制备疫苗，可简化生产工艺、缩短生产周期，降低生产成本，同时还保证了制备得到的羊痘疫苗的质量保持稳定，因此，本发明的提出对羊痘疫苗的规模化生产具有一定的现实意义。

附图说明

图1为37℃、38.5℃和39.5℃条件下羔羊睾丸原代细胞体外生长曲线；

图2为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的体外培养；

A:消化后培养0小时的支持细胞；B:培养2h的支持细胞；C:培养12h的支持细胞；D:培养72h的支持细胞；E:培养2h的自然传代LSC；F:培养72h的自然传代LSC；

图3为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的鉴定。

A.分离纯化培养的第3代支持细胞HE染色；B.自然传代第10代LSC细胞HE染色；C.分离纯化培养的第3代支持细胞FasL蛋白检测；D.分离纯化培养的第三代支持细胞FasL蛋白检测结果；E.自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测；F.自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[实施例1]羊睾丸支持细胞的分离、培养及鉴定

1.1羊睾丸原代细胞的制备

选健康母羊(体质健康且口蹄疫、布氏杆菌、结核检测为阴性)所生的健康公羔羊，屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75％酒精消毒)，恒温箱内，2小时内送回实验室。用眼科镊子和剪刀将睾丸实质剪切成约1mm×3mm的小块，在D-hanks液中轻轻吹打数次，去除上清，将小组织块放入50mL离心管中加入10倍体积的含0.1wt％IV型胶原酶(GIBCO)、0.25wt％胰酶(GIBCO)的消化液4℃消化12h或过夜，用等体积含10％(v/v)新生牛血清(GIBCO)的DMEM培养液(HyClone)终止消化。用吸管柔和吹打数次后，用200目铜网过滤。收集消化液1000r/min离心10min，弃上清，用无血清DMEM培养液漂洗2次，弃上清，加入含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。

1.2不同培养条件下羊睾丸原代细胞生长曲线测定

将1.1节中制备的羊睾丸原代细胞悬液以1-2×10⁶个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。

将上述制备的新生羊睾丸支持细胞(第三代)以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于6块24孔板中，分别置于37℃、38.5℃和39.5℃5％CO₂、饱和湿度条件下培养(不同温度各培养2块)，试验自接种起，每隔24h各取3个孔细胞，贴壁支持细胞数目计数，取平均值，连续10d。测定不同培养温度条件下支持细胞的生长情况。优化最佳纯化培养温度和羊睾丸支持细胞差速贴壁纯化培养条件。

1.3羔羊睾丸支持细胞的分离、纯化培养

将1.1节中制备的细胞悬液以1-2×10⁶个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。然后进行细胞鉴定。

1.4羔羊睾丸支持细胞的鉴定

将1.3节中分离、纯化培养的支持细胞细胞系进行HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定。

免疫组化方法如下：将培养3d的支持细胞用4％多聚甲醛溶液固定10min，PBS漂洗3次×5min，山羊血清室温下封闭孵育20min，加入兔抗大鼠FasL多克隆抗体(abcam公司，1∶100稀释)一抗混合工作液，37℃孵育3h，PBS漂洗3次，加入FITC标记山羊抗兔IgG(abcam公司，1∶50稀释)二抗混合工作液37℃孵育30min，PBS漂洗3次，荧光显微镜下随机选择10个视野，绿色荧光下观察FasL染色结果。计算每视野中FasL阳性细胞和细胞总数，计算阳性细胞百分比，得到支持细胞的纯度。

1.5羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系的建立

1.3节中分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养(每孔培养细胞小于5个)，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的睾丸支持细胞的第3到13代)。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。将该细胞HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定；同时对该细胞系进行进一步传代试验，跟踪其传代培养特性。

1.6结果

试验发现，37℃和38.5℃培养条件下，羔羊睾丸原代细胞潜伏期均为2天，之后进入对数生长期；而39.5℃培养条件下的羔羊睾丸原代细胞潜伏期比37℃和38.52培养条件下的短，提前进入对数生长期；随培养温度的升高，对数生长期细胞增殖速率增大；原代接种5天后,37℃组、38.5℃组和39.5℃组支持细胞进入平台期，但39.5℃组支持细胞平台期维持约1天，之后迅速进入退化衰亡期；38.5℃组平台期维持约4天，之后进入衰亡期；而37℃组测定时间区间内一直处于平台期(图1)。在羔羊睾丸原代细胞中数量最多的是睾丸支持细胞，因此，该曲线也可说明在不同温度条件下羊睾丸支持细胞的生长特性。由此证明，纯化羔羊睾丸支持细胞的最佳温度为38.5℃。

经38.5℃高温培养结合6h差速贴壁，进过三代纯化后得到的支持细胞，刚接种细胞为圆点状，折光性强(图2A)；培养2h开始贴壁(图2B)，伸出突起，胞质开始铺展；培养6h后完全贴壁，培养12h后即可进入增殖期，细胞增殖较快，胞质开始扩张，形态呈现多变形状(图2C)；培养24h后，可见胞体较大、呈长柱状贴壁生长、两侧有多个突起、折光性较强的细胞，此即睾丸支持细胞。培养48h后，睾丸支持细胞体积进一步增大，呈膜状生长于瓶壁,细胞相互连接成网状，胞核清晰可见，位于胞体的中央或稍偏位。睾丸支持细胞的折光性随培养时间的延长而降低，圆型的细胞贴壁数量逐渐减少，睾丸支持细胞占细胞总数的95％以上，亦有少量成纤维细胞生长；3-4d后，长满瓶壁，形成单层细胞(图2D)。分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，培养2h开始贴壁(图2E)，72h长满单层(图2F)，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(图2D)，该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。

经HE染色，分离纯化的支持细胞和自然传代培养的LSC，两者形态基本一致(图3A，3B)，其大多呈卵圆形，胞质完全铺开，染色呈红色，而细胞核染色较深，呈蓝色，形状呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位，核仁明显，间接免疫荧光检测睾丸支持细胞和自然传代培养的LSC均高表达FasL蛋白，均可看到绿色荧光，支持细胞阳性率达到95％以上(图3C-F)。

由上证明，用分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，进一步传代培养，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC。该细胞系已于2016年6月3日送交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2016120。

[实施例2]羊痘病毒的增殖

羊痘病毒可在牛、绵羊、山羊源的组织细胞上生长，其中原代或次代羔羊睾丸细胞(LT)和羔羊肾细胞(LK)最为敏感；病料接种细胞后最早可在感染后3d出现少量细胞病变效应(CPE),之后4-6天CPE迅速扩展到整个细胞层，观察是否出现CPE最多持续到14d。典型的CPE为细胞变圆、细胞聚集呈束状结构、细胞收缩或膨胀、细胞核空泡化、染色质片段化、细胞单层失去连贯性、细胞浆中出现包涵体(Adl a等，1971；Joshi等，1994)。除此之外，羊痘病毒也可以在BHK-21细胞和Vero细胞上增殖。一些毒株还能在胎牛肌肉细胞、犊牛肾细胞和牛肾上皮(MDBK)细胞系中生长。

因此，本发明人选用Vero细胞、BHK-21细胞、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)五种细胞接种同一毒株、同一代次的羊传染性脓疱病毒进行平行对比，来比较这三种细胞对该病毒的增值情况。同时，将分离纯化培养的新生牛睾丸支持细胞进行传代培养，进一步研究该细胞系的传代培养特性及利用该细胞系增殖病毒的特性。

2.1羊痘病毒对Vero细胞、BHK-21细胞、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞(LSC)敏感性试验

将生长良好铺满单层的BHK-21细胞、Vero细胞上增殖、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)各三瓶(营养液体积为10ml)，倾去营养液，按原营养液体积的10％接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株(保藏号：CCTCC NO.V201503，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，该毒株已记载在申请号为201510030082.9，发明名称为“一种山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途”的专利申请中。)制苗弱毒1ml/瓶，另外一瓶做对照。病毒吸附30分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养，培养40～72h，逐日观察细胞的生长和细胞病变(Cytopathic>50/0.1ml。结果见表1所示：

表1三种细胞对GTPV病毒的敏感性试验结果

试验发现，Vero细胞在接种病毒后60h出现细胞即呈现折光性增强、变圆、聚堆等细胞病变(Cytopathic effect,CPE)，后期细胞发生皱缩，甚至脱落，CPE达到75％以上，需要140h；BHK₂₁细胞出现CPE在72h左右，CPE达到75％以上，需要144h；羔羊牛睾丸原代细胞和羔羊睾丸支持细胞出现细胞病变(Cytopathic>50/0.1ml。结果发现：Vero细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为2.0；BHK₂₁细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为2.2；羔羊睾丸原代细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为3.0；羔羊睾丸支持细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为4.50；本发明的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为4.50。

以上实验证明，本发明的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)与分离纯化的睾丸支持细胞对羊痘病毒在试验所选五株细胞中最为敏感，且病毒增殖效率最高，病毒滴度比试验和生产常用的羔羊睾丸原代细胞高1.5个滴度，同时比采用BHK21、Vero传代细胞系分别高2.3和2.5个滴度。

2.2羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)的传代及其对GTPV的增殖试验

用分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，用有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的LSC第3到13代)。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)。

将分离的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)继续传代(每代细胞都按1:2进行消化传代)，每隔5代细胞，将铺满单层细胞以1ml/瓶(25ml细胞瓶，营养液体积为10ml)接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株(保藏号：CCTCC NO：V201503)细胞毒液各两瓶，一瓶做对照，进行细胞传代试验，方法同2.1节。每个试验代次细胞统计生长时间(铺满单层)、接种病毒后病变时间、以及测定传代细胞接种病毒后收获病毒毒价，比较不同代次的传代细胞对GTPV增殖差异，结果见表2。

表2自然传代分离的羔羊睾丸支持细胞系(LSC)生长特性及病毒增殖情况

由上表可以看出，羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)继续传代可以传代30代以上，其生长特性维持不变，细胞长满单层时间维持在65h左右，并且随着传代次数的增加，其对GTPV病毒增殖能力维持不变，致细胞病变(CPE)时间及最后CPE达到75％以上收获病毒所需时间差异不大，基本维持在65～70h以内；接种同一代次的GTPV病毒，其毒价基本维持在4.20-4.60。结果说明，该分离的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)在传代30代时，其生长性能及其对病毒的增殖效率均维持在良好状态。由此可以证明，该细胞系生物学特性比较稳定，该细胞系无论对于分离培养羊痘病毒，还是生产羊痘疫苗来说都是比较好的细胞系。