大豆转录因子GmbZIP336及其编码基因在调控种子粒重中的应用

摘要

本发明公开了大豆转录因子GmbZIP336及其编码基因在调控种子粒重中的应用。本发明将GmbZIP336基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥籽粒的千粒重显著高于野生型拟南芥，表明GmbZIP336蛋白对种子粒重呈正调控作用，其编码基因GmbZIP336的过量表达，可提高转基因植株种子重量，并且其在提高转基因植株种子重量的同时，不影响植株的正常生长。通过实验证明：本发明提供的GmbZIP336蛋白可作为提高植物种子产量的目的基因，在植物育种方面具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆转录因子GmbZIP336及其编码基因在调控种子粒重中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

大豆是重要传统作物，蕴含丰富营养价值，是提供粮油和饲料的重要经济作物，在工业生产中大豆油也有很多用途，例如生物燃料，表面活性剂，软化剂等。中国曾是世界最大的大豆生产国，然而，近年来，我国大豆生产只占需求的三分之一，致使中国成为全球最大的大豆进口国，进口总额为全球大豆总出口量的一半。大豆生产远远落后于国内其他粮食作物发展的步伐，不能满足国民需要。近50年来，大豆生产仅增长了62％，而其他粮食作物已增长了5倍以上。因此提高大豆单产已成为目前亟待解决的问题。

种子的重量(粒重)在作物生产中的一个重要指标，是影响作物产量的重要农艺性状之一。植物可以通过增加种子粒重来达到增产的目的。千粒重是以克表示的一千粒种子的重量，它是体现种子大小与饱满程度的一项指标，是检验种子质量和作物考种的内容，也是田间预测产量时的重要依据。一般测定小粒种子千粒重时是随机数出三个一千粒种子，分别称重，求其平均值。大粒种子可取三个一百粒分别称重，取其平均值，称百粒重。一般认为，种子粒重是数量性状，由多个基因决定。

大豆产量由株型、结荚率、荚粒数、种子百粒重等因素组成,其中粒重是遗传力最高的因素。粒重对产量的影响不限于豆科植物，对其它单双子叶植物也是产量潜力的重要因素，因此成为作物品种选育过程中要考虑的重要选择性状。已有的研究表明，种子粒重受栽培环境和遗传的影响。在正常的栽培条件下，遗传，也即相关基因起重要作用。因此与千粒重相关的分子机制的研究成为热点。在水稻、小麦、玉米、谷子、大豆等作物中，应用重组自交系群体，在基因组上已经定位和精细定位了与种子重量相关的QTL位点，包括主效基因位点。近年来，国内外报道了一些对大豆百粒重的QTL的定位。SoyBase数据库公布已经定位了近100个QTL位点。

大豆起源于我国。种子重量和形状是野生大豆进化栽培大豆的过程中，受到驯化的主要形状之一。野生大豆的百粒重仅2克，而栽培大豆的百粒重约15克，呈显著差异。已有的研究表明，大豆种子大小和形状是稳定遗传且相互独立的性状。大豆种子大小和形状与百粒重相关，然而，对于产量相关的种子性状描述，还是以种子粒重，百粒重/千粒重，最为贴切。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物种子的粒重。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了GmbZIP336蛋白的用途。

本发明提供了GmbZIP336蛋白在调控植物种子粒重中的应用。

本发明所提供的GmbZIP336蛋白在调控植物种子粒重中的应用中，所述GmbZIP336蛋白为a)或b)或c)：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物种子粒重调控相关的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由336个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述GmbZIP336蛋白相关的生物材料的用途。

本发明提供了与上述GmbZIP336蛋白相关的生物材料在调控植物种子粒重中的应用。

本发明所提供的与上述GmbZIP336蛋白相关的生物材料在调控植物种子粒重中的应用中；所述与上述GmbZIP336蛋白相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)编码上述GmbZIP336蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述GmbZIP336蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述GmbZIP336蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID No.1由1011个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmbZIP336的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmbZIP336的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmbZIP336蛋白且具有GmbZIP336蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序 列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，A2)所述的含有编码GmbZIP336蛋白的核酸分子的表达盒(GmbZIP336基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmbZIP336蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GmbZIP336基因转录的启动子，还可包括终止GmbZIP336基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述GmbZIP336基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工 或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控植物种子粒重为提高植物种子粒重。

上述应用中，所述植物可为种子植物；所述种子植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述单子叶植物可为玉米；所述大豆可为大豆Williams 82等品种。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育粒重提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育粒重提高的转基因植物的方法包括将上述GmbZIP336蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物种子粒重高于所述受体植物。

上述方法中，所述GmbZIP336蛋白的编码基因的编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子。

上述方法中，所述植物可为种子植物；所述种子植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科 植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述单子叶植物可为玉米；所述大豆可为大豆Williams 82等品种。

在本发明的实施例中，所述GmbZIP336蛋白的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有GmbZIP336基因表达盒的GmbZIP336基因重组表达载体导入所述受体植物中。

上述方法中，其中所述GmbZIP336基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmbZIP336基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GmbZIP336基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmbZIP336基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码上述GmbZIP336蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对。

本发明的实验证明：将GmbZIP336基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥籽粒的千粒重显著高于野生型拟南芥，表明GmbZIP336蛋白对种子粒重呈正调控作用，其编码基因GmbZIP336的过量表达，可提高转基因植株种子重量，并且其在提高转基因植株种子重量的同时，不影响植株的正常生长。因此该基因可作为提高植物种子产量的目的基因。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为大豆种子发育过程中的7个阶段。

图2为克隆载体和植物表达载体pGWB411-GmbZIP336示意图。其中A为载体8/GW/TOPO示意图；B为pGWB411-GmbZIP336部分示意图。

图3为GmbZIP336基因在种子发育过程中的相对表达量。

图4为转GmbZIP336拟南芥的分子鉴定。其中，8、20和33均为T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系；对照为野生型拟南芥植株。

图5为转GmbZIP336拟南芥和野生型种子千粒重比较。其中，8、20和33均为T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系；对照为野生型拟南芥植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体pGWB411在文献“Tsuyoshi Nakagawa，et al.,Development of Series of Gateway Binary Vectors pGWBs,for Realizing Efficient Construction of Fusion Genes for Plant Transformation,JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING,2007,Vol.104,No.1,34–41.”中公开过，由日本岛根大学Tsuyoshi Nakagawa博士(E.mail:tnakagaw@life.shimane-u.ac.jp)提供，公众经Tsuyoshi Nakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大豆Williams 82在文献“Scott A Jackson,et al.Genome sequence of the palaeopolyploid soybean,Nature，2010，Vol.463，178-183”中公开过，由美国普渡大学Scott Jackson教授馈赠，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌GV3101在文献“Lee CW,et al.Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)在文献“Kim H,Hyun Y,Park J,Park M,Kim M,Kim H,Lee M,Moon J,Lee I,Kim J.A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验。

实施例1、 GmbZIP336基因在大豆不同发育过程的表达分析

1、以大豆Williams 82种子重量为标准(具体标准为发育中种子占饱满但尚没脱水种子的重量百分比)，将大豆发育过程分成7个阶段，7个阶段对应的重量百分比分别是4％、8％、12％、16％、24％、48％、96％(图1)。对种子发育阶段3(12％)和5(24％)两个阶段的转录组进行了测序比对，获得了在第6阶段高表达的转录因子，其中包括Glyma13g39340，经与数据库比对，将其命名为GmbZIP336基因。

2、分别提取大豆种子发育各个发育阶段的RNA，反转录获得cDNA；以cDNA为模板，采用F和R进行Real Time-PCR，检测GmbZIP336基因的表达量，以大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。引物序列如下：

F：5’-GGTCCTCCTGAAGTGGTAGTAG；

R：5’-GCCTCCTCATTGCCCTCAA；

Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT；

Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。

结果如图3所示：在苗、叶和荚中均难以检测到GmbZIP336基因的表达，在种子发育过程中，阶段2、3、4、5、6和7的相对表达量分别约为：15.5、18.5、8.2、23.2、43.8和32.8。阶段2和3的表达水平虽有起伏，但总体上变化不太大，阶段4时明显下降，而至阶段5明显上升，阶段6时继续上升至峰值，之后至阶段7下降，但仍显著高于阶段5。上述结果表明GmbZIP336基因是种子发育阶段特异表达的基因。

实施例2、转GmbZIP336拟南芥的获得及其表型分析

一、利用Gateway技术构建过表达载体

1、GmbZIP336基因的获得

提取大豆Williams 82幼苗的总RNA，并反转录获得cDNA；以cDNA为模板，用GmbZIP336-up和GmbZIP336-dp为引物，进行PCR扩增，得到GmbZIP336基因。引物序列如下：

GmbZIP336-up：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTCTCCAACAACCAAATCAA-3’(序列3)；

GmbZIP336-dp：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCCAGGATGCGCTTAGAGGCCTCC-3’(序列4)。

2、按TA试剂盒(Invitogen公司产品，产品目录号为12536-017)说明书自带操作步骤将上述得到的GmbZIP336基因和入门载体8/GW/TOPO(TA试剂盒中自带)进行BP重组反应，得到BP反应产物。

3、将上述得到的2.5μl BP反应产物加入50μl TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为入门克隆(entry clone)，该入门克隆中的质粒为入门质粒，将该入门质粒命名为8/GW/TOPO-GmbZIP336(如图2中A所示)，将入门质粒送测序，测序结果表明该入门质粒含有SEQ ID No.1所示的DNA分子。

4、将上述8/GW/TOPO-GmbZIP336和pGWB411进行LR重组反应，得到LR反应产物。

5、将上述得到的2.5μl LR反应产物加入50μl TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为pGWB411-GmbZIP336，并对其进行测序验证。

测序结果表明：pGWB411-GmbZIP336为将SEQ ID No.1所示的DNA分子重组到pGWB411载体上得到的载体。pGWB411-GmbZIP336为GmbZIP336基因表达载体，pGWB411-GmbZIP336含有GmbZIP336基因表达盒，GmbZIP336基因表达盒中，启动GmbZIP336基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子(图2中B)。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pGWB411-GmbZIP336用电击法转化根癌农杆菌GV3101，挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/pGWB411-GmbZIP336。

按上述方法，将重组质粒pGWB411-GmbZIP336替换为质粒pGWB411，其他步骤均相同，将得到重组农杆菌命名为GV3101/pGWB411。

三、转GmbZIP336拟南芥的获得及鉴定

1、将拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)种子均匀播种在MS培养基上，于4℃春化3天，然后置于22℃光照培养箱培养一周。待小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养，保湿2-3天，20-22℃。当拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花状态时，用培养至对数期的重组农杆菌GV3101/pGWB411-GmbZIP336侵染液转化拟南芥获得T₁代转pGWB411-GmbZIP336拟南芥种子。

将T₁代转pGWB411-GmbZIP336拟南芥种子，于37℃烘箱中烘干(6-8天)，然后4℃春化3天。将T₁代转pGWB411-GmbZIP336种子在含卡那霉素的MS培养基(卡那霉素在MS培养基中的浓度为50mg/L)上进行筛选，得到初筛阳性T₁代转GmbZIP336拟南芥幼苗。

提取上述初筛阳性T₁代转GmbZIP336拟南芥植株叶片总RNA，以反转录得到cDNA作为模板，以GmbZIP336基因引物F：5’-GGTCCTCCTGAAGTGGTAGTAG-3’和引物R：5’-GCCTCCTCATTGCCCTCAA-3’为引物进行实时定量PCR分析，得到GmbZIP336基因的相对表达量。内参是野生型拟南芥AtActin2基因，内参引物分别为AtActin2F：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’和AtActin2R：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。检测到有GmbZIP336基因表达的拟南芥即为T₁阳性转GmbZIP336拟南芥。用上述方法继续鉴定T₁阳性转GmbZIP336拟南芥的后代，获得16个T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系，选取三个T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系8、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系20和T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系33用于下述实施例分析。

按上述方法，将重组农杆菌pGWB411-GmbZIP336替换为重组农杆菌pGWB411，其他步骤均相同，得到T₃代纯合转空载体拟南芥。

2、以野生型拟南芥植株为对照，分别鉴定上述三个T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系8、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系20和T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系33和T₃代纯合转空载体拟南芥中目的基因的表达，鉴定引物和内参引物同步骤1。

结果如图4所示：野生型拟南芥和T₃代纯合转空载体拟南芥均未能检测出GmbZIP336基因的表达，三个T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系8、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系20和T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系33的GmbZIP336基因表达量分别为1.0±0.1、1.1±0.2和1.3±0.6。

四、转GmbZIP336拟南芥的表型分析

测量野生型拟南芥、三个T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系8、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系20和T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系33的籽粒千粒重(彻底干燥的籽粒千粒重)以及莲座和株高。每个株系取24株的籽粒，每个株系称量200粒种子，实验重复三次，结果取平均值±标准差。

结果如图5所示：野生型拟南芥、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系8、T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系20和T₃代纯合转GmbZIP336拟南芥株系33的籽粒千粒重分别为15.4±3、33.0±2、39.5±4和33.4±2毫克，以上结果表明三个转GmbZIP336拟南芥株系的籽粒千粒重显著高于野生型，且转在莲座和株高方面和野生型无显著差 异。

T₃代纯合转空载体拟南芥的表型与野生型无显著差异。