一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法，用甲醇超声处理待测样品并同时做空白溶液，用甲醇配制具有浓度梯度的混合标准工作溶液，其中沉香四醇的浓度范围为20～200μg/mL，苄基丙酮的浓度范围为0.5～5μg/mL，利用气相色谱‑质谱联用仪对标准工作溶液、空白溶液和样品溶液进行分析检测，得到相关色谱图，以样品溶液与标准工作溶液中目标物的保留时间和特征离子丰度比进行定性分析，以外标法进行定量分析，最后绘制标准曲线并计算结果。本发明操作快速，简单易行，目标物可同时测定等优点，适用于沉香中沉香四醇和苄基丙酮的测定。本发明方法灵敏度高，重复性好，回收率高。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法，属于检测方法技术领域。

【背景技术】

沉香为瑞香科植物沉香或白木香含有树脂的木材，主产于中国、日本、印度以及其他东南亚国家，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，主治胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症，是我国愈百种中成药的主要组方原料药材。除药用外，沉香还是名贵的天然香料和熏香原料，市场需求巨大。但在自然界中，只有当沉香属植物受到刺激或损伤时，才会产生沉香，结香过程往往需要几十年甚至上百年时间，随着生态环境破坏和沉香资源的过度采伐，沉香属植物资源日渐枯竭，现被列为国家二级保护野生植物，并载入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》，因此远远不能满足市场的需求，导致沉香价格逐年攀升。目前市售沉香药材良莠不齐，存在大量的沉香劣质品，甚至是伪品或白木香木材浸泡香料、涂炭后加工而成的假药以及有香味的树材如柏木等充代，严重影响医疗效果。

沉香中主要含有色酮类、芳香族类和倍半萜类等成分，有文献对125个沉香品、其他25种有香味的树材及健康的沉香树材进行检测，结果证明只有沉香中才能检测到色酮类成分沉香四醇和芳香族成分苄基丙酮。由此可知，沉香四醇和苄基丙酮是沉香的特征成分，其含量可作为沉香真伪鉴定和质量评价的重要依据。因此，2015年版《中国药典》规定沉香中沉香四醇含量不小于0.10％。

目前，测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮含量的方法分别为液相色谱法和气相色谱法，但尚无同时测定沉香中两种化合物的方法。虽然液相色谱法和气相色谱法具有较强的分离分析能力，但它们只能定量的测定产品中各个组分含量，对于快速、准确地定性鉴别却存在一定的局限性，且使用液相色谱分析溶剂消耗大，检测成本高。本发明采用气相色谱-串联质谱方法，能够同时准确、快速、方便地测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮含量。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种既能快速、准确定性鉴别,又能同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法。本发明方法采用气相色谱-质谱联用检测方法，具有操作简单，灵敏度高，重复性好，目标化合物同时测定的优点。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明所使用的测量仪器和设备为：气相色谱-质谱联用仪，超声波清洗机，电子天平。

一种同时测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、制备待测样品溶液：将沉香样品用超纯水洗净晾干，粉碎后过三号筛，准确称取0.3g于置于塞锥形瓶中，精确到0.0001g，精密加入甲醇12～15mL，称定重量，浸泡1h，频率40kHz，功率300W超声处理50min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，离心，静置，取上层清液即得样品溶液，待测，同时做空白溶液；

b、制备标准工作溶液：用甲醇配制具有浓度梯度的沉香四醇和具有浓度梯度的苄基丙酮混合标准工作溶液，其中沉香四醇的浓度范围为20～200μg/mL，苄基丙酮的浓度范围为0.5～5μg/mL；

c、气相色谱-质谱分析：利用气相色谱-质谱联用仪对标准工作溶液、空白溶液和样品溶液进行分析检测，得到相关色谱图，以样品溶液与标准工作溶液中目标物的保留时间和特征离子丰度比进行定性分析，以外标法进行定量分析；

其中所述的气相色谱-质谱条件为：

色谱柱：HP-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；进样方式：不分流进样，进样口温度：250℃；载气：He，99.999％，柱流量1.2mL/min；柱温采用程序升温：初始温度40℃，保持1min，以10℃/min升至210℃，保持1min，再以2℃/min升至220℃，保持1min，再以8℃/min升至300℃，保持4min；进样量：1μL；

质谱条件为：离子源温度：250℃；电离模式：电子轰击电离；质谱传输线温度280℃；溶剂延迟时间3.0min；

扫描方式:选择性离子监测扫描(SIM)，对每个离子的监控时间为50ms；

d.绘制标准曲线及结果计算：将标准工作溶液引入气相色谱-质谱联用仪，以外标法进行定量分析，将目标化合物定量离子的峰面积与目标化合物的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程，相关系数需不小于0.999；对制备的样品溶液进行测定，测得样品溶液中目标化合物的峰面积，代入一元线性回归方程得到样品溶液中目标化合物的含量，再根据以下计算公式(1)和计算公式(2)换算分别求得样品中沉香四醇和苄基丙酮的含量：

计算公式(1)为：

$X_1=\frac{(C-C_0)\times V}{M\times 10000}\mathrm{...}\left(1\right)$

计算公式(2)为：

$X_2=\frac{(C-C_0)\times V}{M}\mathrm{...}\left(2\right)$

式中：

X₁——样品中沉香四醇的含量，单位为％；

X₂——样品中苄基丙酮的含量，单位为mg/kg；

C——样品溶液中目标化合物的浓度，单位为μg/mL；

C₀——空白溶液中目标化合物的浓度，单位为μg/mL；

V——样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；

M——样品称取的质量，单位为g。

根据公式计算时，以两次平行测定结果的平均值为最终测定结果，结果保留3位有效三数字。

本发明所针对的沉香包括进口沉香、国产沉香和采用人工结香技术生产的沉香。

本发明在制备标准工作溶液时，沉香四醇的梯度浓度为20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL，苄基丙酮的梯度浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。具体制备方法为：

准确称取0.1g苄基丙酮标准品，精确至0.1mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1mg/mL的苄基丙酮标准储备液Ⅰ；准确称取0.02g沉香四醇标准品，精确至0.1mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，同时准确移取0.500mL苄基丙酮标准储备液Ⅰ置于同一10mL容量瓶中并定容，配制成混合标准储备液Ⅱ，其中沉香四醇和苄基丙酮的浓度分别为2mg/mL和50μg/mL；准确移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的混合标准储备液Ⅱ，分别置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得标准工作溶液。

本发明中，选择性离子监测扫描时，沉香四醇和苄基丙酮定量、定性离子及其丰度比见下表1：

表1：沉香四醇和苄基丙酮定量及定性选择离子表

本发明在绘制标准曲线及结果计算中，样品中目标化合物和标准品的选择离子色谱峰在相同保留时间处(±0.5％)出现，并且对应质谱碎片离子的质荷比与标准品一致，其丰度比与标准品相比应符合：

相对丰度＞50％时，允许±10％偏差；

相对丰度20％～50％时，允许±15％偏差；

相对丰度10％～20％时，允许±20％偏差；

相对丰度≤10％时，允许±50％偏差；此时可确证目标分析物。

本发明比较了超声和加热回流二种提取方式，结果表明以甲醇为提取溶剂，超声50min提取的目标物含量和加热回流5h提取的目标物含量基本一致。超声提取方法快速高效，且可在常温操作，故选择超声提取方式。

本发明在待测样品溶液的制备过程中选择甲醇作为提取溶剂，与乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、环己烷、无水乙醚、石油醚相比，甲醇的提取效率最优。故优选甲醇作为提取溶剂。

本发明考察了样品破碎度对测定结果的影响，结果表明当粒径小于三号筛后，减小粒径，样品中目标化合物的测定结果无显著变化，且测定结果的相对标准偏差小于5％，样品均匀性能够满足本发明的测定要求。因此，本发明优选样品前处理时过三号筛。

本发明在待测样品溶液的制备过程中考察了溶剂用量对测定结果的影响，结果表明在溶剂用量为12～15mL的情况下，提取效率较好，再增加溶剂用量，提取效率变化不大。故从节约成本的角度考虑选择溶剂用量为12～15mL。

本发明在待测样品溶液的制备过程中考察了提取时间对测定结果的影响，结果表明提取时间超过50min，提取效率相差不大。故从节约时间的角度考虑选择提取时间为50min。

本发明选择了适宜的标准工作溶液范围，适用于沉香中沉香四醇和苄基丙酮的测定。

本发明在气相色谱-质谱分析过程中，为了获得更佳的分离效果，并且避免其它组分对苄基丙酮和沉香四醇造成干扰，经多次调试优化，选择了210℃前和220℃后升温较快，210℃～220℃之间升温较慢的升温程序进行检测。

本发明中，首先通过全扫描方式(SCAN)获得苄基丙酮和沉香四醇标准品的保留时间和全扫描谱图，再分别提取苄基丙酮和沉香四醇的质谱图，并结合质谱图碎片离子的相关信息，确定目标化合物的定性定量离子。

与现有技术相比，本发明有如下优点：

本发明提供了一种气相色谱-质谱联用测定沉香中沉香四醇和苄基丙酮的方法，该检测方法具有操作快速，简单易行，目标物可同时测定等优点，适用于沉香中沉香四醇和苄基丙酮的测定。

本发明为了得到合适的前处理条件，对提取方式、提取溶剂、样品破碎度、溶剂用量和提取时间进行优化和选择，并采用能同时给出定性和定量信息的气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)作为检测仪器，对沉香样品中的沉香四醇和苄基丙酮进行测定，结果表明标准曲线线形关系良好，沉香四醇的检出限为80mg/kg，相对标准偏差为3.47％，平均加标回收率在92.6％～97.5％之间，苄基丙酮的检出限为2mg/kg，相对标准偏差为4.04％，平均加标回收率在之间94.7％～103％，这表明本方法灵敏度高，重复性好，回收率高。

【附图说明】

图1是标准工作溶液的色谱图；

图2是空白溶液的色谱图；

图3是样品溶液的色谱图；

图4是标准工作溶液的全扫描色谱图；

图5是沉香四醇提取离子质谱图；

图6是苄基丙酮提取离子质谱图。

【具体实施方式】

以下结合具体实施方式对本发明做进一步更详细的说明。

实施例1：

主要仪器和试剂：

TSQ Quantum XLS系列气相色谱-质谱联用仪及其工作站(美国赛默飞世尔公司)；UA22MFD超声波清洗机(中国WIGGENS公司)；SIGMA 2-16K台式离心机(德国sartoriussigma公司)；CP 225D型电子天平(感量：0.0001g，北京赛多利斯公司)。

沉香四醇标准品(96.8％，中国食品药品检定研究院)，苄基丙酮标准品(98.0％，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、环己烷、无水乙醚、石油醚(色谱醇，德国Merck公司)。所有用水均为超纯水(电阻率小于18.2μs/cm)。

制备待测样品溶液：

将沉香样品用超纯水洗净晾干，粉碎后过三号筛，准确称取0.3g置于具塞锥形瓶中，精确到0.0001g。精密加入甲醇15mL，称定重量，浸泡1h，超声处理(频率40kHz，功率300W)50min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，离心，静置，取上层清液即得样品溶液，待测，同时做空白试验。

制备标准工作溶液：

准确称取0.1020g苄基丙酮标准品，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1mg/mL的苄基丙酮标准储备液Ⅰ；准确称取0.0207g沉香四醇标准品，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，同时准确移取0.500mL苄基丙酮标准储备液Ⅰ置于同一10mL容量瓶中并定容，配制成混合标准储备液Ⅱ，其中沉香四醇和苄基丙酮的浓度分别为2mg/mL和50μg/mL；准确移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的混合标准储备液Ⅱ，置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得标准工作溶液，其中沉香四醇的梯度浓度为20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL，苄基丙酮的梯度浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。

气相色谱-质谱分析：

利用气相色谱-质谱联用仪对标准工作溶液、空白溶液和样品溶液进行分析检测，得到相关色谱图，见图1、图2和图3，图中横坐标表示保留时间，纵坐标表示响应值。以样品溶液与标准工作溶液中目标物的保留时间和特征离子丰度比进行定性分析，以外标法进行定量分析，所述的气相色谱-质谱条件为：

色谱柱：HP-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；进样方式：不分流进样，进样口温度：250℃；载气：He，99.999％，柱流量1.2mL/min；柱温采用程序升温：初始温度40℃，保持1min，以10℃/min升至210℃，保持1min，再以2℃/min升至220℃，保持1min，再以8℃/min升至300℃，保持4min；进样量：1μL；

质谱条件为：离子源温度：250℃；电离模式：电子轰击电离；质谱传输线温度280℃；溶剂延迟时间3.0min；

扫描方式为选择离子监测扫描(SIM)，其中沉香四醇和苄基丙酮定量、定性离子及其丰度比见表1，对每个离子的监控时间为50ms。

绘制标准曲线并计算结果：

将标准工作溶液引入气相色谱-质谱联用仪，以外标法进行定量分析，将目标化合物的峰面积与目标化合物的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程，相关系数需不小于0.999；对制备的样品溶液进行测定，测得样品溶液中目标化合物的峰面积，代入一元线性回归方程得到样品溶液中目标化合物的含量，根据以下计算公式(1)和计算公式(2)换算分别求得样品中沉香四醇和苄基丙酮的含量：

计算公式(1)为：

$X_1=\frac{(C-C_0)\times V}{M\times 10000}\mathrm{...}\left(1\right)$

计算公式(2)为：

$X_2=\frac{(C-C_0)\times V}{M}\mathrm{...}\left(2\right)$

式中：

X₁——样品中沉香四醇的含量，单位为％；

X₂——样品中苄基丙酮的含量，单位为mg/kg；

C——样品溶液中目标化合物的浓度，单位为μg/mL；

C₀——空白溶液中目标化合物的浓度，单位为μg/mL；

V——样品溶液定容体积，单位为mL；

M——样品称取的质量，单位为g；

以两次平行测定结果的平均值为最终测定结果，结果保留3位有效三数字。

本发明方法的线性范围，检出限和定量限：

将标准工作溶液引入气相色谱-质谱联用仪，以外标法进行定量分析，将目标化合物的峰面积与目标化合物的浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性范围、回归方程、相关系数，另根据标准工作溶液进样后各组分定量离子的谱图，同时结合样品溶液谱图，再以三倍信噪比(S/N＝3)计算检出限，经计算评估得出苄基丙酮和沉香四醇的检出限。结果见表2。

表2：线性范围、回归方程、相关系数及检出限

本发明方法精密度和回收率试验：

平行称取沉香样品7份，按上述方法进行7次独立试验，测量结果的相对标准偏差(RSD)即为方法精密度，沉香四醇和苄基丙酮的RSD分别为3.47％和4.04％。另平行称取可沉香样品9份，分别进行高、中、低3个浓度水平的加标回收试验，目标化合物的平均回收率在92.6％～103％之间，其结果列于表3。

表3：方法精密度和回收率

前处理条件的优化和选择：

一、为了得到合适的前处理条件，对提取方式、提取溶剂、样品破碎度、溶剂用量和提取时间进行优化和选择。

1.提取方式的优化和选择：

本发明比较了超声和加热回流二种提取方式，结果表明以甲醇为提取溶剂，超声50min提取的目标化合物含量和加热回流5h提取的目标物测定值基本一致。因超声提取方法快速高效，且可在常温操作，故选择超声提取方式，详见表4。

表4：提取方式的优化和选择

2.提取溶剂的优化和选择：

本发明分别用甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、环己烷、无水乙醚和石油醚作为提取溶剂，对样品进行检测。测定结果表明，甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯对沉香四醇的提取效率明显高于丙酮、乙腈、环己烷、无水乙醚和石油醚，且当选择甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取溶剂时，沉香四醇的测定结果无明显差异；甲醇和丙酮对苄基丙酮的提取效率明显高于乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、环己烷、无水乙醚和石油醚，且当选择甲醇和丙酮作为提取溶剂时，苄基丙酮的测定结果无明显差异。因此，优选甲醇作为本发明的提取溶剂。详见表5。

表5：提取溶剂的优化和选择

注:：“ND”表示目标化合物未检出。

3.样品破碎度的优化和选择：

将沉香样品粉碎，分别过一号筛、二号筛、三号筛、四号筛后，按上述方法进行检测。从表6可知，当粒径大于三号筛时，测定结果的相对标准偏差(RSD)过大，检测结果的重复性不能满足本发明的测定要求，而当粒径小于三号筛时，样品均匀性增加，测定结果的RSD小于5％，能够满足本发明的测定要求。当粒径小于三号筛时，对过三号筛、四号筛后的样品进行测定，目标化合物的测定结果无明显差异。因此，本发明优选样品前处理时过三号筛。

表6：样品粉碎度的优化和选择

4.溶剂用量的优化和选择：

本发明在沉香样品中分别精密加入甲醇6、9、12、15、18mL进行检测。测定结果表明，当甲醇用量超过9mL后，增加甲醇用量，沉香四醇的测定结果仍有增加，而苄基丙酮的测定结果无明显变化；当甲醇用量超过12mL后，增加甲醇用量，沉香四醇和苄基丙酮的测定结果均无明显变化，故从节约成本的角度考虑，选择溶剂用量为12～15mL。详见表7。

表7：溶剂用量的优化和选择

5.提取时间的优化和选择：

本发明在待测样品溶液的制备过程中，分别超声30、40、50、60、70min进行检测。测定结果表明，当提取时间超过40min后，增加提取时间，沉香四醇的测定结果仍有增加，而苄基丙酮的测定结果无明显变化；当提取时间超过50min后，增加提取时间，沉香四醇和苄基丙酮的测定结果均无明显变化，故从节约时间的角度考虑，选择提取时间为50min。详见表8。

表8：提取时间的优化和选择

二、气相色谱--质谱联用仪参数的优化和选择：

为了得到合适的气相色谱--质谱联用仪参数，对升温程序、定性离子及定量离子进行优化和选择。

1.升温程序优化：

实际样品检测时，当升温速度较快时，210℃左右有很多芳香族组分和倍半帖组分集中出峰，保留时间较接近，为了获得更佳的分离效果，并且避免其它组分对沉香四醇和苄基丙酮造成干扰，经多次调试优化，本发明选择了210℃前和220℃后升温较快，210℃～220℃之间升温较慢的升温程序进行检测。

2.定性定量离子的优化和选择：

本发明中，首先通过全扫描方式(SCAN)获得沉香四醇和苄基丙酮的全扫描谱图，见图4，图中横坐标表示保留时间，纵坐标表示响应值；再分别提取苄基丙酮和沉香四醇的质谱图，分别见图5和图6，图中横坐标表示质量数，纵坐标表示丰度。根据质谱图中的碎片离子选择丰度相对较高、质量数较大以及干扰少的特征离子碎片，最终确定目标化合物的定性定量离子，见表1。

实施例2：

根据实施例1所述的测定方法，对10批市售沉香样品进行检测，其沉香四醇和苄基丙酮的含量见表9。由表9可知，样品溶液中沉香四醇和苄基丙酮的含量在本发明选择的标准工作曲线范围内，标准工作溶液适用于沉香中沉香四醇和苄基丙酮的测定。

表9：10批沉香样品中沉香四醇和苄基丙酮的含量