3,6‑二芳基‑1H‑吡唑并5,1‑c1,2,4三氮唑类化合物作为肿瘤细胞增殖抑制剂的用途

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及一种3,6‑二芳基‑1

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑类化合物及其用途，确切地说，涉及该类化合物作为肿瘤细胞增殖抑制剂在制备抗肿瘤的药物方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康与生命的严重疾病，在中国为主要致死病因之一。寻找和发现治疗与预防肿瘤的新药是当前世界的热点研究方向。

Combretastatin A-4(CA-4)是从南非柳树中分离得到的顺式二苯乙烯类天然产物，其化学名称为(Z)-2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)苯酚。CA-4为微管蛋白聚合抑制剂，呈现很强的抑制肿瘤细胞增殖活性，由于其水溶性差，现已制成前药CA-4磷酸酯盐(CA-4P)，并以进入三期临床试验研究阶段。以CA-4为先导化合物进行抗肿瘤活性研究目前已经有大量报道，但是大多数合成的新化合物存在活性不够突出或毒性较大或合成比较困难等缺点。五元杂环并六元杂环类化合物作为CA-4类似物已有文献报道，具有代表性的化合物结构如下所示。(相关报道参见：Lu Y.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2009,52,1701；Chen J.J.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2010,53,7414；Xiao M.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2013,56,3318；Romagnoli R.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2011,54,5144；Lu Y.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2014,57,7355；Hwang D.J.,et al.ACS Medicinal Chemistry Letter,2015,6,993.)

本发明涉及的五元杂环并五元杂环即3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑类化合物作为抗肿瘤活性化合物的研究目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于设计、合成具有良好的肿瘤细胞增殖活性的Combretastatin A-4的结构类似物，即3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑类化合物的CA-4类似物；所制备的化合物在体内外抗肿瘤活性测试中显现良好的结果。

本发明的目标产物可用结构通式I来表示：

本发明优选涉及定义如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄为C₁-C₆烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自独立地为氢、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₆烷基氨基、二C₁-C₆烷基氨基。

本发明优选涉及定义如下的通式I的化合物：

其中，通式I中R₂-R₄为C₁-C₄烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自独立地为氢、卤素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₄烷基氨基、二C₁-C₄烷基氨基。

本发明优选涉及定义如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄为C₁-C₃烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自独立地为氢、氟、氯、溴、碘、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₃烷基氨基、二C₁-C₃烷基氨基。

本发明优选涉及定义如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄为C₁-C₃烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自独立地为氢、氯、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷基氧基、硝基、氨基。

本发明优选涉及定义如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄为甲氧基，R₁、R₅、R₆各自独立地为氢、氯、甲基、甲氧基、硝基、氨基。

本发明的化合物还包括上述结构式所示衍生物所形成的在药学上可接受的 无毒盐及其水合物，这些药学上可接受的无毒盐包括该衍生物与酸所形成的盐。所述的酸可以为盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸的无机酸或选自乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、苹果酸的有机酸。所述水合物的结晶水数目为0～16中的任意实数。

本发明优选的部分化合物结构如下：

化合物1

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物2

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-氯苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物3

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物4

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4] 三氮唑

化合物5

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

发明的3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑类化合物可以按照以下反应路线合成得到：

将相应的取代的化合物A加入到茄型瓶中，用乙酸酐作溶剂反应2h，TLC检测原料消失后，将反应液倒入冰水中搅拌，析出的固体过滤干燥，然后将其用浓盐酸-乙醇体系回流；待反应完后，将乙醇蒸干，加乙酸乙酯，水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥后蒸干，得终产物B，收率69-84％。

其中，化合物中含有氨基的3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑类化合物可由相应的化合物中含有硝基的化合物经还原反应制备，还原剂为无水三氯化铁/水合肼/活性炭体系。

具体实施方式

通过下述实例将有助于理解本发明，但本发明的内容并不限于所举实例。

本发明所用试剂均为市售，所用微波型号为CEM-discover-sp,超声仪为KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，核磁共振谱由AVANCE-400、Bruker ARX-300、Bruker ARX-400、Bruker ARX-600傅立叶变换核磁共振波谱仪测定，质谱由Brukee Esqure 2000、Shimadzu GCMS-QP5050A型质谱仪测定。

实施例1：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4] 三氮唑(化合物1)的制备：

将3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-[1,2,4]三氮唑并[3,4-b][1,3,4]噻二嗪0.40g(1mmol)加入到50ml茄型瓶中，用乙酸酐作溶剂反应2h，TLC检测原料消失后，将反应液倒入冰水中搅拌，析出的固体过滤干燥，然后将其加入到50ml茄型瓶中，用20ml乙醇溶解，加1ml浓盐酸，回流反应2h；待反应完后，将乙醇蒸干，加乙酸乙酯，水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥后蒸干，色谱方法纯化，得化合物1；红棕色固体，收率：81％。M.p.:119-122℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.73(s,1H),7.88(s,2H),7.82(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.02(s,1H),4.01(s,6H),3.94(s,3H),2.40(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ160.1,153.4(2C),148.4,139.5,139.4,138.4,130.9,129.3(2C),126.0(2C),121.1,103.8(2C),75.0,60.9,56.2(2C),21.3；ESI-MS:m/z＝365.3[M+H]⁺,387.3[M+Na]⁺。

实施例2：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-氯苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物2)的制备：

除了使用相应的原料外，以实施例1相同的方法制备化合物2；红色固体，收率：82％。M.p.:150-151℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.65(s,1H),7.86(s,2H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),6.05(s,1H),4.02(s,6H),3.94(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ158.7,153.4(2C),148.4,139.7,139.4,134.3,132.3,128.8(2C),127.3(2C),120.9,103.8(2C),75.3,60.9,56.2(2C)；ESI-MS:m/z＝385.0[M+H]⁺,407.1[M+Na]⁺。

实施例3：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物3)的制备：

除了使用相应的原料外，以实施例1相同的方法制备化合物3；红色固体，收率：84％。M.p.:146-147℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.89(s,1H),7.87(s,2H),7.86(d,J＝8.7Hz,2H),6.97(d,J＝8.7Hz,2H),5.98(s,1H),4.01(s,6H),3.93(s,3H),3.86(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ159.9,159.8,153.4(2C),148.4,139.5,139.3,127.3(2C),126.5,121.2,114.0(2C),103.8(2C),74.6,60.9,56.2(2C),55.3；ESI-MS:m/z＝381.3[M+H]⁺。

实施例4：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并 [5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物4)的制备：

除了使用相应的原料外，以实施例1相同的方法制备化合物4；黄色固体，收率：76％。M.p.:149-151℃；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ13.23(s,1H),8.41(d,J＝2.0Hz,1H),8.25(dd,J＝8.8Hz,J＝2.0Hz,1H),7.80(s,2H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),6.50(s,1H),3.97(s,3H),3.93(s,6H),3.76(s,3H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ156.7,153.7(2C),152.3,149.2,139.9,139.4,137.8,131.7,126.9,122.3,121.5,115.2,103.6(2C),75.7,60.7,57.3,56.4(2C)；ESI-MS:m/z＝426.1[M+H]⁺,448.1[M+Na]⁺。

实施例5：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物5)的制备：

将0.26g(0.5mmol)化合物4加入到50mL茄型瓶中，加入活性炭20mg和三氯化铁20mg作催化剂，用无水乙醇作溶剂，搅拌下滴加80％水合肼0.1mL，回流反应3小时；TLC检测反应完毕后，过滤除去活性炭，将无水乙醇蒸干，加水，用乙酸乙酯萃取，将有机层合并干燥，减压蒸馏得到粗品，色谱分离得化合物5；红棕色固体，收率：69％。M.p.:135-137℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.86(s,1H),7.85(s,2H),7.31(s,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.95(s,1H),4.00(s,6H),3.92(s,3H),3.89(s,3H)；ESI-MS:m/z＝396.4[M+H]⁺。

实施例6：本发明的化合物的体外抗肿瘤活性测试

体外活性测试方法和结果如下：

其中，选用文献报道的CA-4和临床常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADM)为阳性对照实验组。

抗肿瘤活性体外筛选试验-1

筛选方法：四氮唑盐(micoculture tetrozolium,MTT)还原法

细胞株：人胃腺癌细胞株SGC-7901cell line

作用时间：72h

各化合物10μg/mL剂量下对肿瘤生长的抑制率(％)见表-1。

抗肿瘤活性体外筛选试验-2

筛选方法：四氮唑盐(micoculture tetrozolium,MTT)还原法

细胞株：人口腔上皮癌细胞株KB cell line

作用时间：72h

各化合物10μg/mL剂量下对肿瘤生长的抑制率(％)见表-1。

抗肿瘤活性体外筛选试验3

筛选方法：四氮唑盐(micoculture tetrozolium,MTT)还原法

细胞株：人纤维肉瘤细胞株HT-1080cell line

作用时间：72h

各化合物10μg/mL剂量下对肿瘤生长的抑制率(％)见表-1。

实施例7：本发明的化合物的动物体内抗肿瘤活性测试

选择体外活性较好的化合物2和化合物5进行了动物体内抗肿瘤活性测试，所用模型为小鼠S-180肉瘤模型，阳性对照药物为临床常用的抗肿瘤药物氟尿嘧啶(Fluorouracil)。

实验方法：选用18-22克雌性昆明小鼠及生长良好的7-11天的S-180瘤种，将瘤组织制成细胞悬液，接种至小鼠右侧腋部皮下，约1.0-2.0×10⁶细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔注射给药连续7天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按如下公式求出肿瘤抑制率并进行t检验。

肿瘤抑制率＝[(空白对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/(空白对照组平均瘤重)]×100％

实验结果见表-2。

实施例8：本发明的化合物的动物体内急性毒性初步测试

选择动物体内抗肿瘤活性较好的化合物2和化合物5进行了动物体内急性毒性测试。

选用18-22克雌性昆明小鼠各10只，分别腹腔注射给药化合物2、化合物5各500mg/kg后，出现自发运动抑制，扭体，并对体重增长、摄食量、摄水量的抑制，但未见小鼠死亡。停药数日后，存活动物恢复正常。腹腔给药的LD₅₀值大于500mg/kg。

表-1

表-2