一种提高辣椒体细胞胚发生频率的方法

摘要

本发明为一种提高辣椒体细胞胚发生频率的方法，包括种子的消毒与播种、无菌苗的获得、外植体的选择和愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、体细胞胚的继代与增值、体细胞胚的成熟步骤；外植体为子叶或下胚轴；从愈伤组织诱导到体细胞胚的成熟过程均在黑暗条件下进行。本发明缩短了辣椒体胚发生的时间，提高了体胚发生的量，从而改善了体胚的发生效率。为实现辣椒转基因研究、生物技术育种等奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于辣椒体细胞胚的发生领域，具体涉及一种提高辣椒体细胞胚发生频率的方法。

背景技术

辣椒是茄科辣椒属，一年或有限多年生草本植物，原产于墨西哥，是一种重要的蔬菜作物，在世界范围内普遍栽培。《纲目拾遗》记载：辣茄性热而散，亦能去水湿；《百草镜》亦指出辣椒可洗冻疮，浴冷疥，泻大肠经寒癖，具有一定的药用价值。

辣椒作为一种具有重要经济价值的作物，对水份要求严格，即不耐旱也不耐涝，部分性状有待改良。目前，辣椒主要通过有性生殖等方式进行繁殖，但传统的育种方法不能很好的满足许多遗传改良的需求。因此建立稳定高效的辣椒体细胞胚发生体系为利用细胞工程等现代技术进行辣椒遗传育种具有重要意义，如培养脱毒作物、保持母本遗传特征、为辣椒遗传转化或诱变育种选育新品种提供理想的受体体系等。目前，辣椒体细胞胚的发生还存在许多问题，主要为周期长、发生频率低、易玻璃化等，现有的胚诱导周期约为200d，且发生频率低于1％。

发明内容

为了克服现有辣椒体细胞胚发生的技术不足，本发明的目的在于提供一种周期短、不会出现玻璃化现象，特别是能在很大程度上提高辣椒体细胞胚发生频率的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种提高辣椒体细胞胚发生频率的方法，该方法包括消毒与播种、无菌苗的获得、外植体的选择和愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、体细胞胚的继代与增值、体细胞胚的成熟步骤；外植体为子叶或下胚轴；从愈伤组织诱导到体细胞胚的成熟过程均在黑暗条件下进行；

其中，无菌苗的获得过程中使用的MS₁培养基为：1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L；

外植体的选择和愈伤组织的诱导过程中使用的MS₂培养基为：MS+2，4-D>

体细胞胚的诱导过程中使用的MS₃培养基为：MS+2，4-D>

体细胞胚的继代与增值过程中使用的MS₄培养基为：MS+2，4-D>

体细胞胚的成熟过程中使用的MS₅培养基为：MS+ABA>

其中，MS为基础培养基，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸、Biotin为生物素。

本发明进一步包括以下优选的技术方案：

优选的方案中，所述无菌苗的获得过程中，将消毒种子置于超净工作台内，接种到pH值为5.6～5.8的MS₁培养基中，在25±2℃，8/16h光照条件下培养11～13d得到无菌苗。

优选的方案中，所述外植体的选择和愈伤组织的诱导过程中，在无菌操作条件下，将获得的无菌苗的子叶和下胚轴置于pH值为5.6～5.8的MS₂培养基中，在培养温度为25±2℃，黑暗条件下培养11～13d，得到愈伤组织。

优选的方案中，所述体细胞胚的诱导过程中，在无菌操作条件下，从得到的愈伤组织中挑选胚性愈伤组织，将愈伤组织与子叶和下胚轴切分，并转至pH值为5.2～5.4的MS₃培养基中诱导体细胞胚，在培养温度为25±2℃，黑暗条件下进行悬浮培养，得到悬浮细胞。

优选的方案中，所述体细胞胚的继代与增值过程中，在无菌操作条件下，将悬浮细胞每15d进行一次继代，悬浮细胞转移至pH值为5.6～5.8的MS₄培养基中，在培养温度为25±2℃，黑暗条件下培养，直到获得大量体细胞胚。

优选的方案中，所述体细胞胚的成熟过程中，在无菌操作条件下，将获得的体细胞胚转移至pH值为5.6～5.8的MS₅培养基中，在培养温度为25±2℃，黑暗条件下培养成熟。

优选的方案中，所述培养基MS₁培养基～MS₅培养基均使用0.5～1.0mol/L的NaOH水溶液调节pH值。

优选的方案中，所述培养基MS₁培养基～MS₅培养基中含VB₁，所述VB₁的浓度为10mg/L。

优选的方案中，所述半胱氨酸使用前，通过盐酸助溶。

优选的方案中，MS₄培养基中不含KNO₃，MS₄培养基和MS₅培养基中含NH₄NO₃，所述NH₄NO₃的浓度为10μM/L。

优选的方案中，所述体细胞胚的诱导过程中挑选淡黄色、表面有球状突起的胚性愈伤组织。

优选的方案中，生物素用50℃温水溶解，加入培养基前隔水加热使其溶解完全。

优选的方案中，所有悬浮培养均使用100mL锥形瓶，加入50mL培养液，摇床转速设为150rpm/min。

进一步优选所述外植体为子叶。

本发明的优点如下：

本发明通过对辣椒体细胞胚发生步骤、培养基以及培养方式进行综合改进，得到了一种周期短、不会出现玻璃化现象，特别是能在很大程度上提高辣椒体细胞胚发生频率的方法。

本发明从播种无菌苗到获得游离的体细胞胚仅需约60d的时间，且体细胞胚的诱导率(即发生频率)最高可达0.56个/mg。

在具体的实验过程中，本发明以子叶或下胚轴为外植体，在愈伤组织和体细胞胚的诱导阶段，分别加入半胱氨酸和L-脯氨酸，从愈伤组织诱导到体细胞胚的成熟过程中均在黑暗条件下进行，这些条件的综合控制与协同作用，不仅使实验操作较成熟合子胚简便，省略从种皮中剥离出合子胚的复杂步骤，且使胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导率分别提高了8％和21％，获得了意料之外的技术效果。而通过进一步通过在体细胞胚的继代与增值过程中利用现有的体细胞胚进行二次诱导，控制MS₄培养基的pH值为5.6～5.8，整体培养过程中无需加入KNO₃，体细胞胚的成熟在NH₄NO₃的浓度降低为10μM/L的培养基中进行，不仅有利于维持培养基的偏酸性环境，进一步缩短整个培养周期，有效提高体细胞胚的增值，提高了体细胞胚的诱导率和成熟率。本发明通过对各个步骤的优化还进一步减少了玻璃化现象。但本发明并不仅仅在于上述参数的控制和优化，发明人在具体的辣椒体细胞胚发生过程中，通过培养基、培养方式，以及其他条件和参数的配合，不断优化，最终才获得了本发明的协同增效的有益效果。

本发明为实现辣椒转基因研究、生物技术育种等奠定了基础。

附图说明

图1a为辣椒非胚性愈伤组织在解剖镜下拍摄照片；

图1b为辣椒胚性愈伤组织在解剖镜下拍摄照片；

图1c为辣椒游离体细胞胚在解剖镜下拍摄照片；

图2a为辣椒体细胞早期原胚固定、切片及番红-固绿染色后在显微镜下拍摄照片；

图2b为辣椒原胚胚固定、切片及番红-固绿染色后在显微镜下拍摄照片；

图2c为辣椒游离胚固定、切片及番红-固绿染色后在显微镜下拍摄照片；

具体实施方式

实施例1

(1)消毒与播种：取辣椒(樟树港)干燥种子，用0.1v/v％升汞消毒10min，无菌水冲洗5次，备用；

(2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的消毒种子置于超净工作台内，接种到pH值为5.8的MS₁培养基中，在25℃，8/16h光照条件下培养12d得到无菌苗；

(3)外植体的选择和愈伤组织的诱导：无菌操作条件下，将步骤(2)中无菌苗的子叶和下胚轴置于pH值为5.8的MS₂培养基中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养12d，得到愈伤组织；

(4)体细胞胚的诱导：无菌操作条件下，从步骤(3)中得到的愈伤组织中挑选胚性愈伤组织，将愈伤组织与子叶和下胚轴切分，并转至pH值为5.4的MS₃培养基诱导体细胞胚，在培养温度为25℃，黑暗条件下进行悬浮培养；

(5)体细胞胚的继代与增值：无菌操作条件下，将步骤(4)中的悬浮细胞每15d进行一次继代，悬浮细胞转移至pH值为5.8的MS₄，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养，直到获得大量体细胞胚。

(6)体细胞胚的成熟：无菌操作条件下，将步骤(5)中获得的体细胞胚转移至pH值为5.8的MS₅中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养成熟。

对比例1

(1)消毒与播种：取辣椒(樟树港)干燥种子，用0.1v/v％升汞消毒10min，无菌水冲洗5次，备用；

(2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的消毒种子置于超净工作台内，接种到pH值为5.8的MS₁培养基中，在25℃，8/16h光照条件下培养12d得到无菌苗；

(3)外植体的选择和愈伤组织的诱导：无菌操作条件下，将步骤(2)中无菌苗的子叶和下胚轴置于pH值为5.8且不含半胱氨酸，其他成分与实施例1相同的MS₂培养基中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养12d，得到的愈伤组织相对实施例1较少；

(4)体细胞胚的诱导：无菌操作条件下，从步骤(3)中得到的愈伤组织中挑选胚性愈伤组织，将愈伤组织与子叶和下胚轴切分，并转至pH值为5.4且不含半胱氨酸，其他成分与实施例1相同的MS₃培养基诱导体细胞胚，在培养温度为25℃，黑暗条件下进行悬浮培养，获得的体细胞胚相对实施例1较少；

(5)体细胞胚的继代与增值：无菌操作条件下，将步骤(4)中的悬浮细胞每15d进行一次继代，悬浮细胞转移至pH值为5.8且不含L-脯氨酸，其他成分与实施例1相同的的MS₄培养基，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养，直到获得体细胞胚相对实施例1较少。

(6)体细胞胚的成熟：无菌操作条件下，将(5)中获得的体细胞胚转移至pH值为5.8的MS₅中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养成熟。

对比例2

(1)消毒与播种：取辣椒(樟树港)干燥种子，用0.1v/v％升汞消毒10min，无菌水冲洗5次，备用；

(2)无菌苗的获得：将步骤(1)得到的消毒种子置于超净工作台内，接种到pH值为5.8的MS₁培养基中，在25℃，8/16h光照条件下培养12d得到无菌苗；

(3)外植体的选择和愈伤组织的诱导：无菌操作条件下，将步骤(2)中无菌苗的子叶和下胚轴置于pH值为5.8的MS₂培养基中，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养12d，得到愈伤组织；

(4)体细胞胚的诱导：无菌操作条件下，从步骤(3)中得到的愈伤组织中挑选胚性愈伤组织，将愈伤组织与子叶和下胚轴切分，转至pH值为5.4且加入0.5mol/L噻苯隆的MS培养基诱导体细胞胚，在培养温度为25℃，黑暗条件下进行悬浮培养；

(5)体细胞胚的继代与增值：无菌操作条件下，将步骤(4)中的悬浮细胞每15d进行一次继代，悬浮细胞转移至pH值为5.8且加入0.5mol/L噻苯隆的MS培养基，在培养温度为25℃，黑暗条件下培养。

注：悬浮细胞在pH值为5.8且加入0.5mol/L噻苯隆的MS培养基中逐渐褐化，不能诱导产生体细胞胚。

实施例2

配制愈伤组织诱导培养基，并称重，记为M₁；取两片子叶刚刚平展的幼苗，将其子叶和下胚轴分别切成长宽均为0.5cm左右的叶片及0.5cm长的茎段，置于MS₂中进行诱导，并称重，记为M₂；分别在第10、11、12、13、14和15d时称量培养基的重量M₃。则愈伤组织诱导率为：(M₃-M₂)÷(M₂-M₁)×100％；胚性愈伤组织的诱导率为：胚性愈伤组织块数÷愈伤组织块数×100％

表1 不同诱导时间对子叶和下胚轴愈伤组织诱导率的影响

注：虽然愈伤组织的诱导率随着诱导时间的延长而增加，但从12d开始胚性愈伤组织的诱导率开始下降，因此子叶和下胚轴的最佳诱导时间为11～13d。

配制愈伤组织诱导培养基，并称重，记为M₁；取10～15d的幼苗，将其子叶、下胚轴分别切成长宽约为0.5cm左右的叶片及0.5cm长的茎段，置于MS₂中进行诱导，并称重，记为M₂；诱导12d后称量培养基的重量M₃。则愈伤组织诱导率为：(M₃-M₂)÷(M₂-M₁)×100％；胚性愈伤组织的诱导率为：胚性愈伤组织块数÷愈伤组织块数×100％(以上实验需设置空白对照，且M₂和M₃均为去除空白对照后的相对数据)。

表2 不同苗龄的子叶和下胚轴对愈伤组织诱导率的影响

从上表可以看出，同等条件下，子叶比下胚轴的胚性愈伤组织诱导率高，且11～13d苗龄的子叶和下胚轴比较合适，其中12d苗龄最佳。10d苗龄的子叶和下胚轴在MS₂中出现坏死现象，即不能又诱导出愈伤组织，且随着苗龄的增加，胚性愈伤组织的诱导率逐渐下降。

实施例4

选择12d苗龄的子叶为外植体，在含不同浓度蔗糖的MS₂中诱导愈伤12d，每个浓度重复三次，计算胚性愈伤组织的诱导率；挑选质量相近的胚性愈伤组织10块(每块重量约10mg)，在含不同浓度蔗糖的MS₃中诱导体细胞胚，每个浓度重复三次，计算体细胞胚的诱导率，即每块愈伤诱导体细胞胚的数量；将数量相近的体细胞胚置于含不同浓度蔗糖的MS₄中扩增一个月，每个浓度重复三次，计算体细胞胚的扩增率，即相同时间内单个体细胞胚的扩增数量；将数量相近的体细胞胚置于含不同浓度蔗糖的MS₅中诱导成熟，每个浓度重复三次，计算体细胞胚的成熟率。(以上实验需设置空白对照，且M₂和M₃均为去除空白对照后的相对数据)

表3 不同蔗糖浓度对胚性愈伤组织诱导率、体细胞胚诱导率、体细胞胚扩增率和体细胞胚成熟率的影响

由上表可见，胚性愈伤组织、体细胞胚、体细胞胚扩增和体细胞胚成熟培养基的最佳蔗糖浓度分别为：30g/L、35g/L、40g/L和45g/L。

所涉及的MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐和改良有机成分的详细内容如下：

MS大量元素

备注：KN0₃和NH₄NO₃单独配成母液，方便使用，配置1000mL培养基时，吸取10×母液100mL。

MS微量元素

备注：配置1000mL培养基时，吸取100×母液10mL。

MS铁盐

备注：配置1000mL培养基时，吸取100×母液10mL。

改良MS有机成分

备注：考虑保存时间，肌醇临用时称量固体补加到工作液，不配在有机成分母液中，配置1000mL培养基时，吸取100×母液10mL。

本发明基于对近几年辣椒组织培养中热点研究的了解，发现辣椒属难于进行基因操作的植物，其主要原因是辣椒外植体再生性培养技术尚未过关，故提高辣椒体细胞胚发生效率的研究在为辣椒再生体系的研究奠定了基础的同时，也为实现辣椒转基因研究、生物技术育种提供了可能性，本发明体细胞胚的发生率最高可达0.56个/mg。此外，所得到的胚性愈伤组织、体细胞原胚和体细胞胚等还是进行遗传转化选育新品种的理想受体材料。

以上以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。