一种纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于聚半乳糖醛酸的纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法，是采用W/O/W双重乳化法进行制备，首先将聚半乳糖醛酸溶解于4～6w/v%泊洛沙姆188溶液中，再加入牛胰岛素进行溶解，得到内水相；然后以乙酸乙酯为油相，分别以18～22w/v%泊洛沙姆188溶液、溶解有壳聚糖的18～22w/v%泊洛沙姆188溶液、溶解有壳聚糖和京尼平的18～22w/v%泊洛沙姆188溶液为外水相溶液，制备得到不同的纳米口服蛋白质药物输运体系。本发明的纳米口服蛋白质药物输运体系无毒、易降解、输运效率高、吸收率高，在胰岛素等蛋白质药物口服输运研究与应用、糖尿病治疗、疫苗服用等领域具有较高的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域。更具体地，涉及一种纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法及其应用。

背景技术

随着生物医药研究的发展，越来越多的蛋白质药物得到开发。由于蛋白质药物的不稳定性，通常都采用注射的途径进入人体发挥治疗效果。然而，药物的注射会带来许多问题。例如，蛋白类疫苗的注射常施用于低龄儿童，引起的疼痛与反抗会导致药物注射剂量不准、增大感染概率等问题。胰岛素等蛋白质类激素药物需要频繁、长期注射，增加病人的痛苦、造成表皮局部坏死或增生，并增加感染概率，同时造成该类药物在外周血管的分布浓度过高，产生副作用。

为解决上述的这类问题，近年来，许多研究者借鉴纳米医学材料的研究成果，将蛋白质类药物装载于纳米材料中，通过口服途径给药，既能减少病人的不适，又能模拟蛋白质在体内的分布情况，最大化的降低因给药方式造成的副作用。口服纳米给药体系是应用纳米输运体系对药物的缓释与控释的作用，在消化道中保持蛋白质药物的活性，并在相应的环境下释放药物。目前在纳米材料口服输运蛋白质的研究主要致力于增加输运效率这一方面。可以将这类研究分为三类，防止消化酶降解，促进肠粘膜附着，促进穿透肠上皮。其中，促进粒子穿过肠上皮细胞的途径是许多研究致力攻克的问题，目前的成果主要分为四类，即通过M细胞进入系统循环，靶向通过Goblet细胞进入系统循环，通过胞吞作用进入肠上皮细胞，打开肠上皮细胞间的紧密连接，使粒子穿过细胞间隙进入系统循环。大量研究表明，壳聚糖(Chitosan，CS)由于带正电，有助于增加其肠粘膜的附着率，同时，又具有打开肠上皮细胞间紧密连接的作用，可以增加输运体系的肠上皮透过性。因此，许多口服蛋白质输运体系通过采用壳聚糖制备或通过壳聚糖包裹增加输运体系的输运效率。

但是，目前的口服蛋白质输运体系均只考虑了运输效率的提高，并没有实现同时增强治疗效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有纳米口服蛋白质药物输运体系的缺陷和技术不足，提供一种完全由天然材料组成的纳米体系，经口服途径输运易降解、难吸收的大分子药物，是一种纯天然的纳米输运体系。这种以聚半乳糖醛酸为基本材料，以双重乳化体系为基本结构的、毒性低、可降解的体系，加以壳聚糖的包裹修饰，具备应用于胰岛素等蛋白质药物口服输运研究与应用的潜力，将在糖尿病治疗、疫苗服用等领域具有应用较高的应用前景。

本发明的目的是提供一种基于聚半乳糖醛酸和壳聚糖的纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法。

本发明另一目的是提供所述纳米口服蛋白质药物输运体系的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种基于聚半乳糖醛酸的纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法，是采用W/O/W双重乳化法进行制备，包括如下步骤：

S1.将聚半乳糖醛酸(PGLA)溶解于4～6w/v％泊洛沙姆188溶液(浓度优选为5w/v％)中，再加入牛胰岛素进行溶解，得到内水相；

S2.然后以乙酸乙酯为油相、18～22w/v％泊洛沙姆188溶液(浓度优选为20w/v％)为外水相溶液，制备得到载胰岛素PGLA纳米粒，记为PGLA NP。

具体优选地，步骤S1的具体方法为：将聚半乳糖醛酸(PGLA)加入5％(w/v)泊洛沙姆188(Pluronic 188)中，调节至pH＝3～5，温育，晃动，溶解20～28h，离心除去不溶沉淀，向得到的溶液中加入牛胰岛素进行溶解，得到内水相。

其中，优选地，步骤S1所述PGLA与5％(w/v)泊洛沙姆188的质量体积比为：0.005～0.02g/ml。

更优选地，步骤S1所述PGLA与5％(w/v)泊洛沙姆188的质量体积比为：0.01g/ml。

优选地，步骤S1所述调节至pH＝3～5。

更优选地，步骤S1所述调节至pH＝4。

优选地，步骤S1所述温育是40～60℃温育20～40min。

更优选地，步骤S1所述温育是50℃温育30min。

优选地，步骤S1所述溶解的时间为20～28h。

更优选地，步骤S1所述溶解的时间为24h。

优选地，步骤S1所述牛胰岛素的加入量为4～6μg/μl。

更优选地，步骤S1所述牛胰岛素的加入量为5μg/μl。

优选地，步骤S2的具体方法为：

S21.将步骤S1的内水相加入乙酸乙酯中，超声处理形成一重乳化体系，即油包水乳化液结构；

S22.再将一重乳化体系(油包水乳化液)加入外水相溶液，超声处理形成双重乳化液，即水包油包水的纳米颗粒结构；

S23.后处理：再将双重乳化液加入分散相1～3w/v泊洛沙姆188水溶液(浓度优选为2w/v)，保持磁力搅拌，去除乙酸乙酯后，离心，用18～22mM HEPES(浓度优选为20mM)洗涤离心重悬。

其中，优选地，步骤S21所述内水相和乙酸乙酯的体积比为1：4～6。

更优选地，步骤S21所述内水相和乙酸乙酯的体积比为1：5。

优选地，步骤S22所述一重乳化体系和外水相溶液的体积比为0.2～0.4：1。

更优选地，步骤S22所述一重乳化体系和外水相溶液的体积比为0.3：1。

优选地，步骤S23所述双重乳化液和分散相的体积比为10～15：100。

更优选地，步骤S23所述双重乳化液和分散相的体积比为13：100。

优选地，步骤S23所述分散相2％泊洛沙姆188水溶液的pH为5.2～5.6。

更优选地，步骤S23所述分散相2％泊洛沙姆188水溶液的pH为5.4。

优选地，步骤S21和S22所述超声的功率为700～900W。

更优选地，步骤S21和S22所述超声的功率为800W。

优选地，步骤S21所述所述超声的的时间为50～70s。

更优选地，步骤S21所述所述超声的的时间为60s。

优选地，步骤S22所述所述超声的的时间为40～50s。

更优选地，步骤S22所述所述超声的的时间为45s。

优选地，步骤S23所述磁力搅拌的条件为800～12000rpm搅拌0.8～1.2h。

更优选地，步骤S23所述磁力搅拌的条件为1000rpm搅拌1h。

优选地，步骤S23所述去除乙酸乙酯是35～38℃(优选为37℃)真空旋蒸抽去乙酸乙酯。

优选地，步骤S23所述20mM HEPES的pH为6.8～7.2。

更优选地，步骤S23所述20mM HEPES的pH为7.0。

优选地，步骤S23所述离心是10000～14000rpm离心10～20min。

更优选地，步骤S23所述离心是12000rpm离心15min。

优选地，步骤S23所述洗涤离心的条件为700～900rpm离心8～15min。

更优选地，步骤S23所述洗涤离心的条件为800rpm离心10min。

另外，进一步地，本发明还提供另一种基于聚半乳糖醛酸和壳聚糖的纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法，同上述制备PGLA NP的方法，不同之处在于将外水相溶液由泊洛沙姆188溶液替换为溶解有壳聚糖的泊洛沙姆188溶液，制备得到载胰岛素的壳聚糖包裹PGLA纳米颗粒，记为CS-PGLA NP。

其中，优选地，所述壳聚糖和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.04～0.06g/ml。

更优选地，所述壳聚糖和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.05g/ml。

另外，进一步地，本发明还提供另一种基于聚半乳糖醛酸和壳聚糖的纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法，同上述制备PGLA NP的方法，不同之处在于将外水相溶液由泊洛沙姆188溶液替换为溶解有壳聚糖和京尼平的泊洛沙姆188溶液，制备得到载胰岛素的京尼平交联的壳聚糖包裹PGLA颗粒，记为Gen-CS-PGLA NP。

其中，优选地，所述壳聚糖和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.04～0.06g/ml。

更优选地，所述壳聚糖和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.05g/ml。

优选地，所述京尼平和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.001～0.002g/ml。

更优选地，所述京尼平和泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.001g/ml。

另外，由上述各方法制备得到的纳米口服蛋白质药物输运体系，即三种纳米体系PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP体系，均在本发明的保护范围之内。

所述纳米口服蛋白质药物输运体系在作为或制备蛋白质药物口服输运体系中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述蛋白质药物为胰岛素。

构建纳米输运体系的材料主要分为两类，分别是天然聚合物和人工合成聚合物。天然聚合物具备毒性低、体内易降解、副作用小等优点，而且，本发明筛选的天然材料除了具有低毒性质之外，还具有潜在的医疗功能，即具有同时具备输运材料与治疗药物的双重功能的潜力，使用具有抗病作用的天然聚合物制备输运载体，可以达到双重治疗的效果。

聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic acid，PGLA)是植物细胞壁的主要成分之一，是一种可以通过减缓肠道糖吸收的速度来达到控制血糖的作用的聚合物。此外，京尼平(Genipin,Gen)是一类从植物中提取的交联剂，常用于交联氨基，其毒性是具有类似功能的戊二醛的万分之一倍。本发明将根据此两种功能性物质构建输运体系，口服输运蛋白质药物，最大化的降低输运体系的毒性。同时，在输运胰岛素治疗糖尿病的过程中，载体与药物本身都具有医疗作用，对糖尿病的治疗可以达到双重功效。本发明合成了基于聚半乳糖醛酸的纳米颗粒，并分别使用游离壳聚糖和京尼平交联的壳聚糖包裹，探索其功能优化性。并以胰岛素做为口服蛋白药物的代表，测试了输运体系的蛋白质输运效能与整体的血糖控制功能。

具体地，本发明使用双重乳化法合成小粒径的包裹口服蛋白质药物胰岛素的PGLA纳米颗粒、壳聚糖包裹的PGLA纳米颗粒和由京尼平交联的壳聚糖包裹的PGLA纳米颗粒。在粒子表征测定方面，使用红外波谱验证粒子的化学组成，使用马尔文粒度仪检测粒子平均粒径分布、电位分布，使用透射电镜观察粒子大小、形态与分散情况，使用热重分析检测粒子热稳定性。应用紫外分光光度计检测粒子的载药量、药物释放速率。使用人结肠癌Caco-2细胞做为口服吸收的模型，分别检测三种输运体系的细胞毒性与其被肠上皮细胞吸收的能力，比较三种口服输运体系的在输运胰岛素过程中的效果及被小肠上皮细胞吸收的情况。在粒子的体内应用方面，使用STZ链脲佐菌素诱导制备SD大鼠糖尿病模型，结扎结肠灌药孵育，观察三种输运体系中的胰岛素被小肠绒毛吸收的情况。分别口服三种胰岛素输运体系，定量的获得一次服药后的血糖水平变化。

红外光谱结果显示，三种粒子均成功合成，并装载了胰岛素。PGLA纳米颗粒、包裹壳聚糖的PGLA纳米颗粒、包裹由京尼平交联壳聚糖的PGLA纳米颗粒平均粒径约60nm，带负电，透射电镜观察其粒径约为60nm，外观近似球形。三种粒子在体外缓冲液(pH＝1.1HCl，pH＝7.8PBS)的释放实验表明具有突释的释放模式。研究使用STZ构建大鼠糖尿病模型，成模标准由空腹血糖值确定(大于13mmol/L)，同时可以看出成模后大鼠的饮水量、进食量都高于对照组，然而其体重却无增长趋势。体内研究表明，使用该体系运载胰岛素，可以使胰岛素通过口服途径输运至血液循环，达到控制血糖的作用。降血糖峰值出现在服药后3h，药物可以在9h内，起到降低血糖的作用。

本研究成功制备基于天然聚合物PGLA、壳聚糖，以及天然交联剂京尼平的口服输运体系，该体系的成分保证了其具备极低毒性，与基于人工合成的聚合物构建的输运体系相比，具有极重要的优势。体系的纳米级粒径、壳聚糖的包裹都可以促进其输运携带的药物穿过小肠上皮，进入血液循环。该体系在输运胰岛素的应用中效果显著，也可以延用于其它水溶性蛋白质或不稳定大分子药物的口服输运。

在此体系中，创新性的应用油相将材料与胰岛素的水相溶液分隔成不同的小液滴，保障粒子的小粒径。同时，创新性的选择了具有控制血糖功能的材料做为胰岛素输运材料，在开发新型功能性材料、制备高效能胰岛素输运体系方面，有重要的理论与实践意义。

本研究使用聚半乳糖醛酸(PGLA)为合成口服蛋白质的输运体系的基础材料，并使用具有促进肠吸收的壳聚糖进行包裹修饰，提升体系的输运效率，最后使用植物来源的交联剂京尼平使壳聚糖在PGLA体系外形成交联的包裹层，探索其对输运体系的影响。

输运体系的选材与设计从源头上保证了其具有极低毒性。本研究设计的输运体系是由植物细胞壁的主要成分聚半乳糖醛酸制备，同时研究也表明聚半乳糖醛酸具有减缓肠道吸收葡萄糖的功能，这使体系不仅毒性低，而且在治疗糖尿病的应用中，可以使输运体系本身就具有对疾病的治疗效果。这是在药物输运领域中的一次创新，即应用天然的、具有治疗功能的物质制备药物输运体系，使载药输运体系从多方面达到治疗作用，具备多重的疾病治疗效果。

在输运体系的构造中，本研究创新性的使用W/O/W的双重乳化体系的性质，使用油相将溶解有输运药物与材料的水相分割成小水相环境，以使得材料与蛋白质药物之间能在微小环境中通过分子间作用力相结合，成为纳米颗粒。这种方法使得合成的纳米颗粒与传统的W/O/W体系的纳米颗粒相比，粒径显著较小。

对输运体系的表征研究中，红外波谱的数据表明体系已成功合成，TEM图像与动态光散射分析都表明粒子具有较小的粒径，这将帮助粒子通过M细胞穿过肠上皮，进入机体血液循环。同时，粒子带负电，其带电量相对较大，粒子间静电斥力帮助小粒径的粒子分散，避免其团聚，这辅助了粒子保持小粒径，促进其被肠上皮吸收，也帮助维持了粒子的稳定性。相比与其它研究中的双重乳化体系，本研究合成的粒子的粒径较小，更倾向于具备较高吸收率。此外，热重分析表明，载体的包裹减缓了胰岛素的热分解速率，同时，京尼平交联的壳聚糖外壳也对增加体系的稳定性有贡献。

体系对细胞活力影响极低，这证明了体系低毒性的特点。同时，体系可以被上皮细胞吸收，具有进入肠上皮细胞的能力，从细胞层面佐证了载药体系能够在肠道中被吸收。

对输运体系的体内作用研究中，结扎肠段对三种粒子的吸收情况表明，三种载药体系都可以成功将荧光胰岛素输运入小肠绒毛结构中，进入血液循环，其中Gen-CS-PGLA NP具有最好的输运效果。对STZ诱导的SD大鼠口服胰岛素输运体系后的血糖与血浆胰岛素水平的研究表明：三种载胰岛素的输运体系均保持了胰岛素的活性，具有降血糖的功能，于口服后3h血糖和血浆胰岛素水平达到峰值。其中，CS-PGLA体系的药效显著优于PGLA体系组，最大降糖效果为初始血糖值的50％。

本发明具有以下有益效果：

本研究首先筛选植物来源、具有降血糖活性的聚合物，得到无毒、易降解、具有控制血糖作用的目标物质聚半乳糖醛酸(PGLA)，并创新性的使用水包油包水体系将溶解于水相的胰岛素与PGLA分割成乳液微粒，旋蒸除去有机溶剂后，PGLA与胰岛素之间的氢键维持其稳定的纳米粒形态。

另外，在此基础上，又通过包裹壳聚糖外壳、包裹由京尼平交联的壳聚糖外壳，制备出可以用于水溶性蛋白质、水溶性大分子药物的口服输运体系，输运效率高、吸收率高，以胰岛素作为标志蛋白质药物，研究表明三种粒子都能够进行口服胰岛素的输运，具有明显的提高降血糖效果的作用，具有较好的输运与疾病治疗效果。

本发明制备的纳米口服蛋白质药物输运体系，具备应用于胰岛素等蛋白质药物口服输运研究与应用的潜力，将在糖尿病治疗、疫苗服用等领域具有较高的应用前景。

附图说明

图1为W/O/W双重乳化法制备纳米口服蛋白质药物输运体系示意图。

图2为三种纳米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的红外光谱(A)与拉曼光谱图(B)。

图3为三种纳米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的粒径(A)、电位(B)与TEM图像(C)。

图4为三种纳米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP与胰岛素的热重分析。

图5为胰岛素标准曲线。

图6为三种纳米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP在模拟胃肠缓冲液中的胰岛素释放曲线。

图7为MTT测定不同浓度的三种纳米粒对细胞活力的影响。

图8为Caco-2肠上皮细胞吸收三种FITC-胰岛素输运体系的情况。

图9为I型糖尿病模型的建立及建模鼠与正常鼠的体型比较。

图10为SD大鼠建模期间血糖(A)和体重(B)监测结果；图A中方形为对照组，其它形状为建模组；图B中黑色线为实验建模组，灰色线为对照组。

图11为SD大鼠建模期间日饮水(A)与进食量(B)监测结果；图中黑色线为实验建模组，灰色线为对照组。

图12为三种纳米粒PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的肠上皮透过性检测。

图13为I型糖尿病大鼠口服三种载胰岛素纳米体系后血糖变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用到的材料如下：

实验试剂：聚半乳糖醛酸(PGLA)，壳聚糖，Pluronic 188，牛胰岛素购于西格玛公司，京尼平购于上海西宝生物有限公司，乙酸乙酯购于广州博强生物科技有限公司，STZ链尿佐菌素，购于阿拉丁生化科技有限公司。胰酶、高糖DMEM培养基、非必需氨基酸均为Gibco公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；96/24孔聚苯乙烯细胞培养板为美国Corning康宁公司产品。

实验仪器：Sigma32184高速冷冻离心机，日本HITACHI 7650透射电子显微镜，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，Nikon显微镜，英国Malvern ZEN3600，日本Olympus公司光学倒置显微镜，德国Bruker VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪，瑞士Mettler,TGA/DSC 1同步热分析仪，中国赛默飞世尔Cryotome FSE冰冻切片机。

实验细胞：Caco-2人结肠腺癌上皮细胞，由广东药科大学提供。

实验动物：SD大鼠，购于南方医科大学实验动物中心。

实施例1纳米口服蛋白质药物输运体系的制备

采用W/O/W双重乳化法合成纳米颗粒(纳米口服蛋白质药物输运体系)，如附图1所示。

具体地，所述纳米口服蛋白质药物输运体系的制备方法如下：

1、制备载胰岛素PGLA纳米粒(PGLA NP)

(1)制备内水相：

将PGLA加入5％Pluronic 188中，调节至pH＝4，50℃温育30min，晃动，溶解24h，离心除去不溶沉淀，得到的溶液取200μl，加入1mg牛胰岛素进行溶解；所述PGLA与5％(w/v)泊洛沙姆188的质量体积比为10mg/ml。

(2)以乙酸乙酯为油相，20％(w/v)Pluronic 188为外水相溶液，制备PGLA NP：

将步骤(1)的内水相加入1ml乙酸乙酯中，超声60s，形成一重乳化体系，即油包水乳化液结构。

再将一重乳化体系(油包水乳化液)加入4ml 20％(w/v)Pluronic 188外水相溶液，超声45s，形成双重乳化液，即水包油包水的纳米颗粒结构。

(3)后处理：再将双重乳化液加入分散相40ml 2％Pluronic 188水溶液(pH5.4)，保持磁力搅拌1000rpm 1h。37℃真空旋蒸抽去乙酸乙酯。将纳米悬液离心，12000rpm，15min，用1.8ml 20mM HEPES(pH 7.0)洗涤离心(800rpm，10min)重悬。

2、合成载胰岛素的壳聚糖包裹PGLA纳米颗粒(CS-PGLA NP)

方法同上述制备PGLA NP的方法，不同之处在于将外水相溶液由20％(w/v)泊洛沙姆188溶液替换为溶解有壳聚糖的20％(w/v)泊洛沙姆188溶液

壳聚糖和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.05g/ml。

3、合成载胰岛素的京尼平交联的壳聚糖包裹PGLA颗粒(Gen-CS-PGLA NP)

方法同上述制备PGLA NP的方法，不同之处在于将外水相溶液由20％(w/v)泊洛沙姆188溶液替换为溶解有壳聚糖和京尼平的20％(w/v)泊洛沙姆188溶液。

所述壳聚糖和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.05g/ml。

所述京尼平和20％(w/v)泊洛沙姆188溶液的质量体积比为0.001g/ml。

实施例2纳米口服蛋白质药物输运体系的表征

1、红外光谱检测(FTIR)

(1)将体系合成的原材料PGLA、壳聚糖、胰岛素、京尼平与三种体系做红外光谱检测。将PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP冷冻干燥，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理。在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，使用德国Bruker VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪测定。

(2)红外光谱分析可以在一定程度上说明合成的纳米体系的复合成分(图2A)。PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP的红外光谱显示三者在1100cm^-1处(C-O-C振动)都有峰，这可能是由其中的多糖结构造成的。胰岛素的标志峰出现在1643cm^-1(伯氨基的C＝O振动)附近，这说明三种纳米颗粒都成功包裹了胰岛素。

此外，3446cm^-1处的吸收峰代表着-NH-的振动，在PGLA>-1处，在CS-PGLA>-1处，在Gen-CS-PGLA>-1处。同时，在1000cm^-1至1250cm^-1这一段红外指纹区可以看出，三者之间有细微差别。这说明了CS-PGLA>2基团的交联(图2A)。

2、拉曼光谱检测

(1)将体系合成的原材料PGLA、壳聚糖、胰岛素，以及三种纳米体系PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP体系完全干燥，取适当样品置于载样板的凹槽中，使用盖玻片压制，使样品紧实并具有平整表面，使用拉曼光谱仪检测。

(2)拉曼光谱从另一个侧面检测了粒子的成分(图2B)。

在PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP中，都具有多糖成分，即-COC-(位于1143cm^-1)和糖环结构(位于854cm^-1)。

同时，三者中都具有位于1300cm^-1处的仲酰胺键，即肽键，说明三种纳米粒子中都包裹有胰岛素。

在Gen-CS-PGLA NP中，位于1429cm^-1酰胺键的位置形成了新的峰，这表明京尼平与壳聚糖发生了反应，形成了新的酰胺键。

3、粒径、Zeta电位检测与透射电镜下的形态

(1)纳米颗粒粒径和Zeta电位检测使用Zetasizer纳米分析仪使用动态光散射(DLS)方法分析测量。粒径测定中，样本分散于超纯水中，平衡120s。仪器将自动测量30次，并将结果依据累积分析得到流体力学粒径。Zeta电位测定中，样本溶于超纯水中，测量30次。所有的测量重复3次。

(2)将粒子的悬液滴在覆有碳膜的铜网上，静置5min，用滤纸吸干多余水分，静置30min，待其完全干透。使用HITACHI 7650透射电镜，电子加速电压为300kV，分别于1x10⁴倍、2x10⁴倍的放大倍数下，观察粒子形态。

(3)由动态光散射法测定的PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP载胰岛素纳米颗粒的平均粒径分别为60±4nm，67±5nm，58±3nm(图3A)；Zeta电位分别为-15.15±0.63mV，-14.52±1.15mV，-16.53±1.68mV(图3B)。在透射电镜下，粒子为直径为60nm左右、大小均匀的圆球状颗粒(图3C)。

小粒径是促进纳米粒子吸收的重要特征，在穿过细胞间隙、被肠上皮细胞摄取时，小粒径都有较大的优势。同时，三种粒子都带负电，这又保证了粒子之间的相互排斥，使粒子能够相互独立不团聚。壳聚糖的包裹使CS-PGLA NP的电性较PGLA NP稍向正电偏移。

4、热重分析

(1)将PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP冷冻干燥处理，使用瑞士Mettler TGA/DSC 1同步热分析仪，在N₂氛围下，测量范围为30℃至900℃，升温速度为10℃/min。

(2)热重分析可以揭示纳米体系的热量交换与质量分解的特征模式。位于TG曲线30℃至100℃的质量损失是由于结合水的蒸发引起的。比较PGLA纳米粒子与CS-PGLA、Gen-CS-PGLA纳米体系，可见在100℃之前，两种包裹了壳聚糖的粒子的失水较PGLA体系多10％。可知壳聚糖的-NH₂基团与水分子之间形成氢键，可以使粒子结合更多的水份。

有关于壳聚糖的研究表明其在240℃的质量损失对应的是其分子间氢键断裂相关。三类载胰岛素的纳米体系具有丰富的-NH₂，-OH，-COOH功能基团，其间存在较强的分子间氢键。与此同时，在300℃-500℃之间，三种载胰岛素的纳米体系的质量损失显著少于胰岛素组(10％-20％)，这也从另一个侧面印证了纳米粒子的装载保护了部分胰岛素的推断。

比较包裹游离壳聚糖与交联的壳聚糖的两种体系，可见在500℃之后，Gen-CS-PGLA体系较稳定，其失重曲线较平缓，在600℃-800℃之间避免了10％的质量损失。此温度对应的是C-C骨架或C-N骨架的断裂，证明了京尼平的交联使输运体系的结构更稳定(图4)。

5、药物包封率测定

(1)首先绘制胰岛素标准曲线。分别配置不同浓度的胰岛素溶液(0.1mg/ml,0.01mg/ml,0.005mg/ml,0.001mg/ml,0.000 5mg/ml,0.000 1mg/ml)，使用德国Perkin Elmer Lambda 25紫外分光光度计测定其在200nm–300nm之间的紫外吸收光谱。并依据其吸收峰绘制标准曲线，计算曲线的线性拟合方程与拟合度。

使用高速离心机将最终合成的包裹胰岛素的粒子悬液使用高速离心机离心，11000rpm/min，10℃，30min。取上清真空悬蒸浓缩后，应用紫外分光光度计测定其胰岛素吸收光谱，并依据其在绘制标准曲线的波长处的吸光值换算胰岛素含量。胰岛素的包封率与载药率根据以下公式计算：

(2)胰岛素在稀HCl溶液中的紫外吸收光谱显示，在205nm与275nm分别具有吸收峰，并且位于205nm处的吸收峰高于275nm处10倍以上。许多研究也提出，胰岛素在205nm处的吸收峰更适宜于低浓度的样本检测。从10^-4mg/ml至1mg/ml的范围内，胰岛素在205nm处的紫外吸收值呈半抛物线型。

由于本研究涉及的样本胰岛素浓度较低，选取10^-4mg/ml与10^-2mg/ml之间的紫外吸收值绘制标准曲线，可见其具有线性关系，线性回归方程为y＝18.641x+0.0019，其相关性指数R²＝0.9967(图5)。

三种纳米输运体系的载药效率与载药量如表1所示。

表1三种纳米输运体系的载药效率与载药量

6、药物释放率测定

(1)配置0.1M HCl和pH＝6.8的PBS缓冲液，在10ml缓冲液中分别加入200μl粒子溶液，冰浴，置于摇床上，以50r/min轻轻晃动。分别于0.5h，1h，2h，4h，6h取样700μl，离心，取上清用于胰岛素含量检测，即使用紫外分光光度计，测定其吸光度，并依据标准曲线校准换算。每个释放体系重复3次，收集数据用于统计计算。

(2)图6表明了PGLA NP、CS-PGLA NP、Gen-CS-PGLA NP分别在0.1M HCl和PBS(pH 6.8)中的释放情况。可见三种粒子在两种不同pH值的体系中都存在显著的突释，即在0.5h时，药物释放达到接近90％，此后，1h，2h，4h，6h的胰岛素释放量未见显著的增加。

体外释放的结果表明，三种体系在酸性环境中的药物释放速率稍慢于中性环境，但并不具有显著的pH感应性。

实施例3纳米口服蛋白质药物输运体系的细胞实验

1、细胞培养

Caco-2细胞系由广东药学院提供。细胞在在培养瓶中增殖培养至80％后，以5000/孔的密度接种至96孔板上，培养1、2天，以进行后续实验。其细胞培养条件为：含20％新生牛血清、非必需氨基酸的高糖DMEM培养基，37℃恒温，5.0％CO₂。

2、输运体系的细胞毒性测试

(1)分别取不同剂量的输运体系加入正在培养的Caco-2细胞中，24h后，使用MTT法测量细胞存活率。即在96孔培养板上接种Caco-2细胞，5000个/孔，培养24h后，吸出培养基，加入无血清培养基，及不同浓度的胰岛素输运体系，培养24h后，加入5mg/ml的MTT溶液20ul/孔。继续培养4h，吸出培养基，加入DMSO溶解细胞内形成的甲瓒。在摇床上低速振荡10min，于酶标仪读数，波长510nm。

(2)胰岛素输运体系在细胞层面的生物毒性将由MTT法得到评估。在人肠上皮细胞Caco-2培养基内加入较高浓度的胰岛素输运体系，可见细胞活力并未受到太大影响，细胞比活力都保持在90％以上。其中，PGLA NP，CS-PGLA NP体系对细胞活力有促进作用，PGLA NP组的细胞比活力均在130％以上，CS-PGLA NP组的细胞活力随着体系的浓度有所上升，整体细胞比活力值均在120％以上。Gen-CS-PGLA NP组的细胞活力都在100％上下，对细胞活力并无明显的促进或抑制作用(图7)。

3、细胞对输运体系的吸收摄取

Caco-2肠上皮细胞对输运体系的吸收

(1)将处于对数生长期的Caco-2细胞，以5×10⁴个/孔的细胞密度接种到24孔培养板中，培养24h。加入载有FITC-胰岛素的三种输运体系的新鲜无血清DMEM培养基，在37℃继续培养细胞4h。弃去培养基，用PBS洗3次；每孔中加入4％多聚甲醛，室温下固定30min；用PBS洗3次，向每孔中加入0.2％Triton>

(2)通过使用荷载FITC-胰岛素的粒子孵育Caco-2细胞，可以研究细胞对粒子的摄取。粒子是否被细胞摄取可以通过细胞内是否有FITC的绿色荧光来判断，荧光的强度可以作为粒子摄取率的辅助判断标准。

PGLA NP，CS-PGLA NP，Gen-CS-PGLA NP均协助了FITC-胰岛素进入细胞，使细胞质呈现绿色荧光(图8)。从图中可以看出，明场光照下，Caco-2成片生长，细胞间形成紧密连接。使用340nm激光激发后，可见DAPI对细胞核的染色，使细胞核显现蓝色荧光，细胞核为相互独立的、大小均匀的圆球。可见粒子对细胞核的完整性并无影响。使用495nm激光激发后，可见FITC的绿色荧光，做为胰岛素的示踪剂。图中可见绿色细胞形态的中空圆球。DAPI与FITC的融合图片可以看出，绿色荧光分布在蓝色荧光周围，可以认为细胞对三种粒子均有吸收，并且随着修饰的增加，吸收量增多，即细胞对CS-PGLA NP的吸收量大于PGLANP的量，细胞对Gen-CS-PGLA NP的吸收量最多。

实施例4纳米口服蛋白质药物输运体系的体内实验

1、I型糖尿病鼠模型构建

(1)购买6周龄SD大鼠，适应环境一周，取3只做对照组，其余为实验组。大鼠禁食一夜，测量血糖，使用pH＝4.4的柠檬酸缓冲液在注射前冰浴避光配制STZ溶液，浓度为50mg/ml。对实验组大鼠按50mg/kg的剂量进行腹腔注射。

自建模当天起，每日测量大鼠体重、进食与饮水量。第3、6、9天分别禁食一夜后，使用罗氏活力型血糖仪监测空腹血糖。第6、9天空腹血糖值都大于13mmol/L的，认定为I型糖尿病模型大鼠。

将I型糖尿病成模大鼠按空腹血糖均值分组，保持每组大鼠的血糖均值无显著差异。

(2)使用雄性SD大鼠，腹腔注射STZ，剂量为50mg/kg。STZ注射组与对照组大鼠的体型有明显的差别(图9)。

注射STZ后第3天，大鼠禁食一夜后，STZ注射组的血糖就已显著高于对照组。1只血糖值为12.6mmol/L，其余STZ注射组血糖值都在20mmol/L以上，第6、9天，趋势未变化，可以认定除血糖值为12.6mmol/L的这只大鼠外，都建模成功，建模成功率达到92％(图10A)。

从注射STZ前1天至注射STZ后第9天的大鼠体重、饮水、进食量的监测数据表明(图10B、图11)，STZ注射组与对照组的体重、饮水、进食量在注射STZ前1天的数据无统计差异，注射前1天至注射当天的变化趋势也完全重合。至注射STZ当天起，体重、饮水、进食量出现差异，即对照组体重不断增长，饮水与进食量无显著变化；STZ注射组体重无增长趋势，饮水量激增至注射前的7倍左右，进食量增加约50％。

2、小肠绒毛吸收粒子的荧光显微观察

(1)取5只患1型糖尿病的SD大鼠，实验前禁食一夜，不禁水。使用戊巴比妥钠(0.05mg/kg)麻醉，腹部裸露后，结扎出5cm回肠，使用生理盐水清洗。在每只实验鼠的结扎肠断中分别注入0.5ml生理盐水、0.5ml游离FITC-胰岛素、0.5ml PGLA载FITC-胰岛素，0.5ml CS-PGLA载FITC-胰岛素，0.5ml GEN-CS-PGLA载FITC-胰岛素。结扎肠段，孵育2h后，处死鼠，取出每个结扎的肠断，用PBS清洗，然后，使用4％多聚甲醛固定2h，在30％蔗糖溶液中浸一夜。样本埋藏并置于-20℃冷冻。使用冰冻切片机(Cryotome FSE，赛默飞世尔科技，中国)将冰冻回肠断切出20μm薄片，使用DAPI染色，再使用荧光显微镜观察。

(2)通过结扎回肠段，使用药物孵育，可以比较小肠绒毛对药物及输运体系的吸收情况。本研究设置了生理盐水组为阴性对照，其冰冻切片的显微照片中仅呈现细胞核的蓝色荧光，游离FITC-胰岛素组为阳性对照，其冰冻切片的显微照片中显现了细胞核的蓝色荧光和FITC-胰岛素的绿色荧光。3组输运体系组肠段冰冻切片中均可见处于小肠绒毛上半部的FITC-胰岛素的绿色荧光。Gen-CS-PGLA载FITC胰岛素组中，还可见肠绒毛基部的血管中有绿色荧光。由荧光强度可知，PGLA、CS-PGLA、Gen-CS-PGLA输运体系的输运效果有逐渐优化的趋势(图12)。

3、药物体内药效监测

(1)取对照组大鼠和4组I型糖尿病大鼠，给患1型糖尿病SD大鼠断粮4h后，分别设置生理盐水组和3组治疗组，每组鼠不少于3只。服用对应的药物后(口服胰岛素量为50IU/kg)，于0h，1h，3h，5h，9h取尾尖血，使用罗氏活力型血糖仪测定血糖。

(2)图13表明了I型糖尿病模型大鼠口服三种载胰岛素纳米体系(50IU/kg)的效果。口服胰岛素溶液组没有降低血糖水平，也没有升高血清胰岛素水平。

然而，口服载胰岛素的输运体系均保持了胰岛素的活性，具有降血糖的功能，于口服后2.5h降糖效果达到峰值。

其中，CS-PGLA NP体系的药效显著高于PGLA NP体系组，于口服后2.5h达到最大降糖效果，即使血糖降低50％。而Gen-CS-PGLA NP体系组具有一定的控制血糖能力，但效果要稍低于其它两组输运体系。但是上述研究结果显示，Gen-CS-PGLA NP具有最好的输运效果。

综上研究结果显示，本发明成功制备了一种由植物来源的物质聚半乳糖醛酸的口服药物输运体系，并在其基础上进一步使用天然聚合物壳聚糖与天然交联剂京尼平进行修饰，该体系可以用于水溶性蛋白质、水溶性大分子药物的口服输运。

在以胰岛素为例的口服输运研究中，本研究制备的PGLA、CS-PGLA、Gen-CS-PGLA纳米体系能够具备较高的载药率、具有较强的小肠吸收率，在体内研究中，也能够发挥胰岛素的效应，在较长时间内控制血糖水平。