制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法

摘要

本发明涉及一种制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法，包括以下步骤：将自发断裂蛋白质内含子的C端与目的蛋白基因融合，N端与增强目的蛋白表达的标签蛋白融合，得到融合蛋白编码基因；将融合蛋白编码基因在大肠杆菌中诱导表达，通过自发断裂蛋白质内含子的C端自发断裂，释放所述目的蛋白，形成包涵体蛋白；将大肠杆菌细胞破碎，离心，弃掉上清液，得到无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒。本发明解决了在包涵体蛋白颗粒水平上实现标签蛋白的移除，填补了制备无标签包涵体蛋白纳米颗粒的技术空白，并且蛋白质内含子的自发断裂在大肠杆菌体内完成，后处理简单。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法。

背景技术

大肠杆菌作为表达外源蛋白的原核表达系统具有周期短、培养成本低、操作简单、表达水平高等优点而被广泛应用，但因大肠杆菌缺乏内质网和伴侣蛋白等真核生物中用于蛋白质折叠的关键元件，从而导致一些真核来源的蛋白或者对细胞有毒性的蛋白不能表达或者表达效率很低。

对于这类蛋白通常的解决方法是与具有提高蛋白表达能力的融合蛋白融合表达，但是融合蛋白在提高蛋白表达能力的同时也容易导致目的蛋白以包涵体的形式存在。包涵体蛋白往往作为错误折叠的无活性的产物从而被丢弃，而最近的研究表明包涵体蛋白具有纳米颗粒的特性，如生物可溶性、纳米粒直径、生物稳定性等从而在生物材料以及组织工程领域有广泛应用。

然而含有融合标签的包涵体蛋白可能会因为机体针对融合标签的免疫应答，从而限制了其在组织工程中的应用。对于可溶表达的蛋白通常先纯化目的蛋白然后体外通过化学法、蛋白酶切法以及基于蛋白质内含子的自我切割移除标签蛋白，对于包涵体形式表达的蛋白也是先纯化包涵体蛋白，然后将包涵体蛋白变性、复性之后再通过以上方法去除标签，然而这将无法恢复包涵体蛋白的纳米结构。因此目前并没有方法在保持包涵体蛋白纳米颗粒结构的基础上去除融合标签，从而制备无融合标签的包涵体纳米颗粒。

鉴于上述缺陷，本设计人积极加以研究创新，以期创设一种制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法，这种无融合标签的纳米颗粒可以在生物材料及组织工程中具有广泛应用。本发明是利用自发断裂蛋白质内含子的体内自发断裂特性以及融合蛋白提高目的蛋白表达水平及促进目的蛋白可溶性的基础上实现的。融合蛋白首先在合适的培养条件如低温，低浓度诱导剂下表达，融合蛋白的表达要保证自发断裂蛋白质内含子的正确折叠，然后自发断裂蛋白质内含子发生自发的C端断裂，从而释放无标签的目的蛋白，被释放的无标签的目的蛋白由于缺失融合蛋白从而在体内聚集形成无标签包涵体蛋白纳米颗粒。尽管已有技术也有报道利用蛋白质内含子自发断裂纯化目的蛋白，但是其纯化的目的蛋白必须是在可溶的状态下实现的，并且自发断裂是在体外完成的，一般通过温度或pH诱导实现，而对于包涵体蛋白颗粒是无效的。

本发明的制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

(1)将自发断裂蛋白质内含子的C端与目的蛋白基因融合，自发断裂蛋白质内含子的N端与增强目的蛋白表达的标签蛋白融合，得到融合蛋白编码基因；

(2)将融合蛋白编码基因在大肠杆菌中诱导表达，通过自发断裂蛋白质内含子的C端自发断裂，释放目的蛋白，形成包涵体蛋白；

(3)将大肠杆菌细胞破碎，离心，弃掉上清液，得到无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒。

进一步的，在步骤(1)中，自发断裂蛋白质内含子为Ssp DnaX mini-intein的138个氨基酸的C端序列。

进一步的，自发断裂蛋白质内含子Ssp DnaX mini-intein的138个氨基酸的C端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，在步骤(1)中，目的蛋白为柯萨奇病毒3型VP1蛋白。

进一步的，在步骤(1)中，标签蛋白为硫氧还蛋白基因。

进一步的，在步骤(2)中，在25℃下加入诱导剂诱导表达融合蛋白编码基因。

进一步的，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

进一步的，诱导剂的浓度为0.25mM。

进一步的，在步骤(3)中，弃掉上清液后，取得到的包涵体蛋白沉淀反复洗涤，得到无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒。

进一步的，在步骤(3)中，使用超声仪破碎大肠杆菌细胞。

借由上述方案，本发明具有以下优点：

本发明解决了在包涵体蛋白颗粒水平上实现标签蛋白的移除，填补了制备无标签包涵体蛋白纳米颗粒的技术空白，并且蛋白质内含子的自发断裂是在大肠杆菌体内完成，后续只需通过简单地超声破碎、离心、洗涤即可获得高纯度的无标签的包涵体蛋白纳米颗粒。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明融合蛋白表达载体构建过程示意图；

图2是本发明融合蛋白的表达及体内自发断裂过程示意图；

图3是本发明纯化的包涵体蛋白颗粒的表征结果；

图4是本发明制备无融合标签的包涵体纳米颗粒的载体构建及蛋白表达示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

如图1所示，本发明融合蛋白表达载体构建过程如下：将目的蛋白VP1与Ssp DnaXmini-intein的138个氨基酸的C端(Ic₁₃₈)融合得到pMSX-I_C138-VP1质粒，然后将Trx(硫氧还蛋白)与I_C138的N端融合得到pMSX-Trx-I_C138-VP1质粒。

将VP1蛋白基因序列通过PCR扩增并在两边加入AgeI和PstI酶切位点，然后通过酶切连接的方法克隆到I_C138的C端得到质粒pMSX-I_C138-VP1，再通过PCR扩增的方法扩增Trx的基因片段，两边分别加入NdeI酶切位点，连接到I_C138的N端得到质粒pMSX-Trx-I_C138-VP1，得到融合蛋白编码基因。

将融合蛋白编码基因于大肠杆菌BL21中在25℃下、加入0.25mM的IPTG诱导表达，在这个过程中Ssp DnaX mini-intein的Ic₁₃₈自发断裂，释放目的蛋白，被释放的目的蛋白由于缺失融合蛋白从而在体内以包涵体形式存在。经过以下处理得到无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒，具体操作步骤如下：

(1)取诱导表达重组菌株pMSX-Trx-I_C138-VP1>

(2)将上一步的破碎菌体在4℃，12000r下离心15min，弃掉上清液；

(3)用IB buffer洗涤得到的沉淀物3次，得到纯化的VP1包涵体蛋白纳米颗粒。

为验证本发明方法得到的VP1包涵体蛋白纳米颗粒是否无标签以及为包涵体纳米颗粒的形态，通过SDS-PAGE电泳以及Western blotting分析Ssp DnaXmini-intein的138个氨基酸的C端发生自发断裂的效率，并通过激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察包涵体蛋白纳米颗粒的形态。

图2为融合蛋白的表达及体内自发断裂过程图，其中图A为融合蛋白的表达及自发断裂示意图，融合蛋白Trx-I_C138-VP1表达之后，I_C138的C端发生自发断裂得到Trx-I_C138融合蛋白和VP1蛋白。图B为融合蛋白Trx-I_C138-VP1的表达及自发断裂的SDS-PAGE电泳图以及Western>C138融合蛋白和VP1蛋白相符，菌体超声破碎之后SDS-PAGE胶结果显示，Trx-I_C138融合蛋白存在于上清中，VP1蛋白存在于沉淀中，说明融合蛋白Trx-I_C138-VP1表达之后成功发生了C端断裂。Western>C138的C端断裂效率，通过anti-his抗体和anti-VP1抗体均未检测到前体蛋白的存在，说明C端断裂效率完全，得到的是纯净的无标签的包涵体蛋白颗粒。图3为纯化的VP1包涵体蛋白纳米颗粒测试结果，其中图A为VP1包涵体蛋白纳米颗粒的SDS-PAGE电泳图，图B为VP1包涵体蛋白纳米颗粒的激光共聚焦图，图C为VP1包涵体蛋白纳米颗粒的扫描电镜。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。