一种番茄中α‑茄碱的UPLC/Q‑TOF‑MS快速测定方法

摘要

本发明公开了一种番茄中α‑茄碱的UPLC/Q‑TOF‑MS快速测定方法，属于食品分析检测技术领域。本发明方法用1mmol的醋酸铵1%甲酸的甲醇溶液超声提取，Oasis HLB固相柱净化，经UPLC BEH C18 column (1.7μm，50mm×2.1 mm)色谱柱分离，采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式，对番茄中的α‑茄碱进行UPLC/Q‑TOF‑MS分析。本发明分析时间6min，线性范围为0.01～0.1mg/L；检出限0.5μg/kg，定量限1μg/kg。平均回收率70.2％～84.5％，平均相对标准偏差(RSD)为2.6％～4.2％，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。本发明的番茄中α‑茄碱的UPLC/Q‑TOF‑MS快速测定方法可以更快速、更充分的提取番茄的α‑茄碱，以更准确地测出α‑茄碱的含量，对于提高番茄分析检测技术和食用质量安全具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种α-茄碱的快速测定方法，更具体地涉及一种番茄中α-茄碱的UPLC/Q-TOF-MS（超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱）快速测定方法，属于食品分析检测技术领域。

背景技术

茄碱又称龙葵碱或龙葵素或洋芋毒素，是一种甾体糖苷生物碱，主要见于辣椒、茄子、番茄等茄科植物中，是植物的次生代谢产物。茄碱不是单一成分，主要有6种生物碱：α-茄碱、β-茄碱、γ-茄碱以及少量的α-查茄碱（α-Chaconine）、β-查茄碱和γ-查茄碱。其中α-茄碱是主要成分。易溶于热乙醇，几乎不溶于乙醚、氯仿和水。

茄碱对人体具一定毒性，食用极少量对人体无明显的害处，1mg/kg为最大安全量，1.75mg/kg则为敏感量；3-6mg/kg为致死量。若一次吃进200mg，15min至3h就可引起发病，如舌头发麻、恶心呕吐、腹痛、胃肠炎、腹泻、呕吐、发烧、眩晕等不良反应，甚至导致中毒者神经麻痹而死亡，因此食用含有此生物碱的蔬菜或食物时要注意。

番茄是一种消费量巨大的重要蔬菜品种，番茄中茄碱的含量多少对于番茄的安全食用至关重要。但是番茄中的茄碱检测的相关技术却存在诸如提取、检测通量等许多问题，一定程度上制约了番茄的安全预警和质量监测。

现有技术的茄碱的测定，番茄中的茄碱的相关测定方法未见报道，主要是利用化学检测方法和免疫学方法测定马铃薯中茄碱的方法较多。免疫学方法主要是酶联免疫吸附测定法；化学检测方法包括薄层色谱、液相色谱、气相色谱和液相色谱-质谱联用技术等。现在研究较多的是液相色谱和液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 技术。高效液相色谱法(HPLC)可以实现对茄碱的同时定性与定量，但是用HPLC检测时需要衍生，这就很难实现多种组份的同时检测。HPLC-UV法前处理方法复杂，需要进行固相柱净化。而最常用的方法是LC-MS 法因为灵敏度高，选择性好，样品前处理相对简单而成为茄碱检测的主要方法，如中国专利ZL201210321390.3公开了一种马铃薯中α-茄碱提取与检测的方法。但LC-MS方法存在不能在没有标准溶液的条件下筛选更多的未知物的缺陷，因为番茄中含有糖类、蛋白质、脂肪、苹果酸、柠檬酸、维生素和其它杂质并且含有酸性物质较多，根据专利ZL201210321390.3的方法也无法提取出番茄α-茄碱，且马铃薯中回收率只有18.6%。

超高效液相色谱(UPLC)相对普通的液相色谱分离效果好，分析速度快，非常适合于多组分快速检测。而飞行时间质谱(TOF-MS)能够进行分子量的精确测定，特别适合复杂基质中组分的准确定性，因此UPLC-TOF-MS成为复杂基质中多组分残留的有效分析方法。

因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的酸性复杂基质番茄中α-茄碱的UPLC/Q-TOF-MS（超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱）快速测定方法亟待开发出来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种番茄中α-茄碱的UPLC/Q-TOF-MS（超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱）快速测定方法，操作简单、快速且免去了免疫亲和柱或固相萃取柱净化步骤，不仅简化了实验，而且降低了成本。此外，本发明可以更快速、更充分的提取酸性复杂基质番茄中的茄碱，可以更准确地测出α-茄碱含量，对于提高番茄质量安全具有重要意义。

本发明所采用的技术方案为：

一种番茄中α-茄碱的UPLC/Q-TOF-MS快速测定方法， 其特征是包括以下步骤：

(1)番茄中α-茄碱提取：取经过预处理的番茄鲜样，加入醋酸铵1%甲酸的甲醇溶液提取液混合，进行超声处理，重复2次；合并处理液，抽滤，将滤液旋转蒸馏至浸膏状，再加入甲醇提取液溶解，得提取液。

(2) 番茄中α-茄碱提取液的净化：预先分别用甲醇和水淋洗Oasis HLB固相柱(3mL，60mg) ，再将步骤(1)制得的提取液过柱，用含甲醇的氯仿液淋洗，最后用甲醇洗脱；洗脱液用氮气蒸发至干，残渣用含乙酸铵的甲酸-甲醇溶解，备用。

(3) 标准工作溶液的配制：取α-茄碱标准品，用甲醇定溶至10.00mL，分别取浓溶液0.1mL定溶至10.00mL，然后过0.45μm滤膜后，再取1mL定容至10.00mL，过膜后取1000μL、100μL定容至10mL过膜得到1ppm、100ppb的标准溶液，再取分别取1ppm的标准溶液75μL、50μL、250μL、100μL、10μL定容至10mL得到标准溶液75ppb、50ppb、25ppm、10ppm、1ppm，过膜后待用。

(4) 番茄中α-茄碱的检测：将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用UPLC/Q-TOF-MS测定不同浓度的α-茄碱标品的吸收曲线，以α-茄碱标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制α-茄碱标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行UPLC/Q-TOF-MS测定，测得样品液中α-茄碱的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中α-茄碱含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中α-茄碱残留量。

优选的，包括以下步骤：

(1)番茄中α-茄碱提取：取10 g经过预处理的番茄鲜样，加入10mL1mmol的醋酸铵1%甲酸的甲醇溶液提取液混合，进行超声处理（55Hz，30 min），重复2次；合并处理液，抽滤，将滤液旋转蒸馏至浸膏状，再加入1mL50%的甲醇提取液溶解，得提取液。

(2) 番茄中α-茄碱提取液的净化：预先分别用2mL甲醇和水淋洗Oasis HLB固相柱(3mL，60mg) ，再将步骤(1)制得的提取液过柱，用1mL含5%甲醇的氯仿液淋洗，最后用2mL甲醇洗脱；洗脱液用氮气蒸发至干，残渣用1mL含1mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸-甲醇(30∶70，V/V)溶解，备用。

(3) 标准工作溶液的配制：取10mg α-茄碱标准品，用甲醇定溶至10.00mL，分别取浓溶液0.1mL 定溶至10.00mL，然后过0.45μm滤膜后，再取1mL定容至10.00mL，过0.45μm滤膜后取1000μL、100μL定容至10mL过膜得到1ppm、100ppb的标准溶液，再取分别取1ppm的标准溶液75μL、50μL、250μL、100μL、10μL定容至10mL得到标准溶液75ppb、50ppb、25ppm、10ppm、1ppm，过膜后待用。

(4) 番茄中α-茄碱的检测：将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用UPLC/Q-TOF-MS测定不同浓度的α-茄碱标品的吸收曲线，以α-茄碱标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制α-茄碱标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行UPLC/Q-TOF-MS测定，测得样品液中α-茄碱的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中α-茄碱含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中α-茄碱残留量。

优选的，所述步骤(4)的检测条件为：

色谱条件：

Waters UPLC BEH C18 column (1.7μm，50mm×2.1 mm)；流动相A 0.1%甲酸+1 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；柱温:室温；进样体积: 5μL。

梯度洗脱条件如下：

质谱条件：

电喷雾离子化模式:正离子模式；TOF运行模式:V模式；分辨率:10000～12000；扫描范围:m/z100～1000；毛细管电压(Capillary):3.0kV；离子源温度:120℃；样品锥电压(Sample cone)：40V；提取锥电压(Extraction cone)：4.0V；锥孔反吹气流量(Cone):50L/h；脱溶剂温度:350℃，脱溶剂气流量(Desolvation):800L/h；调谐溶液:亮氨酸脑啡肽(m/z556.2771)，50pg/μL。

本发明的有益效果 ：

(1)本发明采用基于QuECHERS提取方法结合UPLC/Q-TOF-MS建立了番茄中α-茄碱的快速测定方法，本方法操作简单、快速且免去了免疫亲和柱或固相萃取柱净化步骤，不仅简化了实验，而且降低了成本。实现了番茄中α-茄碱的快速定性及定量，对于提高番茄食用质量安全具有重要意义。

(2) 由于番茄样品本身含有糖类、蛋白质、脂肪、苹果酸、柠檬酸、维生素和其它杂质且含有酸性物质较多，本发明同时采用混合溶剂提取和固相萃取方法处理样品。采用1mmol的醋酸铵1%甲酸的甲醇溶液超声提取，Oasis HLB固相柱净化，对样品进行处理，干扰背景最小，且回收率高。

(3) 采用1mmol /L乙酸铵的0.1%甲酸-甲醇溶液作为流动相，α-茄碱能够得到很好分离，保留时间为：α-茄碱4.06min，本方法检测时间6min，检测速度快。

(4) 本发明采用UPLC/Q-TOF-MS法定性定量测定番茄中α-茄碱含量，α-茄碱的加标回收率在70.2%～85.4%之间，平均相对标准偏差（RSD）为2.6%～4.2%之间，本发明检出限0.5μg/kg，定量限1μgkg，灵敏度高、重复性好，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

(5) UPLC/Q-TOF-MS可以提取精确的准分子离子质量以作为定量需要，因此可以排除相近质量数离子峰的干扰，从而只进行一级质谱扫描即可得到良好的色谱峰，使定量方法大大简化。

附图说明

附图1为标准曲线；

附图2为对照品中α-茄碱质谱图；

附图3为番茄中α-茄碱质谱图；

附图4为番茄中α-茄碱的选择离子流图；

附图5 为阳性番茄样品的选择离子流图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

实施例中使用的仪器：

ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色谱，Thermo hypersll gold C18色谱柱（2.1×100mm，1.9µm），Waters Xevo Q-ToF四级杆分行时间质谱仪（美国Waters公司）；T25BS2型高速分散匀浆机（德国IKA公司），3K30型高速离心机（美国Sigma公司）；Laborota 4000型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；AE-240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

药品及标准品：α-茄碱标准品（纯度>99%，美国Sigma公司提供）；甲醇（色谱纯，德国Meck公司），甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；实验用水为去离子水。醋酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，赛默飞世儿科技（中国）有限公司）。Oasis HLB固相柱（Waters公司，3mL，60mg）。

样品：市售的普通番茄和小番茄。

实施例：番茄中α-茄碱的UPLC/Q-TOF-MS快速测定方法：

将采集的成熟后是黄色的小番茄、成熟后是红色的小番茄、成熟后是绿色的小番茄、成熟后是黄色的正常番茄和成熟后是红色的正常番茄五种番茄样品按照成熟和未成熟分为两组共十个样品，每组样品按照四分法缩分至500g，将此样品分成2×200g两份，用食品加工机粉碎，于-20℃冰柜密闭保存待测。

将经过预处理后的两组十个待测番茄样品依次按照如下步骤进行操作：

(1)番茄中α-茄碱提取：取10 g经过预处理的番茄鲜样，加入10mL1mmol的醋酸铵1%甲酸的甲醇溶液提取液混合，进行超声处理（55Hz，30 min），重复2次；合并处理液，抽滤，将滤液旋转蒸馏至浸膏状，再加入1mL50%的甲醇提取液溶解，得提取液。

(2) 番茄中α-茄碱提取液的净化：预先分别用2mL甲醇和水淋洗Oasis HLB固相柱(3mL，60mg)，再将步骤(1)制得的提取液过柱，用1mL含5%甲醇的氯仿液淋洗，最后用2mL甲醇洗脱； 洗脱液用氮气蒸发至干，残渣用1mL含1mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸-甲醇(30∶70，V/V)溶解，备用。

(3) 标准工作溶液的配制：取10 mg α-茄碱标准品，用甲醇定溶至10.00mL，分别取浓溶液0.1mL定溶至10.00 mL，然后过0.45μm 滤膜后，再取1mL定容至10.00mL，过0.45μm滤膜后取1000μL、100μL定容至10mL过膜得到1ppm、100ppb的标准溶液，再取分别取1ppm的标准溶液75μL、50μL 250μL、100μL、10μL定容至10mL得到标准溶液75ppb、50ppb、25ppm、10ppm、1ppm，过膜后待用。

(4) 番茄中α-茄碱的检测：将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用UPLC/Q-TOF-MS测定不同浓度的α-茄碱标品的吸收曲线，以α-茄碱标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制α-茄碱标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行UPLC/Q-TOF-MS测定，测得样品液中α-茄碱的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中α-茄碱含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中α-茄碱残留量。

所述步骤 (4)的检测条件为：

色谱条件：

Waters UPLC BEH C18 column (1.7μm，50mm×2.1 mm)；流动相A 0.1%甲酸+1 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液；柱温: 室温； 进样体积: 5μL。

梯度洗脱条件见表1：

表1：实施例1的梯度洗脱程序

质谱条件：

电喷雾离子化模式: 正离子模式；TOF 运行模式: V模式；分辨率:10000～12000；扫描范围:m/z100～1000；毛细管电压(Capillary):3.0kV；离子源温度:120℃；样品锥电压(Sample cone)：40V；提取锥电压(Extraction cone)：4.0V；锥孔反吹气流量(Cone):50L/h；脱溶剂温度:350℃，脱溶剂气流量(Desolvation):800L/h；调谐溶液:亮氨酸脑啡肽(m/z556.2771)，50pg/μL。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线见表2。

表2 番茄空白基质中α-茄碱的标准曲线

加标回收率和重复性：

在不含α-茄碱的番茄中加入0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.1 mg/kg 3个浓度的添加水平，按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表3。由表3可以看出，在3个加标水平上，α-茄碱的平均回收率为70.2％～84.5％，平均相对标准偏差(RSD)为2.6％～4.2％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表3 实施例1中α-茄碱的回收率和重复性(n＝6)

检出限：将不同浓度的α-茄碱基质标准工作溶液注入仪器，以定量离子色谱峰3倍信噪比所对应的毒素最低浓度为检出限(LOD)，的检出限均为0.5μg/kg (S/N≥3)；以10倍信噪比所对应的毒素最低浓度为定量检出限(LOQ)，定量检出限均为1μg/kg( S /N≥10)。

经检测十个番茄样品中α-茄碱的含量见表4：

表4 实施方案中不同番茄中的α-茄碱的含量：

从表4可见，成熟的番茄中不含有α-茄碱，而不同品种的未成熟番茄样品中含有α-茄碱，虽然含量较低，但是利用本发明方法能够准确测得未成熟番茄中的α-茄碱含量。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。