一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用。分别采用SnO

说明书

技术领域

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。因此乙肝病毒标志物的的准确检测，对乙型肝炎的治疗能起到重要作用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低、等优点，在临床检验领域具有重要的应用价值。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。

发明内容

本发明提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用，实现了乙肝病毒标志物HBs和HBe的高灵敏同时检测。

本发明的目的之一是提供一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器，用于乙肝病毒标志物HBs和HBe的同时检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1．一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将上述电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液中，在-0.2>

（3）继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为8~ 12 µg/mL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h， 取出4℃冰箱中晾干；

（4）继续将3 µL，1~ 3 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）再将上述电极浸入0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的浓度分别为1>

2.所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2的制备，步骤如下：

(1) Au@Pt NPs制备

将1 ~ 3 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液加入到100>4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；

将3~ 7 mL、质量分数为1% 的H₂PtCl₆溶液加入煮沸的上述HAuCl₄溶液中，再加入2>

(2) SnO₂-GS@>

0.1 ~ 0.3 mL、 0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将1 ~ 3 mL、10 μg/mL的HBs 检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@Au@Pt>2检测抗体孵化物；用pH>2-GS@>2备用。

3.所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备，步骤如下：

(1) Ag-cys-Au 纳米球的制备

1) L-cys@Au NPs的制备

在20 ~ 30 mL、2 mmoL/L的L-半胱氨酸L-cys溶液中,边搅拌边依次加入250 μL、0.05moL/L的 HAuCl₄溶液，350>4,>

2) Ag-cys-Au纳米球的制备

10~ 15 mL、 0.1 mg/mL的L-cys@Au NPs中，依次加入1 mL，质量分数为1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 mL、0.1 moL/L的抗坏血酸，1 mL，0.1 moL/L的 AgNO₃溶液，室温下搅拌30~>

(2) SnO₂-GS@>

0.1 ~ 0.3 mL、0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@Ag-cys-Au>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将1 ~ 3 mL、10 μg/mL的HBe检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@>2捕获抗体孵化物；用pH>2-GS@>2检测抗体孵化物溶液备用。

4.乙肝病毒标志物HBs/HBe的同时检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.1 ~ 8.6磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对乙肝病毒标志物HBs/HBe进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。

本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明使用了电镀金作为基底材料，金具有良好的导电性，以及优良的生物相容性，能够很好的固载捕获抗体，并能加速电子的传递，对于实现传感器的高灵敏度以及低检测限具有重要意义。

（2）分别采用SnO₂-GS@>2-GS@>2-GS具有大的比表面积，Pt、Au和Ag具有良好的导电能力以及对过氧化氢有催化作用，实现了信号的协同放大，因此提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；

（3）一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器对两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的检测，其线性范围均达到0.1 pg/mL～50 ng/mL，检测限达0.033 pg/mL。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将上述电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液中，在-0.2>

（3）继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为8µg/mL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h， 取出4℃冰箱中晾干；

（4）继续将3 µL，1 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）再将上述电极浸入0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的浓度分别为1>

实施例2一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将上述电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液中，在-0.2>

（3）继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为10µg/mL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h， 取出4℃冰箱中晾干；

（4）继续将3 µL，2 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）再将上述电极浸入0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的浓度分别为2>

实施例3一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将直径为5 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）将上述电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液中，在-0.2>

（3）继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为12µg/mL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h， 取出4℃冰箱中晾干；

（4）继续将3 µL，3 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）再将上述电极浸入0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；

（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的浓度分别为3>

实施例4所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2的制备，步骤如下：

(1) Au@Pt NPs制备

将1 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液加入到100>4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；

将3 mL、质量分数为1% 的H₂PtCl₆溶液加入煮沸的上述HAuCl₄溶液中，再加入2>

(2) SnO₂-GS@>

0.1 mL、 0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将1 mL、10 μg/mL的HBs 检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@Au@Pt>2检测抗体孵化物；用pH>2-GS@>2备用。

实施例5所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2的制备，步骤如下：

(1) Au@Pt NPs制备

将2 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液加入到100>4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；

将5 mL、质量分数为1% 的H₂PtCl₆溶液加入煮沸的上述HAuCl₄溶液中，再加入3>

(2) SnO₂-GS@>

0.2 mL、 0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将2 mL、10 μg/mL的HBs 检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@Au@Pt>2检测抗体孵化物；用pH>2-GS@>2备用。

实施例6 所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@Au@Pt>2的制备，步骤如下：

(1) Au@Pt NPs制备

将3 mL、质量分数为1% HAuCl₄溶液加入到100>4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；

将7 mL、质量分数为1% 的H₂PtCl₆溶液加入煮沸的上述HAuCl₄溶液中，再加入4>

(2) SnO₂-GS@>

0.3 mL、 0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将3 mL、10 μg/mL的HBs 检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@Au@Pt>2检测抗体孵化物；用pH>2-GS@>2备用。

实施例7所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备，步骤如下：

(1) Ag-cys-Au 纳米球的制备

1) L-cys@Au NPs的制备

在20 mL、2 mmoL/L的L-半胱氨酸L-cys溶液中,边搅拌边依次加入250 μL、 0.05moL/L的 HAuCl₄溶液，350>4,>

2) Ag-cys-Au纳米球的制备

10 mL、 0.1 mg/mL的L-cys@Au NPs中，依次加入1 mL，质量分数为1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 mL、0.1 moL/L的抗坏血酸，1 mL，0.1 moL/L的 AgNO₃溶液，室温下搅拌30>

(2) SnO₂-GS@>

0.1 mL、0.5 mg/mL SnO₂-GS与6>2-GS@>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将1 mL、10 μg/mL的HBe检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@>2捕获抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1>2-GS@>2检测抗体孵化物溶液备用。

实施例8所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备，步骤如下：

(1) Ag-cys-Au 纳米球的制备

1) L-cys@Au NPs的制备

在25 mL、2 mmoL/L的L-半胱氨酸L-cys溶液中,边搅拌边依次加入250 μL、 0.05moL/L的 HAuCl₄溶液，350>4,>

2) Ag-cys-Au纳米球的制备

12.5 mL、 0.1 mg/mL的L-cys@Au NPs中，依次加入1 mL，质量分数为1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 mL、0.1 moL/L的抗坏血酸，1 mL，0.1 moL/L的 AgNO₃溶液，室温下搅拌35>

(2) SnO₂-GS@>

0.2 mL、0.5 mg/mL SnO₂-GS与6 mL、2 mg/mL的Ag-cys-Au 纳米球溶液混合搅拌12 h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成2>2-GS@ Ag-cys-Au>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将2 mL、10 μg/mL的HBe检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@>2捕获抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成2>2-GS@>2检测抗体孵化物溶液备用。

实施例9所述检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备，步骤如下：

(1) Ag-cys-Au 纳米球的制备

1) L-cys@Au NPs的制备

在30 mL、2 mmoL/L的L-半胱氨酸L-cys溶液中,边搅拌边依次加入250 μL、 0.05moL/L的 HAuCl₄溶液，350>4,>

2) Ag-cys-Au纳米球的制备

15 mL、 0.1 mg/mL的L-cys@Au NPs中，依次加入1 mL，质量分数为1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 mL、0.1 moL/L的抗坏血酸，1 mL，0.1 moL/L的 AgNO₃溶液，室温下搅拌40>

(2) SnO₂-GS@>

0.3 mL、0.5 mg/mL SnO₂-GS与6 mL、3 mg/mL的Ag-cys-Au 纳米球溶液混合搅拌12 h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成3>2-GS@ Ag-cys-Au>

(3) 检测抗体孵化物溶液SnO₂-GS@>2的制备

将3 mL、10 μg/mL的HBe检测抗体Ab₂与1>2-GS@>2-GS@>2捕获抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成3>2-GS@>2检测抗体孵化物溶液备用。

实施例10乙肝病毒标志物HBs/HBe的同时检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.1 ~ 8.6磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对乙肝病毒标志物HBs/HBe进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；

（4）采用标准曲线法，测得该方法检测乙肝病毒标志物HBs和HBe的线性范围均为0.1pg/mL~50 ng/mL，检测限为0.033pg/mL。