装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用。本发明提供的试剂包括超声试剂和纯化试剂，超声试剂用于表达后菌体的重悬和超声破碎，纯化试剂用于破碎后释放的装甲RNA病毒样颗粒的超滤纯化。实验表明，采用本发明提供的超声试剂和纯化试剂对装甲RNA病毒样颗粒局具有良好的纯化效果，所得装甲RNA病毒样颗粒进行RT‑PCR表现出良好的扩增曲线，进行PCR则未见非特异性扩增。证明所得病毒样颗粒具有良好的纯度，能够作为标准品使用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用。

背景技术

随着社会的发展，人们对健康越来越重视，其中就涉及到病原微生物的诊断，病毒的检测是其主要的一个方面，主要包括病毒抗原的检测和病毒核酸的检测。进行核酸诊断试剂的研制，为了评价其性能，不可避免的会用到企业参考品。大多数病毒为RNA病毒，其核酸诊断试剂的参考品必须包含其核酸，若能以病毒颗粒作为其参考品，可以很好的评价该诊断试剂的性能，但由于病毒临床样本量少，且不易获得，使得参考品的制备更加困难，且不能保证其稳定性，运输困难。若以裸露的RNA作为参考品，可以解决样本量少的难题。但由于环境中Rnase的存在，使得裸露的RNA不稳定，易于降解。还有一种方式就是将RNA保护起来，使其具有耐RNase特性，其中装甲RNA病毒样颗粒就是一种有效可行的方法。装甲RNA病毒样颗粒具有耐RNase特性，稳定性好，且易于制备，便于定量，可实现大规模生产，使其作为RNA类核酸诊断试剂的参考品具有明显优势。

装甲RNA病毒颗粒制备的技术路线主要有两种：单质粒表达系统和双质粒表达系统。这两种方式都是基于MS2噬菌体的假病毒颗粒的制备方法。前者将MS2噬菌体的衣壳蛋白和成熟酶蛋白基因与目的基因的序列整合到一个表达质粒中，将其转染大肠杆菌进行表达。后者将MS2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶蛋白整合到一个表达载体上，将目的基因序列整合到另一个与之相容的载体上，将构建的两个载体共转染大肠杆菌得到双质粒表达系统。无论采用哪种技术路线表达的装甲RNA病毒样颗粒均涉及到残留在细胞裂解中菌体基因组和质粒以及未成功包装的RNA的去除，才能获得纯净的装甲RNA病毒样颗粒。目前，病毒样颗粒的常用纯化方法主要有：氯仿抽提法、超速离心法、超滤法、分子筛等，四种方法得到的装甲RNA病毒颗粒均有大量DNA的残留，严重影响其质量，使其不能达到作为参考品的要求。因此，要得到高纯度的装甲RNA病毒样颗粒纯化是关键。一般采取的方式是用DNase和RNase进行消化去除残留的DNA，但是，大部分情况下这些核酸不易被去除，原因在于有些核酸缠绕在蛋白分子表面，形成核酸-蛋白复合物，使得Dnase和Rnase不易与这类核酸结合发挥其功能，因此，获得纯净的装甲RNA病毒样颗粒的关键就在于如何将这些核酸从核酸-蛋白复合物中解离出来，使其游离于溶液中。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用。以本发明提供的裂解试剂和纯化试剂对装甲RNA病毒样颗粒进行纯化效果良好，所得产品纯度高。

本发明提供了一种超声试剂，包括Tris-HCl、Na₂SO₄、KCl、DTT、EDTA、甘油和TritonX-100。

本发明提供的超声试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，超声试剂中各组分的含量为：

本发明超声试剂中采用的Tris-HCl的pH值为8.0。

本发明提供的超声试剂在裂解装甲RNA病毒样颗粒表达菌体中的应用。

本发明还提供了一种纯化试剂，其中包括Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、DTT和亚精胺。

本发明提供的纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，纯化试剂中各组分的含量为：

本发明纯化试剂中采用的Tris-HCl的pH值为8.0。

本发明提供的纯化试剂在纯化装甲RNA病毒样颗粒中的应用。

本发明还提供了装甲RNA病毒样颗粒提取试剂盒，包括超声试剂和纯化试剂；

超声试剂包括：Tris-HCl、Na₂SO₄、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton>

纯化试剂包括：Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、DTT和亚精胺。

本发明提供的试剂盒中，超声试剂中各组分的含量为：

纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：

纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：

纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：

纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：

纯化试剂中各组分的含量为：

在一些实施例中，本发明提供的试剂盒中超声试剂中：

纯化试剂中各组分的含量为：

本发明提供的试剂储存温度范围为-20℃-25℃。

本发明还提供了一种提取装甲RNA病毒样颗粒的方法，包括：

步骤1：以超声试剂重悬装甲RNA病毒样颗粒表达菌，超声破碎，经离心后，取上清液；

步骤2：使所述上清液经过超滤管后，以纯化试剂清洗获得浓缩液；

步骤3：所述浓缩液经Dnase和Rnase消化后，经过超滤管，以纯化试剂清洗、制得装甲RNA病毒样颗粒；

所述超声试剂包括：Tris-HCl、Na₂SO₄、KCl、DTT、EDTA、甘油和Triton>

所述纯化试剂包括：Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、DTT和亚精胺。

本发明提供试剂盒提取的装甲RNA病毒样颗粒为甲型流感病毒的装甲RNA病毒样颗粒。

利用本发明提供的试剂盒对装甲RNA病毒样颗粒进行提取，该试剂可破坏核酸-蛋白复合物结构，使结合于蛋白表面的核酸游离于溶液中，使DNase和RNase能更好的作用于核酸，发挥其功能。使存在于裂解液中的菌体基因组DNA，质粒DNA，mRNA以及未包装RNA降解的更充分，从而得到纯度更高的装甲RNA病毒样颗粒。

超声破碎利用超声波在液体中的空化作用，换能器将电能量通过变幅杆在工具头顶部液体中产生高强度剪切力，形成高频的交变水压强，使空腔膨胀、爆炸将细胞击碎。另一方面由于超声波在液体中传播时产生剧烈地扰动作用，使颗粒产生很大的加速度，从而互相碰撞或与器壁互相碰撞而击碎。

本发明中，超声破碎的功率为300W，超声3s，停留5s，超声时间为15min。

本发明中，超声破碎的温度为4℃。

本发明中，每8mL超声试剂重悬50mL装甲RNA病毒样颗粒表达菌菌液中所包含的菌体。

菌液经检测，OD600值为3。

步骤1中离心的转速为12000rpm，时间为5min。

步骤2中采用的超滤管为Amicon Ultra-4，其粒径为100kDa。

超滤管经平衡，所述平衡采用超纯水，4℃放置10min。

步骤2所述上清液经过超滤管具体为：向超滤管中加入上清液，将超滤管5000rpm，离心15min，弃除收集管中液体。

步骤2中所述清洗具体为：向超滤管中加入的纯化试剂，并用移液器反复吹打超滤膜8～10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。重复上述步骤一次。用移液器将超滤管中液体吸出转至新的1.5ml的离心管中。用200μl的纯化试剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。用纯化试剂补至1ml，即得浓缩液。

步骤3中所述消化的温度为37℃，消化时间为1h。

所述Dnase和Rnase的酶浓度比为1：10。

步骤3中所述经过超滤管为：将消化后的液体加入到已用超纯水润洗的超滤管中，将超滤管置于离心机中5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。

步骤3中所述清洗具体为：向超滤管中加入的纯化试剂，并用移液器反复吹打超滤膜8～10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。重复上述步骤一次。用移液器将超滤管中液体吸出转至新的1.5ml的离心管中。用200μl的纯化试剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。用纯化试剂补至1ml，即得装甲RNA病毒样颗粒。

本发明提供了一种用于装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体裂解及超滤纯化的试剂。可用于原核表达系统表达的装甲RNA病毒样颗粒的超声破碎和超滤纯化。本发明提供的试剂包括超声试剂和纯化试剂，超声试剂用于表达后菌体的重悬和超声破碎，纯化试剂用于破碎后释放的装甲RNA病毒样颗粒的超滤纯化。实验表明，采用本发明提供的超声试剂和纯化试剂对装甲RNA病毒样颗粒局具有良好的纯化效果，所得装甲RNA病毒样颗粒进行RT-PCR表现出良好的扩增曲线，进行PCR则未见非特异性扩增。证明所得病毒样颗粒具有良好的纯度，能够作为标准品使用。

附图说明

图1示实施例2～4制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果；

图2示实施例1和实施例5～6制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果；

图3-a示对比例1制得质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果；

图3-b示实施例2制得质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果。

具体实施方式

本发明提供了装甲RNA病毒样颗粒表达后菌体的裂解试剂、纯化试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，甲型流感病毒装甲RNA病毒样颗粒表达菌株购自博奥生物集团有限公司。病毒RNA提取试剂盒购自于Tiangen公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1装甲RNA病毒样颗粒的表达

将博奥生物集团有限公司保存的甲型流感病毒的装甲RNA病毒样颗粒表达菌株CBC NO.150601的甘油菌进行平板划线活化，挑取活化后的单菌落接种于10ml含有Kan和Cm抗性的LB液体培养基，37℃，220rpm，恒温震荡培养箱过夜培养。将培养菌液作为种子菌按1％(v/v)的比例接种于200ml的含有Kan和Cm抗性的LB液体培养基，37℃，220rpm，恒温震荡培养值OD600＝0.4-0.6，加入终浓度为1M的IPTG进行诱导表达，诱导表达条件为：22℃，200rpm培养6h，将表达后的菌液按每管20ml菌液进行分装，8000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，并用灭菌水重悬菌体，再次8000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。-20℃保存收集的菌体。

实施例2～6表达菌体的超声破碎和装甲RNA病毒样颗粒的纯化

实施例2～6所采用的超声试剂与纯化试剂设置如表1：

表1实施例2～6

超声试剂纯化试剂实施例211实施例321实施例431实施例512实施例613

其中，各试剂组分如下：

超声试剂1：35mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M Na₂SO4，15mM>

超声试剂2：50mM Tris-HCl(pH8.0)，1.0M Na₂SO4，20mM>

超声试剂3：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5M Na₂SO4，25mM>

纯化试剂1：25mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl，10mM MgCl₂，0.5mM>

纯化试剂2：50mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，15mM MgCl₂，1mM>

纯化试剂3：100mM Tris-HCl(pH8.0)，200mM NaCl，20mM MgCl₂，2mM>

超声和纯化方法如下：

一、表达菌体的超声破碎

将实施例1中收集的菌体用表1超声试剂进行重悬(50ml菌液离心后，菌体沉淀用8ml超声试剂重悬)，颠倒混匀，使菌体均匀悬浮于超声试剂1中，利用超声波细胞破碎仪进行超声破碎，超声程序为：功率300W，超声3s，停留5s，超声时间为15min。将破碎的裂解液进行离心，12000rpm离心5min，收集上清液。

二、装甲RNA病毒样颗粒的纯化

1、取1个超滤管，分别加入2ml的超纯水，置于4℃冰箱，预冷10min。

2、倒掉超滤管中的超纯水，向超滤管中加入8ml的上述破碎获得的上清液，将超滤管置于离心机中5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。

3、倒掉收集管中液体，向超滤管中加入3ml的纯化试剂，并用1ml的移液器反复吹打超滤膜8-10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中废液，将超滤管重新置于收集管中。

4、重复上述步骤3一次。

5、用200μl的移液器将超滤管中液体吸出转至一新的1.5ml的离心管中(超滤管经离心，超滤管中会有25-100μl的残留，此即为我们需要保留的部分)。

6、用200μl的纯化试剂反复吹洗滤膜8-10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。

7、将所得的浓缩液用纯化试剂补至1ml，即得装甲RNA病毒样颗粒的浓缩液。

8、将步骤7所得装甲RNA病毒样颗粒的浓缩液，用DNase和RNase进行酶消化处理，37℃，消化1h。

9、将消化后的液体加入到已用超纯水润洗的超滤管中，将超滤管置于离心机中5000rpm，离心15min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。

10、倒掉收集管中液体，向超滤管中加入3ml的纯化试剂，并用1ml的移液器反复吹打超滤膜8～10次，5000rpm，离心10min，倒掉收集管中液体，将超滤管重新置于收集管中。

11、重复上述步骤10一次。

12、用200μl的移液器将超滤管中液体吸出转至一新的1.5ml的离心管中；

(超滤管经离心，超滤管中会有25-100μl的残留，此即为我们需要保留的部分)。

13、用200μl的纯化试剂反复吹洗滤膜8～10次，并将洗液吸出与上步中吸出的液体混匀，重复2次。

14、将所得的浓缩液用纯化试剂补至1ml，即得纯化的装甲RNA病毒样颗粒。

实施例7纯化效果验证

一、提取实施例2～6制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸

将纯化所得的装甲RNA进行核酸提取(按天根病毒RNA提取试剂盒进行提取)，提取步骤如下：

1、取待提取液病毒样颗粒溶液140μl。

2、加入560μl AVL buffer，涡旋混匀15s，使病毒颗粒充分裂解。

3、室温孵育10min，瞬时离心。

4、加入560μl的无水乙醇，涡旋混匀15s，瞬时离心。

5、小心吸取630μl上述混合液于吸附柱中，不要使液体粘到吸附柱的边缘，室温放置2min，8000rpm离心1min，将吸附柱转至一新的收集管中。

6、重复步骤5，直至把剩余混合液全部离心，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中。

7、加入500μl溶液GD，室温放置2min，8000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中。

8、加入500μl溶液RW，室温放置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中。

9、重复步骤8一次。

10、将吸附柱转至一新的离心管中，12000rpm空离2min。

11、将吸附柱转至一新的1.5ml的离心管中，室温放置10min，悬空滴加60μl无洗脱缓冲液，室温放置2min，8000rpm离心2min，将离心管中液体重新加入到吸附柱中，8000rpm，离心2min，收集RNA液体，-20℃保存。

对上述提取获得的核酸的验证

将步骤四所提取的核酸进行RT-PCR和PCR验证(扩增产物为甲型流感膜蛋白基因)。RT-PCR和PCR体系及扩增程序分别如下。

上游引物：ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG

下游引物：TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG

RT-PCR体系：20μl体系扩增，10*Buffer 2μl，AMV-RT 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，MgCl2 1.2μl，dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板2μl，EvaGreen 0.6μl，ROX0.2μl，ddH2O 11μl

PCR体系：20μl体系扩增，10×Buffer 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，MgCl21.2μl，dNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板2μl，EvaGreen 0.6μl，ROX 0.2μl，ddH2O11.5μl

扩增程序：50℃30min，95℃5min；95℃15s，58℃30s，68℃20s；重复步骤3-5 32次，68℃10min，12℃5min。

对扩增效果进行分析，结果如图1～2：

由于病毒颗粒中包裹的为RNA，PCR扩增模板为DNA不会扩增RNA样品，RT-PCR先将RNA转录出DNA再进行扩增。若样品纯度很高，则不会有DNA残留只有RNA所以RT-PCR有扩增产物，PCR没有扩增产物。

其中，实施例2～4制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果如图1；结果表明采用3种不同浓度的超声试剂进行超声破碎，均可得到纯度较高的装甲RNA病毒样颗粒。

实施例2和实施例5～6制备质粒中核酸的RT-PCR扩增结果和PCR扩增结果如图2；结果表明3种不同浓度的纯化试剂进行纯化，均可得到高纯度的装甲RNA病毒样颗粒。

对比例1现有技术的提取效果

用菌体裂解液代替本发明的超声试剂，用PBS代替本发明的纯化试剂的作为对比例，菌体破碎和装甲RNA病毒样颗粒的纯化方法与实施例2～6相同。采用实施例7的方法对对比例制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸进行提取，并以相同的扩增体系和扩增程序对所得核酸进行扩增，其扩增结果如图3-a，以实施例2制备装甲RNA病毒样颗粒的核酸为末班扩增的效果如图3-b。结果显示，过本发明提供的超声试剂和纯化试剂，可以得到高纯度的装甲RNA病毒样颗粒。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。