用于检测超氧化物阴离子自由基的基于双三氟甲磺酸酯的荧光探针

摘要

本发明提供可以用作测量、检测和/或筛选超氧化物用的试剂的荧光化合物和探针。本发明的荧光化合物可以产生荧光颜色，诸如绿色、黄色或远红色。本发明还提供用于对活细胞线粒体内的超氧化物进行选择性染色的荧光化合物。本发明也提供可以用来直接或间接测量化学样品和生物样品如有生命的生物体的细胞或组织中超氧化物的存在和/或量的方法、以及用于检测或筛选可以提高或降低化学样品和生物样品中超氧化物水平的超氧化物或化合物的高通量筛选方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年1月31日提交的美国临时申请序列号61/934,335的优先权。该在先申请的整个内容通过引用引入本文。

发明背景

超氧化物(O2•−)反应性氧或氮物质的产生涉及与衰老、炎症和甚至若干疾病(如癌症和糖尿病)进程相关的病理生理过程。

为了调查涉及生物反应性的那些反应性物质的机理，已经开发了某些分析方法如化学发光和荧光来检测细胞内反应性物质的产生，尤其是线粒体内超氧化物的产生。这些探针用作研究各种病理学中的氧化应激的工具。例如，二氢溴乙非啶(dihydroethidium)(HE)和MitoSOX分别检测细胞内和线粒体O₂^•−，从而形成2-OH-E⁺和2-OH-Mito-E⁺。该被氧化的物质会嵌入核酸，发出红色荧光。然而，HE和MitoSOX也被其他反应性氧化剂氧化，产生E+和Mito-E⁺。2-OH-E⁺、E⁺、2-OH-Mito-E^{+>和Mito-E+>具有相似的荧光光谱特性。所以，使用进一步的分析测量来区分被氧化的物质。因此，目前可获得的超氧化物探针具有有限的灵敏度和选择性。}

发明概述

本发明涉及新型基于双三氟甲磺酸酯的化合物及其用于检测超氧化物阴离子自由基的可靠而准确的荧光探针的用途。

一方面，本发明提供式(I)和式(II)化合物：

包括其互变异构体。

R¹和R²各自独立地为F、Cl或H；

R³、R⁴、R⁵和R⁶各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟基烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰基氧基、硝基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苯甲基氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺、−C(=O)−P¹或−C(=O)−M−P²；其中P¹和P²各自独立地为氢、卤素、烷氧基、羟基、巯基、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基、烷基三苯基鏻或具有3-7个环原子的杂环基；M为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基；

A为OR⁹或NR¹⁰R¹¹；其中R⁹为H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基或氨基羰基；其中R¹⁰和R¹¹各自独立地为H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷基氧基、酰基、羧基烷基、磺基烷基、羧基烷基的盐、磺基烷基的盐或羧基烷基或磺基烷基的酯或酰胺；或者R¹⁰与R¹¹一起形成饱和5元或6元杂环，所述杂环为哌啶、吗啉、吡咯烷或哌嗪，其各自任选被以下基团取代：烷基、羧酸、羧酸的盐或醇的羧酸酯；或者R¹⁰与R⁵一起、或R¹¹与R⁶一起、或这两者，形成5元或6元环，所述环为饱和或不饱和的，或者进一步与芳环或杂芳环稠合，并且任选被一个或多个以下基团取代：烷基、羧酸、磺酸(-SO₃H)或其盐、酯或酰胺衍生物；

B为O或N⁺R¹⁰R¹¹；

Z为O、S、NR¹²、CR¹²R¹³、SiR¹²R¹³、GeR¹²R¹³或SnR¹²R¹³；

其中R¹²和R¹³各自独立地为H、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟基烷基、氨基烷基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰基氧基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苯甲基氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺、羧酸、羧酸酯或羧酰胺；或者R¹²与R¹³一起形成饱和5元或6元杂环，所述杂环任选被以下基团取代：烷基、羧酸、羧酸的盐或醇的羧酸酯；

R⁷为H、CF₃、CN、羧酸、羧酸的盐或醇的羧酸酯；或者R⁷为饱和或不饱和烷基，其任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸的盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)，其中R¹⁴和R¹⁵各自代表饱和或不饱和的、环状或无环的烷基，所述烷基任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸的盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或烷基三苯基鏻。

在某些实施方案中，R⁷为下式：

其中R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R²⁰各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、羧酸、羧酸的盐、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)、羟基、叠氮化物、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基羰基烷基例如三氟甲基羰基烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基羧酰氨基，其中所述烷基或芳基任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸的盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)或磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)；或者R¹⁶与R¹⁷一起、R¹⁷与R¹⁸一起、R¹⁸与R¹⁹一起、或R¹⁹与R²⁰一起形成任选进一步被一个或多个以下基团取代的与式(III)的苯环稠合的5元或6元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基的一部分：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸的盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)或磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)；

R⁸为H、羟基、CN或烷氧基；或者R⁷与R⁸一起形成5元螺内酯环或螺内酰胺环或5元螺磺内酰胺环；或者R⁸与R¹⁶或R²⁰一起形成5元或6元螺内酯环或螺内酰胺环或者5元或6元螺磺内酯环或螺磺内酰胺环，所述环任选且独立地被以下基团取代：H、F或CH₃。

在本发明的方法方面，提供用于检测样品中超氧化物的存在或者检测样品中超氧化物水平的高通量筛选方法。所述方法包括使式(I)或式(II)化合物与所述样品接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且确定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述样品中超氧化物的存在和/或超氧化物的量。

在本发明的另一个方法方面，提供用于筛选提高或降低超氧化物水平的一种或多种靶标化合物的高通量方法。所述方法包括使式(I)或式(II)化合物与所述靶标化合物接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且测定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述靶标化合物的存在和/或量。

本发明还提供包含本文所述的式(I)和/或式(II)化合物的试剂盒。所述试剂盒也可以包括至少一种试剂和/或其使用说明。

本文所述的方法、组合物和试剂盒可以用于医学和兽医应用以及基础科学研究和方法学，正如技术人员在阅读本公开内容时可以认识到的。当考虑附图以及详细描述时，本发明的这些和其他特征和优点将变得更为清楚。

附图简述

为了更全面地理解本发明的性质，应当参考以下详细描述，并结合附图，其中：

图1显示单独的HKSOX-1探针或与O₂^•−、其他氧化剂(H₂O₂、NO、¹O₂、ROO•、TBHP、•OH、ONOO⁻、HOCl)、还原剂(Fe²⁺、抗坏血酸、1,4-氢醌)、酯酶或GSH一起的荧光强度；

图2显示单独的HKSOX-2探针及与O₂^•−一起的荧光强度；

图3显示单独的HKSOX-2探针及与O₂^•−、其他氧化剂(H₂O₂、NO、¹O₂、ROO•、TBHP、•OH、ONOO⁻、HOCl)、还原剂(Fe²⁺、抗坏血酸、1,4-氢醌)、酯酶或GSH一起的荧光强度；

图4显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中O₂^•−与HKSOX-1r的共焦成像(单光切片(singlephotosection))。细胞用线粒体染料MitoTracker>

图5显示(a) HCT116人结肠癌细胞中HKSOX-1r与或不与线粒体呼吸抑制剂-抗霉素A(antimycin A)、鱼藤酮(rotenone)、FCCP或丙二酸共孵育30分钟的共焦成像，(b) BV-2小鼠小胶质细胞中HKSOX-1r与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟的共焦成像；和(c)RAW264.7小鼠巨噬细胞中HKSOX-1r与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟的共焦成像。在每组中，上图显示荧光图像，下图显示与明场图像合并的荧光图像；

图6显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中O₂^•−与HKSOX-1r的双光子共焦成像。(左>右)与探针和抗霉素A(antimycin>

图7显示：(a) Hela细胞中HKSOX-2与或不与线粒体呼吸抑制剂-鱼藤酮(rotenone)、FCCP和抗霉素A(antimycin A)共孵育30分钟；(b) BV-2小鼠小胶质细胞中HKSOX-2与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟；和(c) RAW264.7小鼠巨噬细胞中HKSOX-2与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟。在每组中，上图显示荧光图像，下图显示与明场图像合并的荧光图像；

图8显示用细胞器染料HKSOX-Lyso共染色以评估共焦成像中其亚细胞分布的结果。使用已确立的线粒体染料LysoTracker Green对肝细胞中的溶酶体进行染色。通过HKSOX-Lyso(2.5 μM)与MitoTracker Green (200 nM)一起在RAW264.7小鼠巨噬细胞中在存在或不存在两种超氧化物诱导剂：PMA (佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯；500 ng/mL)下共孵育30分钟进行共染色。结果证实：在PMA活化的巨噬细胞中，由HKSOX-Lyso显示的O₂^•−信号的位置与LysoTracker>2^•−信号。

图9 (b)显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中与或不与PMA、TEMPOL、Mdivi-1和Gö6983共孵育30分钟的HKSOX-2m，而图9 (a)显示BV-2小鼠小胶质细胞中与或不与PMA、TEMPOL、Mdivi-1和Gö6983共孵育30分钟的HKSOX-2m；

图10 (a)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在无超氧化物诱导剂情况下共染色30分钟的RAW264.7小鼠巨噬细胞；图10 (b)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在PMA存在下的共染色30分钟的RAW264.7小鼠巨噬细胞；和图10 (c)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在酵母聚糖存在下共染色30分钟的RAW264.7小鼠巨噬细胞；

图11 (a)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在无超氧化物诱导剂情况下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (b)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在PMA存在下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (c)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在酵母聚糖存在下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (d)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在琥珀酸二乙酯存在下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (e)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在丙二酸二乙酯存在下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；和 (f)用HKSOX-2m、MitoTrackerGreen和Hoechst在鱼藤酮(rotenone)存在下共染色40分钟的BV-2小鼠小胶质细胞；

图12 (a)显示用MitoSOX>TM>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>

图13显示MitoSOX>TM>

本发明的详细公开内容

本发明涉及新型基于双三氟甲磺酸酯的化合物及其用于对细胞模型(包括炎症和线粒体抑制)中的超氧化物阴离子自由基进行测定、检测和成像的荧光探针的用途。本文中提供的荧光探针描述了O₂^•−检测的新机制，因为它们含有三氟甲磺酸酯基团作为反应位点，从而避免了来自细胞还原物质如半胱氨酸、谷胱甘肽(GSH)和Fe²⁺的干扰。本发明的荧光探针提供了相对于活细胞线粒体中各种各样氧化剂和还原剂而言对超氧化物的选择性。

可用于本发明各方面的化合物由式(I)和(II)所示：

包括其互变异构体。

在式(I)和式(II)化合物的某些实施方案中：

R¹和R²各自独立地为F、Cl或H；

R³、R⁴、R⁵和R⁶各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟基烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰基氧基、硝基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苯甲基氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺、−C(=O)−P¹或−C(=O)−M−P²；其中P¹和P²各自独立地为氢、卤素、烷氧基、羟基、巯基、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基、烷基三苯基鏻或具有3-7个环原子的杂环基；M为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基；

A为OR⁹或NR¹⁰R¹¹；其中R⁹为H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基或氨基羰基；其中R¹⁰和R¹¹各自独立地为H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷基氧基、酰基、羧基烷基、磺基烷基、羧基烷基的盐、磺基烷基的盐或羧基烷基或磺基烷基的酯或酰胺；或者R¹⁰与R¹¹一起形成饱和5元或6元杂环其为哌啶、吗啉、吡咯烷或哌嗪、其各自任选被以下基团取代：烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或者R¹⁰与R⁵一起、或R¹¹与R⁶一起或这两者，形成5元或6元环，所述环为饱和或不饱和的，或者进一步与芳环或杂芳环稠合，并且任选被一个或多个以下基团取代：烷基、羧酸、磺酸(-SO₃H)或其盐、酯或酰胺衍生物；

B为O或N⁺R¹⁰R¹¹；

Z为O、S、NR¹²、CR¹²R¹³、SiR¹²R¹³、GeR¹²R¹³或SnR¹²R¹³；其中R¹²和R¹³各自独立地为H、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟基烷基、氨基烷基、羟基、巯基、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰基氧基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苯甲基氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺、羧酸、羧酸酯或羧酰胺；或者R¹²与R¹³一起形成饱和5元或6元杂环，所述环任选被以下基团取代：烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或者R¹²和R¹³独立地为CH₃或苯基；

R⁷为H、CF₃、CN、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或者R⁷为饱和或不饱和烷基，其任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)，其中R¹⁴和R¹⁵各自代表饱和或不饱和的环状或无环，所述烷基任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或烷基三苯基鏻；或者R⁷具有式(III)：

其中R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R²⁰各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、羧酸、羧酸盐、磺酸(-SO₃H)、磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)、羟基、叠氮化物、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、烷基羰基烷基、卤代烷基、氨基烷基、羧基烷基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基羧酰胺基，其中所述烷基或方剂任选被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)或磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)；或者R¹⁶与R¹⁷一起、R¹⁷与R¹⁸一起、R¹⁸与R¹⁹一起、或R¹⁹与R²⁰一起，形成5元或6元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，所述环与式(III)的苯环稠合，所述苯环任选进一步被一个或多个以下基团取代：F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鏻、磺酸(-SO₃H)或磺酰胺(-SO₂NR¹⁴R¹⁵)；且

R⁸为H、羟基、CN或烷氧基；或者R⁷与R⁸一起形成5元或6元螺内酯环或螺内酰胺环或5元螺磺内酰胺环；或者R⁸与R¹⁶或R²⁰一起形成5元或6元螺内酯环或螺内酰胺环或者5元或6元螺磺内酯环或螺磺内酰胺环，所述环任选且独立地被以下基团取代：H、F或CH₃。

在某些实施方案中，R⁸与R⁷一起形成5元或6元螺内酯环或螺内酰胺环或5元螺磺内酰胺环，且R⁸为氧或取代的氮。

在一个优选的实施方案中，本发明化合物具有式(II)结构或其互变异构体，B为O，Z为O，且R⁷为式(III)，其中R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹中的至少一个为羧基，且R²⁰为H、CH₃、OCH₃或COOH。

在某些实施方案中，式(III)的R⁷基团包含一个或多个羧基，其中至少一个羧基进一步与具有(HN((CH₂)_nCOOH)₂结构的亚氨基二烷基羧酸酯结合，其中n为1-20的整数。

在某些实施方案中，本发明化合物具有式(IV)或其互变异构体式(V)的结构：

。

在某些实施方案中，本发明化合物包含式1-20之一：

。

在另一优选实施方案中，本发明化合物具有式(II)或其互变异构体的结构，并且其中B为N⁺R¹⁰R¹¹，Z为O，且R⁷为式(III)。这样的化合物可以具有式(VI)或其互变异构体式(VII)的结构：

或式(VIII)或式(IX)的结构：

。

在某些实施方案中，式(VIII)或式(IX)中的R¹¹为(CH₂)_yT，其中T为H、COOH、COOR²¹、CONR²²R²³或COOAM；y为1-20的整数。

在某些实施方案中，本发明化合物包含式21-36之一：

。

在另一优选实施方案中，本发明化合物具有式(II)或其互变异构体的结构，并且其中B为O，Z为YR¹²R¹³，其中Y为Si、Ge或Sn，且R⁷为式(III)。R¹²和R¹³可以独立地为CH₃或苯基。此外，R²⁰可以是COOH，并且所述化合物具有式(X)或其互变异构体式(XI)：

。

在某些实施方案中，本发明化合物包含式37-48之一：

。

在另一优选实施方案中，本发明化合物具有式(II)或其互变异构体的结构，其中B为N⁺R¹⁰R¹¹，Z为YR¹²R¹³，其中Y为Si、Ge或Sn，且R⁷具有式(III)。R²⁰可以是COOH，并且所述化合物具有式(XII)或其互变异构体式(XIII)的结构：

。

此外，R¹⁰与R⁵一起、或R¹¹与R⁶一起、或者两者，可以形成5元或6元环，所述环为饱和或不饱和的，或可以进一步与芳基或杂芳基环稠合，并且可以任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸(-SO₃H)或其盐、酯或酰胺衍生物取代。

在某些实施方案中，本发明化合物具有式(XIV)或式(XV)的结构：

。

在某些实施方案中，本发明化合物包含式49-64之一：

。

在某些实施方案中，本发明的式(I)或式(II)化合物包含一个或多个游离羧基，其中至少一个羧基通过酰胺键与带正电的三苯基鏻部分连接。所述化合物与所述三苯基鏻部分之间的连接包括下式(XVI)或(XVII)：

其中n为1-10的整数。

在某些实施方案中，本发明化合物包含式65-69之一：

。

权利要求35的化合物，其中所述化合物与吗啉部分之间的连接包括下式(XIV)：

其中n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

权利要求35的化合物，其中所述化合物具有式70-74之一：

。

本发明进一步包括荧光探针组合物，其包含荧光化合物和载体。所述荧光探针组合物包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或它们的组合。

本发明还包括用于检测样品中超氧化物的存在和/或超氧化物水平的方法，所述方法包括：使式I化合物与所述样品接触，以形成荧光化合物；并且确定所述荧光化合物的荧光性质。所述样品可以是化学样品或生物样品。所述样品可以是微生物或细胞或组织。

本发明还提供用于检测生物体内超氧化物的存在或确定超氧化物水平的方法，所述方法包括：给所述生物施用式I化合物，以形成荧光化合物；并且区定所述荧光化合物的荧光性质。

本发明进一步提供用于检测样品中超氧化物的存在或确定超氧化物水平的高通量筛选方法，所述高通量方法包括以下步骤：使式I化合物与所述样品接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且确定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述样品中超氧化亚硝酸盐(peroxynitrite)的存在或量。

本发明提供又一个实施方案，即用于筛选一种或多种提高或降低超氧化物水平的靶标化合物的高通量方法，所述方法包括：使式I化合物与靶标化合物接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且测定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述靶标化合物的存在和/或量。

在本发明的方法方面，提供用于检测样品如细胞和/或组织中超氧化物的存在或确定超氧化物水平的高通量筛选方法。所述方法包括：使式(I)或式(II)化合物与所述样品接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且确定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述样品中超氧化物的存在和/或量。

在本发明的另一方法方面，提供用于筛选一种或多种提高或降低超氧化物水平的靶标化合物的高通量方法。所述方法包括：使式(I)或式(II)化合物与所述靶标化合物接触，以形成一种或多种荧光化合物；并且测定所述荧光化合物的荧光性质，以确定所述靶标化合物的存在和/或量。荧光性质可以通过荧光显微镜或本领域技术人员可以理解的任何其他方法/设备来确定。

本发明也提供包含本文描述的式(I)和/或式(II)化合物的试剂盒。所述试剂盒也可以用于本文描述的方法中。所述试剂盒也可以包括至少一种试剂和/或其使用说明。此外，所述试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器中填充有试剂和/或本发明组合物中的一种或多种成分。所述试剂盒也可以包含对照组合物，诸如阳性和/或阴性对照荧光化合物。

尽管没有进一步展开，但相信本领域技术人员利用前述说明，能够最大程度地使用本发明。通过说明性而非限制性的方式提供以下的实施例。尽管已提供了具体实施例，但是以上描述是说明性的，而非限制性的。前述实施方案中的任何一个或多个特征可以与本发明任何其他实施方案中的一个或多个特征以任何方式结合。此外，在阅读本申请文件后，本发明的许多变体对于本领域技术人员而言会变得显而易见。本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用全文(包括所有图和表)结合到本文中，其程度与本说明的明确教导一致。申请人在本文件中引用了各种参考文献，但并非承认任何特定参考文献是其发明的“先有技术”。

实施例

在以下实施例中进一步说明本文所述的方法和组合物以及相关的试剂盒，这些实施例通过说明的方式提供，并非旨在限制。应当理解，所示成分的比例变化和要素供选方案对于本领域技术人员是显而易见的，并且落入本发明实施方案的范围内。给出了理论特征，但应当理解申请人并非试图受所给出理论的束缚。

以下是说明实践本发明的过程的实施例。这些实施例不应当理解为限制性的。除非另有说明，否则所有的份数、量或百分比按重量计，所有溶剂混合物的比例按体积计。

实施例1 - 绿色荧光化合物HKSOX-1和HKSOX-1r的合成

在氩气氛围下，向-78℃下的5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氟荧光素(220 mg, 0.49 mmol)于无水吡啶(5 mL)和干燥DCM (5 mL)中的溶液中滴加Tf₂O>3水溶液猝灭。混合物用乙酸乙酯(50>

HRMS (EI)：C₂₃H₆O₁₁F₁₀S₂的计算值：711.9192，实测值：711.9200。

a) 在氩气氛围、室温下，向HJ-3-43 (107 mg, 0.2 mmol)于无水SOCl₂>2CO₃>

HRMS (EI)：C₃₁H₂₁O₁₂N₁F₄的计算值：675.1000，实测值：675.0994。

室温下向HJ-3-56 (58 mg, 0.086 mmol)于THF (5 mL)的溶液中加入NH₃^.H₂O(0.08>

在氩气氛围下，于-78℃向HJ-3-57 (42 mg, 0.071 mmol)于无水吡啶(5 mL)和干燥DCM (5 mL)的溶液中滴加Tf₂O>3水溶液猝灭。混合物用乙酸乙酯(50>

HRMS (EI)：C₂₉H₁₅O₁₄N₁F₁₀S₂的计算值：584.9774，实测值：854.9784。

实施例2 - 黄色荧光化合物HKSOX-2的合成

在氩气氛围、室温下，在MeSO₃H>

在回流下将HJ-3-164 (426 mg, 1.06 mmol)于NaOH水溶液(12.5 M, 12 mL)中的溶液搅拌1小时。让反应混合物冷却至室温，用浓盐酸小心酸化，直至形成大量沉淀。粗制靶标化合物HJ-3-166c (312 mg，以定量收率)通过真空过滤获得，风干24小时。可以从滤液中回收副产物(2,4-二氟间苯二酚)。

HRMS (EI)：C₁₄H₈O₅F₂的计算值：294.0340，实测值：294.0332。

在氩气氛围、室温下，在密封管中制备HJ-3-167 (20 mg, 0.0655 mmol)和HJ-3-166 (19 mg, 0.0655 mmol)于TFA (2 mL)中的混合物。将所得混合物于100℃搅拌3小时。让反应混合物冷却至室温，与甲苯共沸3次。靶标化合物HJ-3-168通过硅胶快速色谱分离，使用EtOAc: 己烷(1: 1) (含有0.25% AcOH)。产量: 12 mg (33%)。

HRMS (EI): C₃₂H₃₁O₆NF₂的计算值(M⁺):>

于氩气氛围、室温下，向HJ-3-168 (9.9 mg, 0.0176 mmol)于无水DMF (21 mL)的溶液中缓慢加入Et₃N>2 ，将所得混合物再搅拌30分钟。然后混合物用乙酸乙酯稀释(10>

HRMS (EI)：C₃₃H₃₀O₈NF₅S>+)的计算值：695.1612，实测值：695.1605。

实施例3 - 靶向线粒体的绿色荧光化合物HKSOX-1m的合成

1) 于氩气氛围下，向偏苯三甲酸酐(175 mg, 0.912mmol)、2,4-二氟间苯二酚(266mg, 1.824 mmol)的混合物中加入MeSO₃H>

2) 于氩气氛围下，向5(6)-羧基-2’,4’,5’,7’-四氟荧光素(198 mg, 0.443mmol)于干燥DCM (2 mL)溶液中加入DIPEA (0.366 mL, 2.22 mmol)。然后滴加氯甲基甲基醚(0.168 mL, 2.22 mmol)。所得混合物于室温下搅拌12小时，然后用乙酸乙酯稀释，用1 NHCl、水和盐水洗涤。有机层经MgSO₄干燥并真空浓缩。经甲氧基甲基保护的产物通过硅胶快速色谱分离，使用MeOH:>

3) 于室温下，向甲氧基甲基保护的产物(180 mg, 0.310 mmol)于THF (6 mL)的溶液中滴加NaOH (124 mg, 3.10 mmol)于水(2.0 mL)中的溶液。将所得溶液搅拌1小时。然后用乙酸乙酯稀释，用1 N HCl、水和盐水洗涤。有机层经MgSO₄干燥并真空浓缩。化合物YS-2-72经硅胶快速色谱分离为白色粘性固体，使用MeOH:>

HRMS (EI)：C₂₅H₁₆F₄O₉>

在氩气氛围下将1,4-二溴丁烷(1.18 mL, 10.0 mmol)和三苯基膦(2.62 g, 10.0mmol)于干燥甲苯(20.0 mL)的溶液加热至回流持续12小时。然后将反应冷却至室温，然后过滤得到白色固体。用乙醚洗涤3次，然后风干，得到YS-2-73，为白色粘性固体(3.58 g,75%产率)。

在氩气氛围、室温下，向哌嗪(516 mg, 6.00 mmol)和K₂CO₃>4干燥并浓缩，得到YS-2-75，为白色粘性固体(510>

HRMS (ESI): C₂₆H₃₂N₂P>+)的计算值：403.2303，实测值：403.2302。

在氩气氛围下，向YS-2-72 (42 mg, 0.0789 mmol)于干燥DCM (5 mL)的溶液中加入EEDQ (29 mg, 0.118 mmol)。15分钟后，加入YS-2-75 (46 mg, 0.0953 mmol)的干燥DCM(2 mL)溶液。将所得溶液于室温下搅拌12小时，然后用乙酸乙酯稀释，用1 N HCl、水和盐水洗涤。有机层经MgSO₄干燥并真空浓缩。经硅胶快速色谱分离化合物YS-2-77，为白色粘性固体，使用EtOH:>

HRMS (ESI): C₅₁H₄₆F₄N₂O₈P>+)的计算值：921.2922，实测值：921.2953。

1) 于室温下向YS-2-77 (64 mg, 0.0639 mmol)中加入4 M HCl的1,4-二氧六环溶液(1 mL)，30 min后真空浓缩。

2) 将产物溶于干燥DCM (2 mL)和无水吡啶(2 mL)中，在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。然后在氩气氛围下滴加Tf₂O>4干燥并真空浓缩。

3) 将Amberlite IRA-400 (Cl)在盐水中搅拌1小时，用1 N HCl、盐水和MeOH洗涤，然后风干。向在MeOH中的粗产物中加入经预处理的Amberlite IRA-400 (Cl)，然后过滤得到滤液。将滤液真空浓缩。经硅胶快速色谱分离化合物YS-2-80，为白色粘性固体，使用EtOH: DCM (3: 7)作为洗脱液(58 mg, 78%产率)。

HRMS (ESI): C₄₉H₃₆F₁₀N₂O₁₀PS₂>+)的计算值：1097.1389，实测值：1097.1401。

实施例4 - 靶向线粒体的黄色荧光化合物HKSOX-2m的合成

室温下向BXY-1-118的AcOH溶液中缓慢加入HBr (48 wt %)。在回流下将所得混合物搅拌12小时。让反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用1N HCl、水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。靶标化合物HJ-3-216经硅胶快速柱色谱分离，使用EtOAc: 己烷(1: 1)作为洗脱液。产量：(419 mg) (85%)。

在氩气氛围下，将密封管中HJ-3-166 (66 mg, 0.238 mmol)和HJ-3-216 (70 mg,0.238 mmol)于TFA (2.4 mL)中的溶液加热至100℃。将所得混合物于100℃下搅拌3小时，让其冷却至室温。将反应混合物真空浓缩。靶标化合物HJ-3-218经硅胶快速柱色谱分离，使用MeOH: DCM: (1: 9) (含有0.25% AcOH)作为洗脱液。产量：(97 mg) (76%)。

在氩气氛围、室温下向HJ-3-218 (81 mg, 0.151 mmol)、Et₃N于无水DMF>3N>2>

HRMS (EI)：C₃₁H₂₆O₈NF₅S>+)的计算值：667.1299，实测值：667.1302。

在氩气氛围下向HJ-3-220 (28 mg, 0.0419 mmol)于干燥DCM中的0℃溶液中序贯加入EEDQ (21 mg, 0.0839 mmol)和胺(16 mg, 0.0839 mmol)。将所得混合物于0℃搅拌24小时至室温。反应混合物用DCM稀释，用1N HCl、水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。靶标化合物HJ-3-222经硅胶快速柱色谱分离，使用EtOAc: 己烷(1: 1)作为洗脱液。产量：(32 mg) (91%)。

于室温下向HJ-3-222 (7 mg, 0.00837 mmol)的DCM (1 mL)溶液中缓慢加入TFA(1 mL)。将所得混合物于室温下搅拌1小时。反应混合物经真空浓缩，与甲苯共沸3次，得到粗制残余物。在氩气氛围、0℃下，向溴化(4-羧基丁基)三苯基鏻(11 mg, 0.0251 mmol)和EEDQ (7 mg, 0.0276 mmol)于干燥DCM (2 mL)的的溶液中加入所述粗制残余物于干燥DCM(2 mL)中的溶液。将所得混合物于0℃下搅拌12小时至室温。反应混合物用DCM稀释，用1 NHCl、水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。Amberlite IRA-400 (Cl)在盐水中搅拌1小时，用1 N HCl、盐水和MeOH洗涤，然后风干。向在MeOH中的粗制残余物中加入所述经预处理的Amberlite IRA-400 (Cl)，然后过滤得到滤液。将滤液真空浓缩。靶标化合物HKSOX-2m经硅胶快速柱色谱分离得到粉红色粘性固体，使用EtOH:CHCl₃>

HRMS (ESI): C₅₈H₅₆O₃N₈F₅SP>+)的计算值：1080.3441，实测值：1080.3487。

实施例5 - 靶向溶酶体的黄色荧光化合物HKSOX-Lyso的合成

在氩气氛围、0℃下，向HJ-3-220 (50 mg, 0.0749 mmol)于干燥DCM的溶液中序贯加入EEDQ (61 mg, 0.16 mmol)和4-(2-氨基乙基)吗啉(20 mg, 0.15 mmol)。于0℃下将所得混合物搅拌12小时至室温。反应混合物用DCM稀释，用1 N HCl、水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。靶标化合物HKSOX-Lyso经硅胶快速柱色谱分离，使用MeOH:DCM(1:20)作为洗脱液。产量：(28 mg) (48%)。

实施例6 - 基于FRET的绿色荧光化合物HJ-3-241-2的合成

在氩气氛围、0℃下，向反式>2O>2O稀释，用DCM萃取3次。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩，得到粗产物。获得HJ-3-232c(2.1>

在氩气氛围、室温下，向7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(97 mg, 0.371 mmol)和HJ-3-232c (184 mg, 0.742 mmol)于无水DMF的溶液中加入HOAt。搅拌30分钟后加入EDC^.HCl，将所得混合物于室温下再搅拌12小时。然后反应混合物用DCM稀释，用1N>2O和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。靶标化合物HJ-3-234经硅胶快速柱色谱分离，使用EtOAc:>

在氩气氛围、室温下，向HJ-3-234 (80 mg, 0.163 mmol)的MeOH溶液中缓慢加入Pd/C。所得混合物在氢气氛围下搅拌8小时。反应混合物经硅藻土垫过滤并真空浓缩，得到粗产物HJ-3-236c (58 mg，定量收率)，后者直接用于下一步。

在室温下向HJ-3-43 (120 mg, 0.225 mmol)的MeOH (10 mL)溶液中加入K₂CO₃(312>2O。将所得混合物于-78℃至室温搅拌3小时。反应混合物用水猝灭，用DCM稀释，用1N>

在氩气氛围、0℃下，向HJ-3-240c (42 mg, 0.059 mmol)和EEDQ (16 mg, 0.065mmol)于干燥DCM (5 mL)的溶液中加入HJ-3-236c (23 mg, 0.065 mmol)。将所得混合物于-78℃至室温搅拌3小时。反应混合物用DCM稀释，用1N HCl、水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥并真空浓缩。靶标化合物HJ-3-241-1(5异构体)和HJ-3-241-2 (6异构体: 更好的基于FRET的传感器)经硅胶快速柱色谱分离，使用EtOAc: DCM (1: 3)作为洗脱液。得到HJ-3-241-1 (27 mg)和HJ-3-241-2 (28 mg) (89%)。HJ-3-241-2:

实施例 7 – 用绿色荧光化合物HKSOX-1灵敏而特异性地检测超氧化物

本实施例表明：绿色荧光化合物HKSOX-1展示出对超氧化物(O₂^•−)的高特异性和选择性。HKSOX-1储备液(10>2^•−处理时，在用X/XO体系产生的10当量(equiv)O₂^•−处理10分钟后，观察到荧光强度显著增强(>500倍增强)，而10当量的其他氧化剂(H₂O₂,>1O₂,>−,>2+,>2^•−引起。

实施例 8 – 用绿色荧光化合物HKSOX-2灵敏而特异性地检测超氧化物

本实施例表明：绿色荧光化合物HKSOX-2展示出对超氧化物(O₂^•−)的高特异性和选择性。HKSOX-2储备液(1>2^•−处理时，在用X/XO>2^•−处理15分钟后，观察到荧光强度显著增强(>23倍增强)，而10当量的其他氧化剂(H₂O₂,>1O₂,>−,>2+,>

实施例 9 - 在细胞测定中应用题述化合物

我们对在不同细胞类型中HKSOX-1r在O₂^•−共焦成像中的应用进行了评价。对于内源O₂^•−的检测，我们使用小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)作为细胞模型。使用细菌脂多糖(得自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella>)的LPS; 500 ng/mL)和促炎细胞因子干扰素-γ(IFN-γ, 得自小鼠; 50 ng/mL)来活化巨噬细胞。使用针对感染相关炎症期间O₂^•−的主要酶促来源—NADPH氧化酶(NOX2)的已确立的高选择性肽抑制剂(gp91ds-tat¹²;>2^•−分解催化剂FeTMPyP>2^•−。14小时后，相对于未经处理的细胞，经LPS/IFN-γ刺激的巨噬细胞产生强得多的荧光信号(图4)。gp91ds-tat的加入显著抑制了这种O₂^•−产生的起伏。同样地，在FeTMPyP或TEMPOL存在下，HKSOX-1r荧光显著减弱。这些结果表明：我们的荧光探针能够特异性地检测活化巨噬细胞中产生的O₂^•−。

图4显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中使用HKSOX-1r (2 μM)的O₂^•−共焦成像(单光切片)。所述细胞用线粒体染料MitoTracker>

由于最近已经确定线粒体ROS在先天免疫应答和多种病理(包括癌症)中起着关键作用，因而我们也测试了用HKSOX-1r (2 μM)检测以下线粒体呼吸抑制剂诱导(处理30min)的O₂^•−：抗霉素A>2^•−产生(图5)，尽管功效程度有所不同：抗霉素A(antimycin>2^•−的诱导产生了强荧光反应，所述反应在动态检测范围内，这允许区别强刺激物与弱刺激物。另外，所述探针也可以在共焦成像中以双光子模式被有效激发(图6)。

图5 (a)显示HCT116人结肠癌细胞中HKSOX-1r (2 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂抗霉素A (antimycin A) (5 μM)、鱼藤酮(rotenone) (5 μM)、FCCP (5 μM)或丙二酸(500 μM)共孵育30分钟。图5 (b)显示BV-2小鼠小胶质细胞中HKSOX-1r (2 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟。图5 (c)显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中HKSOX-1r (2 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂共孵育30分钟。在各组中，上图：荧光图像；下图：荧光图像与明场图像合并。

图6显示RAW264.7小鼠巨噬细胞中使用HKSOX-1r (2 μM)的O₂^•−双光子共焦成像(左)>右)>

我们也测试了用HKSOX-2(5 μM)检测以下线粒体呼吸抑制剂诱导(处理30 min)的O₂^•−：抗霉素A>2^•−产生(图7)，尽管功效程度有所不同：抗霉素A>2^•−的诱导产生了强荧光反应，所述反应在动态检测范围内，这允许区别强刺激物与弱刺激物。

图7 (a)显示HKSOX-2 (5 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂鱼藤酮(rotenone) (10μM)、FCCP (10 μM)和抗霉素A (antimycin A) (10 μM)一起在Hela细胞中共孵育30分钟。图7 (b)显示HKSOX-2 (5 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂一起在BV-2小鼠小胶质细胞中共孵育30分钟。图7 (c)显示HKSOX-2 (5 μM)与或不与线粒体呼吸抑制剂一起在RAW264.7小鼠巨噬细胞中共孵育30分钟。在各组中，上图：荧光图像；下图：荧光图像与明场图像合并。

我们用HKSOX-Lyso进行了细胞器染料共染色，以评价共焦成像中的其亚细胞分布(图8)。使用已确立的线粒体染料LysoTracker Green对活细胞中的溶酶体进行染色。通过在存在或不存在两种超氧化物诱导剂：PMA (12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯; 500 ng/mL)的情况下，使HKSOX-Lyso (2.5 μM)与MitoTracker Green (200 nM)一起在RAW264.7小鼠巨噬细胞中共孵育30分钟，进行共染色。结果证实：在经PMA活化的巨噬细胞中，由HKSOX-Lyso所示的O₂^•−信号位置与LysoTracker>2^•−信号。

图8显示在不存在或存在PMA (500 ng/mL)的情况下用HKSOX-Lyso (2.5 μM)、LysoTracker Green (200 nM)共染色30 min的RAW264.7小鼠巨噬细胞。

我们评估了HKSOX-2m (2 μM)在不同细胞类型的O₂^•−共焦成像中的应用。对于内源O₂^•−的检测，使用两种不同类型的细胞：小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)和小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)。用PKC活化剂和急性O₂^•−诱导剂PMA>2^•−。使用抑制线粒体分裂和随后线粒体产生O₂^•−的Drp-1>2^•−形成。另外，用PKC抑制剂Gö6983>2^•−诱导效应。30>2^•−产生的起伏。在Mdivi-1和Gö6983存在下，HKSOX-2m荧光减弱至接近基线水平。同样地，相比于未经处理的细胞，经PMA刺激的小胶质细胞产生了强得多的荧光信号(图9)。TEMPOL的加入显著抑制了这种O₂^•−产生的起伏。在Mdivi-1和Gö6983存在下，HKSOX-2m的荧光减弱至接近基线水平。这些结果表明：我们的荧光探针可以特异性地检测活化巨噬细胞和小胶质细胞中产生的O₂^•−。

图9 (b)显示与或不与PMA (200 ng/mL)、TEMPOL (300 μM)、Mdivi-1 (100 μM)和Gö6983 (100 nM)一起在RAW264.7小鼠巨噬细胞中共孵育30 min的HKSOX-2m (2 μM)。图9(a)显示与或不与PMA (200 ng/mL)、TEMPOL (300 μM)、Mdivi-1 (100 μM)和Gö6983 (100nM)一起在BV-2小鼠小胶质细胞中共孵育30 min的HKSOX-2m (2 μM)。

图10 (a)显示用HKSOX-2m (2 μM)、MitoTracker Green (50 nM)和Hoechst (150ng/mL)在无超氧化物诱导剂情况下共染色30 min的RAW264.7小鼠巨噬细胞；(b)用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在PMA (200 ng/mL)存在下共染色30 min的RAW264.7小鼠巨噬细胞；(c)用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在酵母聚糖(50 μg/mL)存在下共染色30 min的RAW264.7小鼠巨噬细胞。

我们用HKSOX-2m进行了细胞器染料共染色，以评价共焦成像中的其亚细胞分布(图10)。使用已确立的线粒体染料MitoTracker Green (50 nM)和核DNA染料Hoechst (150ng/mL)分别对线粒体和细胞核进行染色。通过在存在或不存在两种超氧化物诱导剂：PMA(12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇酯; 200 ng/mL)和酵母聚糖(50 μg/mL)的情况下，使HKSOX-2m (2 μM)与MitoTracker Green和Hoechst一起在RAW264.7小鼠巨噬细胞中共孵育30分钟来进行共染色。

图11 (a)显示用HKSOX-2m (2 μM)、MitoTracker Green (10 nM)和Hoechst (1 μg/mL)在无超氧化物诱导剂情况下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (b)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在PMA (200 ng/mL)存在下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞；图11 (c)显示用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在酵母聚糖(50μg/mL)存在下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞；(d)用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在琥珀酸二乙酯(2.5 mM)存在下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞；(e)用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在丙二酸二乙酯(2.5 mM)存在下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞；(f)用HKSOX-2m、MitoTracker Green和Hoechst在鱼藤酮(rotenone)(500 nM)存在下共染色40 min的BV-2小鼠小胶质细胞。

图12 (a)显示用MitoSOX>TM>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>TM、MitoTrackerGreen和Hoechst在琥珀酸二乙酯(2.5>TM、MitoTracker>TM、MitoTracker>

为了进一步确认HKSOX-2m作为靶向线粒体的超氧化物探针的表现，我们用多种超氧化物诱导剂在BV-2小鼠小胶质细胞中进行了HKSOX-2m的共焦成像(图11)，并且用同样的药物作为刺激物，比较了HKSOX-2m的表现和MitoSOX>TM>TM)和一般性超氧化物诱导剂(PMA和酵母聚糖，它们诱发从包括线粒体在内的多种超氧化物源产生超氧化物)或特异性线粒体超氧化物诱导剂(琥珀酸二乙酯、丙二酸二乙酯和鱼藤酮(rotenone)，它们靶向线粒体呼吸链复合物)共孵育40分钟。一致的是，在HKSOX-2m成像(图11)中，用各种刺激物容易再现中等至强的荧光，并且在药物处理组中可以辨别清晰的线粒体形态。在2>TM成像(图12)中，当用同样刺激物攻击细胞时，观察到低至中等的荧光。然而，在MitoSOX>TM通道(Em 565-615 nm带通)中无法观察到清楚的线粒体形态。事实上，在MitoSOX>TM存在下(因其在发射光谱中宽带拖尾)线粒体染料MitoTracker Green (Ex 488; Em 505 nm 长通(long-pass))的荧光分布十分扭曲，导致线粒体形态丧失。另外，正如在荧光传感器文献中众所周知的，MitoSOX>TM将核DNA染色，在细胞核中发出亮荧光，显然这在成像和定量测定中都会导致显著的人为现象。在4 μM近毒性工作剂量(按照生产商的方案，其最大剂量为5 μM，该剂量在延长孵育时对细胞有细胞毒性)下，MitoSOX>TM的荧光开关响应相当迟缓，其激发(Ex 543 nm)需要高激光输出(100%)。总体来看，就作为活细胞成像中线粒体超氧化物探针的几个评价标准即选择性、灵敏度度和细胞分布而言，相比于MitoSOX>TM，HKSOX-2m明显表现突出(图13)。

图13显示MitoSOX>TM>

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引用结合入本文中，其程度与各个参考文献单独并具体指明通过引用而结合以及以其全文叙述的程度相同。

在描述本发明的上下文中所使用的术语“一种”(“a”和 “an”)和“所述”以及相似的措辞应解释为包括单数和复数，除非文中另有说明或根据上下文明显有矛盾。

本文中引述数值范围时仅仅意在用作单独提及落入该范围内的各个单独数值的速记法，除非文中另有说明，并且各个单独的数值引入本说明书(specification)中，如同所述数值在本文中单独引述一样。除非另有说明，否则本文提供的所有准确的数值都代表相应的近似值(例如就特定因子或测量而提供的所有准确的示例性数值可以被认为也提供通过用“约”修饰(如果合适)的相应的近似测量)。

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应当理解，本文所述的实例或实施例和实施方案仅仅为了说明，并且本领域技术人员会想到就所述实例或实施例和实施方案做出的各种修改或改变，这些修改或改变将包括在本申请的精神和范围内。