一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用

摘要

本发明公开了一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用。所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22及其应用。

背景技术

锌转运体(ZnT)是一组将锌离子由胞内转运出胞外的跨膜蛋白，与ZIP家族蛋白共同维护细胞内外锌离子的平衡。2004年，Cheimienti等首次在ZnT家族中发现ZnT8蛋白，它由SLC30A8基因编码，高度特异的表达在胰腺中，后进一步研究发现ZnT8特异的表达在胰岛β细胞上，在INS-1细胞中过表达ZnT8可促使锌离子的聚集并增强糖刺激后的胰岛素释放。这些研究表明ZnT8在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。

1型糖尿病(T1D)是由T淋巴细胞介导，以选择性破坏胰岛β细胞为特征的器官特异性自身免疫性疾病。胰岛β细胞上存在着多种自身抗原，如胰岛素，谷氨酸脱羧酶(GAD)，酪氨酸磷酸酶和ZnT8。其中，ZnT8被认为是T1DM的一个重要的自身抗原，Wenzlau等发现部分T1D高危患者发病前2年即可检测到ZnT8自身抗体且长期维持在较高水平。我们前期研究发现ZnT8存在着多个抗原表位可被1型糖尿病患者自身反应性T细胞识别，且ZnT8抗体水平与T1D的发展存在着显著相关性。早期检测ZnT8抗体和ZnT8特异性CD8+T细胞是预测和诊断T1D的重要手段。针对ZnT8靶点的特异性治疗将成为阻止T1D进展的潜在方法。

抗体研究迄今已有100多年历史，1975年Kohler和Milstein创立B淋巴细胞杂交瘤技术，鼠源单克隆抗体被广泛应用于疾病的诊断和治疗，但由于鼠源单克隆抗体对人体有免疫原性，易产生人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA和超敏反应，且由于其分子量较大，难以穿膜等缺点，限制了其在疾病治疗领域的应用。自20世纪八十年代中期，随着分子生物学的技术进展，国外学者建立了噬菌体抗体库技术。由于噬菌体表达的scFv抗体分子量较小，仅为完整抗体分子的六分之一，且具有较好的血管或组织屏障穿透性、半衰期短、结构稳定、不含Fc段，减少了与体内Fc受体结合而带来的不利影响等优势，已广泛地应用于分子生物学及免疫学、药理学等医学领域，是目前的研究热点。但目前尚未见抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体。

本发明的另一目的是提供该单链抗体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22，包括轻链和重链，

所述的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。

一种编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因，其中，

编码轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

编码重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。

本发明所述的编码编码权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C22的基因在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。

有益效果：

本发明首次从T1D病人外周血基因中构建了一个库容达1×10⁸的scFv噬菌体抗体库。我们招募了50例初发的T1D患者以保证库的特异性、多样性和代表性。从该库中，我们可以筛选T1D的各种自身抗体。

ZnT8抗原是T1D的重要自身抗原，具有六次跨膜结构，它由SCL30A8基因编码，定位于人第8号染色体q24.11上，包含8个外显子，编码369个氨基酸。ZnT8自身抗体在T1D的发生发展中发挥了重要作用。目前，ZnT8蛋白的氨基末端(1-74aa)和羧基末端(268-369aa)被认为是自身反应性T细胞识别的主要区域。由于ZnT8蛋白影响着胰岛素的合成与分泌，所以对其抗体作用机制的深了解对治疗T1D具有重大意义。本发明成功筛选了ZnT8特异性scFv。为保证筛选结果的多样性，我们选择了ZnT8蛋白的氨基羧基融合肽进行scFv的筛选。已经有大量报道发现T1D患者中ZnT8抗原325位氨基酸存在着点突变，由精氨酸(Arg)突变为酪氨酸(Trp),该位点突变与ZnT8抗体的识别密切相关，ZnT8羧基末端的突变二聚体(Arg325Trp)对检测ZnT8抗体具有高度的特异性和敏感性。所以我们进一步使用ZnT8羧基末端的二聚体(Arg325Trp)鉴定了scFv，结果表明scFv-C22能与该二聚体结合。免疫组化结果进一步显示scFv能特异性识别胰岛细胞，具有良好的生物学活性。

本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。

附图说明

图1.重组ZnT8基因构建.M:核酸标准品；泳道1:ZnT8氨基末端基因(1-74aa)约250bp；泳道2:ZnT8羧基末端基因(268-369aa)约350bp；泳道3:ZnT8氨基羧基融合基因(1-74aa,268-369aa)约550bp；泳道4:ZnT8羧基端二聚突变体基因(Arg325Trp)约650bp。图2.重组ZnT8蛋白的表达纯化及鉴定.

A:ZnT8氨基羧基融合蛋白的Western blotting检测(泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；B:ZnT8氨基羧基融合蛋白的SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；C:ZnT8羧基端二聚突变体蛋白Western blotting检测(泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)；D:ZnT8羧基端二聚突变体蛋白SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿)。

ZnT8氨基羧基融合蛋白和羧基端二聚突变体蛋白分子量分别约20kD和25kD。

图3.ELISA检测氨基羧基融合蛋白与商品化ZnT8抗体的结合能力。

图4.T1D scFv基因扩增.M:核酸标准品；泳道1:VλPCR产物(～350bp)；泳道2:VκPCR产物(～350bp)；泳道3:VH PCR产物(～450bp)；泳道4:scFv PCR产物(～800bp)。

图5.scFv-C22的纯化及鉴定.

A.SDS-PAGE检测scFv(M:蛋白标准品；泳道1:scFv-C22纯化前；泳道2:纯化后的scFv-C22；泳道3:scFv-C22流穿。)；B.Western blotting analyze检测scFv(泳道1:scFv-C22纯化前；泳道2:纯化后的scFv-C22；泳道3:scFv-C22流穿)。

图6.Western blotting检测scFv与ZnT8氨基羧基融合蛋白的结合能力.

泳道1:scFv-C22检测ZnT8氨基羧基融合蛋白；泳道2:阴性对照。

图7.scFv-C22与ZnT8氨基羧基融合蛋白的亲和力检测。

图8.ELISA检测scFv-C22对ZnT8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力。

图9.免疫组化检测scFv抗体对人胰腺组织的识别能力

A:胰岛细胞HE染色结果；B:C22检测胰岛细胞结果。行1:放大40倍；行2:放大200倍.

具体实施方式

实施例1重组ZnT8原核表达质粒的构建与表达

设计引物ZF和LR(表1)，以ZnT8质粒(购自北京义翘神州生物技术有限公司,HG11621-M)为模板，扩增人ZnT8氨基末端(1-74aa)基因，设计引物LF和CR(表1)，以ZnT8质粒为模板，扩增人ZnT8羧基末端(269-368aa)基因,，PCR产物胶回收后用引物ZF和CR通过overlap构建氨基羧基融合基因。

参考US9023984(B2)序列表中的SEQ ID No.55设计ZnT8羧基末端二聚突变体基因，如SEQ ID No.7所示，并委托生物公司合成，该二聚体含2个人ZnT8羧基末端基因，第一个在325为氨基酸为精氨酸(Arg),第二个在325位为酪氨酸(Trp),该二聚体中2个人ZnT8羧基末端基因通过一段柔性肽链接。设计引物CF和CR用于扩增ZnT8羧基端二聚突变体基因。

表1.引物序列

引物ZF和LR用于扩增ZnT8氨基末端基因(1-74aa),引物LF和CR用于扩增ZnT8羧基末端基因(268-369aa),引物ZF和CR用于overlap扩增ZnT8氨基羧基融合基因，引物CF和CR用于扩增ZnT8羧基端二聚突变体基因。

上述两个重组基因分别经SacI和XbaI双酶切后插入pcoldⅡ质粒中。连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)培养后挑选阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆在LB培养基中37℃扩增至D(600)值达1.0后加入IPTG诱导剂至终浓度为1mM/L，15℃诱导表达24h。4℃，10>

将纯化的人ZnT8氨基羧基融合蛋白包被ELISA板，从1.6ug/孔倍比稀释至0.1ug/孔，检测融合蛋白与商品化的ZnT8抗体结合的量效变化。

ZnT8氨基羧基融合基因约550bp,羧基二聚突变体基因约650bp,PCR产物电泳结果见图1，均成功插入pcoldⅡ载体，测序结果与理论相符。

抗原经表达纯化复性后电泳结果见图2，可见纯化后ZnT8氨基羧基融合肽分子量约20kD，羧基二聚突变体分子量约25kD。

ELISA检测显示ZnT8氨基羧基融合蛋白能与商品化的ZnT8抗体特异性结合，可用于ZnT8特异性scFv的筛选(图3)。

实施例2T1D scFv噬菌体抗体库的构建

实验标本为50位初发的T1D志愿者的外周血。其中31位志愿者血清ZnT8抗体阳性。血清ZnT8抗体水平通过放射免疫配体法进行检测(详细方法参见Gu Y,Zhang M,Chen H,Wang Z,Xing C,Yang H,et al.Discordant association of islet autoantibodies with high-risk hla genes in chinese type 1diabetes.Diabetes/metabolism research and reviews 2011；27:899-905)。所有患者均签署知情同意书。分选T1D志愿者外周血PBMC。提取T1D志愿者外周血PBMC RNA，接着反转录合成cDNA，具体操作步骤按说明书进行。通过RT-PCR方法，用人源单链抗体(scFv)通用引物(表2)扩增重链和轻链，通过overlap PCR链接成scFv,经Sfi I酶切后插入pcomb3XSS质粒(购自BioVector NTCC保藏中心)中。连接产物经过多次电转化入大肠杆菌XL1-Blue(购自Stratagene,Cat.#200228)，用SB培养基扩大培养后加辅助噬菌体VCSM13超感染。次日收集上清经PEG-8000/NaCl沉淀后获得T1D scFv噬菌体抗体库。

表2.人源scFv通用引物序列

上述经RT-PCR后成功扩增抗体重链及轻链，大小约400bp，单链抗体基因条带在750bp左右(图4)，胶回收后插入pcomb3XSS载体中，电转化入大肠杆菌XL1-Blue,经VCSM13超感染后获得噬菌体抗体库，经检测库容为1×10⁸。

1.2.4ZnT8特异性scFv的筛选

将纯化的ZnT8氨基羧基融合蛋白按1μg/孔包被ELISA板，经过4轮的“吸附”、“洗脱”、“扩增”后(Zhang X,Qi X,Zhang Q,Zeng X,Shi Z,Jin Q,et al.Human 4f5single-chain fv antibody recognizing a conserved ha1epitope has broad neutralizing potency against h5n1influenza a viruses of different clades.Antiviral research 2013；99:91-9)，phage-ELISA进行检测。挑选OD值高的阳性克隆提取质粒并送测序，测序结果与人类免疫球蛋白序列(IMGT数据库)(Ehrenmann F,Kaas Q,Lefranc MP.Imgt/3dstructure-db and imgt/domaingapalign:A database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,mhc,igsf and mhcsf.Nucleic acids research 2010；38:D301-7.Lefranc MP,Giudicelli V,Duroux P,Jabado-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,et al.Imgt(r),the international immunogenetics information system(r)25years on.Nucleic acids research 2015；43:D413-22.)进行比对并进行CDR区的划分。

经过4轮的筛选,ZnT8特异性scFv得以富集。每一轮噬菌体滴度见表3。将最后一轮洗脱的噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue后，随机选择160个克隆。Phage ELISA结果显示有23个阳性克隆，其中有11个克隆OD值较高，经测序得到7株scFv。我们对这7株scFv进行了CDR区的划分，均符合人源scFv抗体特征。其中,scFv C27和C22OD值最高，因此我们选择scFv-C22进行了进一步研究。

表3.ZnT8特异性噬菌体抗体的富集

得率(％)＝洗脱后的噬菌体密度(pfu)×100/吸附前的噬菌体密度(pfu)

将测序正确的阳性克隆转化入大肠杆菌Top10F’，挑单克隆菌落接种于含20mM MgCl₂的SB培养基中，37℃振摇8h后加入IPTG至终浓度1mM，37℃诱导表达24h。4℃，10>

细菌沉淀用含8M尿素的磷酸盐缓冲液重悬,置于冰上，用超声破碎细胞仪进行裂解。10000×g 4℃离心30min,上清经0.22μm滤膜过滤后用HisTrap亲和层析柱纯化蛋白。洗脱下的目的蛋白通过浓度梯度透析复性至尿素小于0.125mM,超滤浓缩后得到高浓度蛋白。Western与SDS-PAGE结果表明我们成功表达并纯化了scFv-C22，其分子量约30kD(图5)

实施例3ZnT8特异性scFv的特性分析

Western blot检测：将纯化的重组ZnT8氨基羧基融合蛋白经12％蛋白质胶电泳后转至PVDF膜上，5％牛奶封闭后，用纯化的scFv作为一抗，HRP标记的HA抗体作为二抗，检测scFv-C22与ZnT8的结合活性。结果显示scFv-C22可检测到氨基羧基融合蛋白，在20kD左右可见明显条带，与预期相符，而阴性对照未见条带，说明scFv-C22与ZnT8蛋白具有良好的结合能力(图6)。

亲和力检测:由苏州百拓生物技术有限公司完成。亲和力结果显示scFv-C22与ZnT8氨基羧基融合蛋白具有较高的亲和力，亲和力为5.953×10^-8kD(M)(图7)。

ELISA检测：将纯化的ZnT8羧基末端二聚突变体蛋白按0.5μg/孔包被ELISA板，scFv-C22从1:10倍比稀释至1:20480，检测scFv-C22与ZnT8结合的量效变化。如图8所示,随着scFv-C22浓度的倍比稀释，其与ZnT8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力逐渐降低，说明scFv-C22以浓度依赖方式与ZnT8抗原肽结合。

免疫组化：我们将C22抗体作为一抗，通过间接标记的方法进行免疫组化实验，抗体孵育后的人胰腺组织切片的胰岛细胞呈强阳性，说明C22抗体具有良好的生物活性，能够特异的识别人胰岛β细胞表达的ZnT8蛋白。

以上结果均表明scFv-C22能够与人ZnT8特异性结合。