Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法

摘要

本发明涉及一种Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法。该方法通过年龄‑龄期两性生命表对褐飞虱的生态适合度进行研究，从而阐明Bt水稻对褐飞虱的生态安全性风险；具体包括五个部分：（1）发育历期和寿命；（2）年龄‑龄期存活率；（3）生殖力和种群参数；（4）寿命期望和生殖价值；（5）年龄分布和种群预测；通过五个方面的比较分析综合评价Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的生态风险。本发明在实验室内利用两性种群生命表建立了系统评价Bt水稻非靶标效应的评价方法，对完善Bt水稻对非靶标生物的影响研究以及确定Bt水稻种植的生态安全性具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于转基因作物生态安全风险评价技术领域，尤其是一种Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法。

背景技术

水稻是我国的重要粮食作物，在粮食生产占据着至关重要的战略地位(夏如兵，2009)，同时水稻也是虫害最严重的粮食作物(张文辉和刘光杰，2001)。近年来由于全球气候变暖，二化螟、三化螟、大螟和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫对水稻的为害程度日益严重，给农民带来了严重的经济损失(韩永强等，2008；雷惠质和江建云，1996)。利用基因工程技术培育的转Bt抗虫水稻能够有效地防治鳞翅目害虫，其表达的Bt毒蛋白对靶标害虫有极高的抗性(蔡万伦等，2008；肖汉祥等，2011；徐雪亮等，2013)。然而，靶标害虫生态位的缺失，是否会引起非靶标害虫(叶蝉类，飞虱类等)种群密度的上升，从而由次要害虫转变为主要害虫(Lu et al,2010)。截止目前，全球已有20多个国家种植转基因作物(James，2015)。为确保转基因作物的安全使用，针对非靶标生物的生态安全风险评估是必要的(Yu et al,2011)。

褐飞虱[Nilaparvata lugens()]，属半翅目飞虱科，是亚洲水稻上的一种次要的单食性害虫，主要通过刺吸式口器直接吸取稻株韧皮部的植物汁液为害水稻，并且能传播水稻病毒病(王荣富等，1998)。由于转Bt抗虫水稻表达的Bt蛋白的主要靶标对象是鳞翅目昆虫，褐飞虱属于非靶标害虫。生命表一直是研究昆虫生态学的重要工具。然而传统雌性年龄生命表由于忽略龄期重叠、不考虑雄性个体及不包含成虫前期死亡率，从而使得到的种群参数存在偏差，不能确切反映昆虫种群的实际动态(Chi and Liu,1985；Huang and Chi,2012；吴坤君等，1994)。为了改进和补充传统生命表的不足、不完整，Chi和Liu(1985)提出了两性生命表理论，并在种群生态学研究中得到广泛应用(Li et al,2015；Tuan et al,2016；Wang et al,2016；Yin et al,2013)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法，该方法通过构建褐飞虱在Bt水稻和对照非转基因水稻上的实验种群年龄-龄期两性生命表，从种群生态学角度系统地研究Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱生长发育、寿命以及繁殖的影响，旨在提供一种系统、准确、简便、科学的转基因水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法，包括如下步骤，

S1：计算并记录褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上包括发育历期、寿命以及生殖力的参数；

S2：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的年龄-龄期存活率；

S3：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的生殖力和种群动态参数；

S4：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的寿命期望和生殖价值；

S5：分析褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的稳定年龄-龄期分布和种群预测。

在本发明一实施例中，所述Bt水稻选择转cry1Ab基因抗虫水稻mf-MH3301-1，所述对照非转基因水稻为对照亲本非转基因水稻MH3301。

在本发明一实施例中，所述步骤S1中是通过Bootstrap方法来计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上包括发育历期、寿命以及生殖力的参数。

在本发明一实施例中，所述S2-S5采用年龄-龄期两性生命表方法，具体即通过年龄-龄期两性生命表计算机程序Twosex-MS Chart对步骤S1记录参数进行分析获得年龄-龄期存活率、生殖力、种群动态参数、寿命期望、生殖价值、稳定年龄-龄期分布和种群预测。

在本发明一实施例中，所述褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的种群动态参数计算公式如下：

λ＝e^r；GRR＝Σm_x

其中，n是褐飞虱全龄期数，x和i为年龄，j为龄期；l_x指整个种群存活到年龄x的概率；S_xj指新孵化个体存活到x年龄j龄期的概率；m_x指种群在年龄x的平均产卵量；f_xj指雌成虫在年龄x的平均产卵量；R₀为净增殖率；r为内禀增长率；λ为周限增长率；T为世代平均周期；GRR为总繁殖力GRR；R_x为年龄特征增殖率。

在本发明一实施例中，褐飞虱在玻璃试管中单头饲养，该玻璃试管直径3cm高度20cm。

相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明通过Bootstrap(n＝100000)方法来计算褐飞虱的发育历期、寿命、生殖力、种群数量，以及种群动态参数等的标准误(SE)，并通过程序Twosex-MS Chart的paired bootstrap test功能来比较取食两种水稻的褐飞虱发育历期、生殖、寿命、种群参数等的差异。

附图说明

图1为本发明方法流程图。

图2是褐飞虱在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上的年龄-龄期存活率曲线(s_xj)。

图3是在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上褐飞虱的种群年龄特征存活率(l_x)、年龄-龄期特征生殖力(f_xj)、种群年龄特征生殖力(m_x)、种群年龄特征生殖值(l_xm_x)。

图4是褐飞虱在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上的寿命期望(e_xj)。

图5是褐飞虱在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上的生殖价值(v_xj)。

图6是褐飞虱在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上的稳定年龄分布。

图7是褐飞虱在Bt水稻(A)和非转基因水稻(B)上的种群大小预测。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术方案进行具体说明。

如图1所示，本发明的一种Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱的安全性评价方法，包括如下步骤，

S1：计算并记录褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上包括发育历期、寿命以及生殖力的参数；

S2：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的年龄-龄期存活率；

S3：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的生殖力和种群动态参数；

S4：计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的寿命期望和生殖价值；

S5：分析褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的稳定年龄-龄期分布和种群预测。

所述Bt水稻选择转cry1Ab基因抗虫水稻mf-MH3301-1，所述对照非转基因水稻为对照亲本非转基因水稻MH3301。

所述步骤S1中是通过Bootstrap方法来计算褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上包括发育历期、寿命和生殖力的参数。

所述S2-S5采用年龄-龄期两性生命表方法，具体即通过年龄-龄期两性生命表计算机程序Twosex-MS Chart对步骤S1记录参数进行分析获得年龄-龄期存活率、生殖力、种群动态参数、寿命期望、生殖价值、稳定年龄-龄期分布和种群预测。

所述褐飞虱在Bt水稻及其对照非转基因水稻上的种群动态参数计算公式如下：

λ＝e^r；GRR＝Σm_x

其中，n是褐飞虱全龄期数，x和i为年龄，j为龄期；l_x指整个种群存活到年龄x的概率；S_xj指新孵化个体存活到x年龄j龄期的概率；m_x指种群在年龄x的平均产卵量；f_xj指雌成虫在年龄x的平均产卵量；R₀为净增殖率；r为内禀增长率；λ为周限增长率；T为世代平均周期；GRR为总繁殖力GRR；R_x为年龄特征增殖率。

褐飞虱在玻璃试管中单头饲养，该玻璃试管直径3cm高度20cm。

以下为本发明的具体实施例。

本发明的供试水稻为转cry1Ab基因抗虫水稻mf-MH3301-1和对照亲本非转基因水稻MH3301，水稻品种均由福建省农科院农业遗传工程重点实验室提供。

褐飞虱采自福建农林大学植物病毒研究所，后在福建农林大学应用生态研究所气候箱(温度28士1℃，RH 80％士l％，光照L:D＝16:8)中分别用转cry1Ab基因抗虫水稻及其对照非转基因水稻连续饲养多年至今。

分别取45日龄两种水稻苗10株分别放入10个大玻璃试管中水培，每个玻璃试管接入1头怀卵雌褐飞虱，用100目的纱布密封，在人工气候箱(温度28士1℃，RH 80％士l％，光照L：D＝16/8)产卵24h后，将褐飞虱移走。每日定时观察并记录卵的孵化情况。选取刚孵化的若虫分别用对应的转基因和非转基因水稻苗单管(直径3cm高度20cm)饲养，每个处理69头褐飞虱，供试水稻苗每隔10d更换一次，水培液每隔2d更换1次，每天定时记录褐飞虱蜕皮、羽化、死亡等情况。等褐飞虱羽化12h内取对应水稻品种上的褐飞虱成虫配对，分别记录其每日产卵量并更换产卵的水稻苗，直至雌虫死亡。当褐飞虱成虫全部死亡后整个实验结束。

褐飞虱所有个体的发育历期、存活情况、雌虫日产卵量等原始数据通过年龄-龄期两性生命表计算机程序Twosex-MSChart(Chi,2015)来进行分析，从而获得许多生命表参数。如：年龄-龄期特征存活率S_xj，年龄特征存活率l_x，年龄特征生殖力m_x，f_xj年龄-龄期特征生殖力，年龄-龄期特征寿命期望e_xj，年龄-龄期特征生殖价值v_xj(x＝年，j＝龄期)，内禀增长率r，周限增长率λ，净增殖率R₀，世代平均周期T，总繁殖力GRR，产卵前期APOP，总产卵前期TPOP。

其中，l_x指整个种群(包括雌、雄褐飞虱及未发育至成虫死亡的所有个体)存活到年龄x的概率，s_xj指新孵化个体存活到x年龄j龄期的概率。f_xj指雌成虫在年龄x的平均产卵量,m_x指种群在年龄x的平均产卵量。e_xj指种群个体到x年龄j龄期的预期寿命，v_xj指种群个体在x年龄j龄期对下一代的平均贡献值。产卵前期指从褐飞虱羽化到第一次产卵的时间，总产卵前期指从卵发育到成虫开始产卵的时间。

种群动态参数计算公式如下：λ＝e^r；GRR＝Σm_x；

其中，n是褐飞虱全龄期数，x和i为年龄，j为龄期；l_x指整个种群存活到年龄x的概率；S_xj指新孵化个体存活到x年龄j龄期的概率；m_x指种群在年龄x的平均产卵量；f_xj指雌成虫在年龄x的平均产卵量；R₀为净增殖率；r为内禀增长率；λ为周限增长率；T为世代平均周期；GRR为总繁殖力GRR；R_x为年龄特征增殖率。

(1)褐飞虱在Bt水稻及其对照上的发育历期、寿命以及生殖力等参数

由表1所示，除一龄和五龄外，褐飞虱各龄期的发育时间在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因对照MH3301没有显著差异(P＞0.05)。其中褐飞虱一龄在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因对照MH3301的发育时间分别为2.43天和2.77天，差异达到极显著水平(P＜0.01)。褐飞虱五龄在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因对照MH3301的发育时间分别为3.82天和4.20天，达到显著差异(P＜0.05)。褐飞虱在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因对照MH3301上的雌虫寿命、雄虫寿命和总体寿命均没有显著差异(P＞0.05)。雌褐飞虱在Bt水稻mf-MH3301-1上的生殖力显著大于非转基因对照MH3301(P＜0.01)；而产卵前期和总产卵前期却没有显著差异(P＞0.05)。

表1

表中数据是平均值±标准误，同一行数据后不同字母分别表示经paired bootstrap test检验差异显著。

(2)褐飞虱在Bt水稻和非转基因对照上的年龄-龄期存活率

年龄-龄期存活率s_xj指新孵化个体存活到x年龄j龄期的概率。由于昆虫个体之间以及雌雄之间发育速率的差异，因此存在明显的重叠现象。年龄-龄期存活率曲线(s_xj)不仅描述了不同龄期褐飞虱在两种水稻上随时间变化的存活情况，并且能够反映龄期分化和龄期重叠现象，所以年龄-龄期存活率曲线(s_xj)更准确的描述了取食两种水稻的褐飞虱种群发育以及存活率的变化情况。从卵期到成虫之前，褐飞虱在两种水稻上的存活率曲线基本相似。然而在成虫阶段，取食Bt水稻mf-MH3301-1的褐飞虱雄虫的存活率明显低于雌虫；取食非转基因对照MH3301的褐飞虱雌雄虫的存活率并无显著差异。当第五龄若虫在26d存活率降为零时，褐飞虱成虫的存活率达到最大值(图2，其中A>

(3)褐飞虱在转基因抗虫水稻及其对照上的生殖力和种群动态参数

年龄特征存活率l_x指整个种群(包括雌、雄褐飞虱及未发育至成虫死亡的所有个体)存活到年龄x的概率。与取食非转基因水稻MH3301相比，随着年龄增加取食Bt水稻mf-MH3301-1的褐飞虱年龄特征存活率(l_x)下降速度明显比较缓慢。年龄-龄期特征生殖力f_xj指雌成虫在年龄x的平均产卵量,年龄特征生殖力m_x指种群在年龄x的平均产卵量。取食Bt水稻mf-MH3301-1的褐飞虱年龄-龄期特征生殖力(f_xj)和种群年龄特征生殖力(m_x)显著高于对照MH3301，因此取食Bt水稻mf-MH3301-1的褐飞虱的种群年龄特征生殖值(l_xm_x)也显著高于对照MH3301。当褐飞虱在Bt水稻上取食时，第43d达到最大生殖力13.5；然而在非转基因水稻上取食时，第49d才达到最大生殖力10，延缓了6d(图3，其中A>

由于总生殖力GRR＝∑m_x，净增殖率因此取食mf-MH3301-1的褐飞虱的总生殖力和净增殖率显著高于对照MH3301，是其2倍多(P＜0.05)。同理，取食mf-MH3301-1的褐飞虱的内禀增长率r和周限增长率λ也显著大于对照MH3301(P＜0.05)。而褐飞虱在两种水稻上的世代平均周期T并无显著差异(P＞0.05)(表2)。

表2

注：表中数据是平均值±标准误，同一行数据后不同字母分别表示经paired bootstrap test检验差异显著。

(4)褐飞虱在两种水稻上的寿命期望和生殖价值

年龄-龄期寿命期望e_xj指种群个体到x年龄j龄期的预期寿命。考虑到性别以及个体之间发育速率的差异，利用褐飞虱在两种水稻上的寿命期望曲线，可以看到不同性别以及不同龄期寿命期望的变化。卵期初始零点的寿命期望(e_0,1)即为种群寿命的值，这和表1中的寿命相同。随着时间的增加，褐飞虱在两种水稻的寿命期望均逐渐降低。但是，在Bt水稻上褐飞虱雌虫的寿命期望高于雄虫；而在非转基因对照上却恰恰相反，褐飞虱雄虫的寿命期望高于雌虫(图4，其中A>

年龄-龄期生殖价值v_xj指种群个体在x年龄j龄期对下一代的平均贡献值。卵期在零点对应的生殖价值(v_0,1)即为褐飞虱种群在两种水稻上的周限增长率。随着龄期的增加，褐飞虱个体的对后代的生殖价值越来越高，在雌虫阶段达到最大值。在Bt水稻和非转基因对照上，最大生殖价值分别为(v_37,7＝_50.89)和(v_35,7＝_36.05)。其中，褐飞虱在第五龄和雌成虫阶段，在Bt水稻上取食褐飞虱的生殖价值高于非转基因对照(图5，其中A>

(5)褐飞虱在两种水稻上的稳定年龄-龄期分布和种群预测

如图6所示(其中A Bt水稻mf-MH-3301-1，B非转基因水稻MH3301)，根据年龄-龄期两性生命表数据分别求得在理想条件下(食物、空间不受限制，无天敌干扰)褐飞虱在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因水稻MH3301上的稳定年龄-龄期分布。其中，褐飞虱在Bt水稻上的最终稳定年龄分布是：卵期＝60.42％，若虫期＝34.00％成虫期＝5.58％。褐飞虱在非转基因水稻上的最终稳定年龄分布是：卵期＝52.26％，若虫期＝39.48％，成虫期＝8.26％。

如图7所示(其中A Bt水稻mf-MH-3301-1，B非转基因水稻MH3301)，褐飞虱在Bt水稻mf-MH3301-1和非转基因水稻MH3301上的种群增长速率预测。通过年龄-龄期两性生命表构建的种群预测很容易描述出龄期结构的变化趋势。由于年龄-龄期两性生命表可以描述龄期分化，褐飞虱每个龄期都可以显示出来。

以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。