鸡PTHLH基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用

摘要

本发明涉及一种鸡PTHLH基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在育种中的应用，鸡PTHLH 5′调控区存在2个突变位点，即‑1827(A>G)和‑165(C>T)位点，并用SHEsis在线软件进行了连锁不平衡分析，结果发现隐性白洛克鸡中这两个位点呈现完全连锁状态。两个位点均与开产日龄及32周产蛋数相关，AC/GT基因型的开产日期极显著早于GT/GT和AC/AC基因型，同时32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型。本发明方法简便快捷，并且有助于选育开产早、产蛋数多的鸡品种，为标记辅助育种工作提供有利的帮助。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡PTHLH基因5′调控区的两个突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。

背景技术

甲状旁腺激素样激素(Parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)也叫甲状旁腺相关蛋白(Parathyroid hormone-related hormone,PTHrP)，首次发现于20世纪80年代，被认为是引起恶性肿瘤伴发的体液高钙血症的主要原因(Moseley et al,1987)。PTHLH广泛分布于骨骼、胰腺、乳腺、肾脏、胃、子宫等多种胎儿及成年组织中，通过旁分泌、自分泌、细胞内分泌等形式起作用，生物学功能涉及钙转运(Weir et al,1996；Miao et al,2004；Martin et al,2005)、骨形成(Cuthbertson et al,1999；Zhao et al,2002；Pinheiro etal,2010；Klopocki et al,2010)、平滑肌收缩及妊娠的维持(Thiede et al,1990；Fegusonet al,1994；Guo et al,2012；Erbach et al,2013)、细胞生长与分化的调控(Vasavada etal,1996；Wojcik et al,1998；Aya et al,1999)等多个方面。

分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精准度。基因表达是生命过程中的细胞把储存在DNA序列上的遗传信息经过转录和翻译，转变成蛋白质的过程。其中，转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。因此，研究鸡PTHLH的5′调控区的SNPs，有助于找到有意义的分子标记，为鸡的标记辅助选择育种提供有利的理论依据。

发明内容

根据现有技术，具体涉及了一种鸡PTHLH基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在育种中的应用。发明人发现鸡PTHLH 5′调控区存在2个突变位点，即-1827(A>G)和-165(C>T)位点，并用SHEsis在线软件进行了连锁不平衡分析，结果发现这两个位点在隐性白洛克鸡中呈现完全连锁状态。因此对其进行单个位点标记分析，结果发现两个位点均与开产日龄及32周产蛋数相关，AC/GT基因型的开产日龄极显著早于GT/GT和AC/AC基因型，同时32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型。可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育种工作提供有利的帮助。

本发明的具体标记方法是：

采用标记引物P-PTHLH，包括

P-PTHLH-F，其序列如Seq ID No:1所示；

P-PTHLH-R，其序列如Seq ID No:2所示；

扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如Seq ID No:3所示，结果检测到存在2个突变位点，即-1827(A>G)和-165(C>T)位点。

在开产晚的群体中，选择AC/AC纯合基因型和GT/GT纯合基因型的公母鸡通过相互交配得到AC/GT杂合基因型，由这样个体组成的群体具有开产早、产蛋数多的特点。

通过这种标记方法得到的AC/GT基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加AC/GT基因型的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产提前，从而实现早期选种。

(四)附图说明

图1为P-PTHLH-F/R引物PCR扩增的片段电泳图，

图2为鸡PTHLH 5′调控区-1827(A>G)(正向)、-165(C>T)(反向)位点的多态性测序图；

图3为隐性白洛克鸡中2个多态位点的连锁不平衡关系图；

图4为构建点突变pGL3-载体后序列比对结果；

图5为wt-PTHLH和mut-PTHLH两种基因型及FSH处理后双荧光素酶报告基因启动活性检测示意图；

(五)具体实施方式

实施例1鸡PTHLH 5′调控区序列比对及多态性位点分析

1.试验材料

48只隐性白洛克鸡(山东纪华家禽育种有限公司)，随机采样，翅静脉采血，提取基因组后，-20℃保存。

2.试验方法

2.1引物设计

根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006088.4)设计引物P-PTHLH(其序列详见表1和Seq ID No:1/Seq ID No:2)，此引物是为研究鸡PTHLH 5′调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。

2.2PCR扩增

随机选取48只隐性白洛克鸡基因组，用引物P-PTHLH进行PCR扩增。引物见表1，反应体系20μL，其中包括1μL基因组DNA(50-100ng)，10Μl2×PrimeSTAR GC Buffer，1.6μLdNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各0.5μL(10μM)，0.1μLPrimeSTAR HSDNApolymerase(5U/μL，TaKaRa)，ddH₂O补足至20μL。扩增程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，进行35个循环；循环结束72℃孵育5min。

将48只个体的PCR扩增产物随机混合分为6组，每组8个个体，进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN)进行回收，送济南铂尚生物技术公司测序。

表1引物的序列、位置和退火温度

3.结果与分析

PCR产物电泳见附图1，目的片段2144bp。

使用DNAMAN version 7.0比对序列同源性和完成突变核苷酸的检索，用ChromasPro软件对测序结果分析，发现扩增的隐性白洛克鸡PTHLH5′调控区-1827(A>G)和-165(C>T)位点存在SNP(见附图2)。

实施例2鸡PTHLH5′调控区多态性与开产日龄和产蛋量的关联分析

1试验材料

随机选取50只济宁百日鸡(济宁大唐百日鸡保种场)、50只新杨褐鸡(上海家禽育种有限公司)、50只汶上芦花鸡(山东省济宁市汶上县)、45只海兰褐鸡(山东泰安海兰褐育种公司)和有产蛋记录的隐性白洛克鸡550只(山东纪华家禽育种有限公司)。以上均为随机采样，翅静脉采血，提取基因组后，-20℃保存。

2试验方法

2.1PCR扩增

以基因组为模版，进行PCR扩增。引物见表1，反应体系40μL，其中包括2μL基因组DNA(50-100ng)，20μL2×PrimeSTARGCBuffer，3.2μL dNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各1μL(10μM)，0.4μLPrimeSTAR HSDNA polymerase(5U/μL，TaKaRa)，ddH₂O补足至40μL。扩增程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，进行35个循环；循环结束72℃孵育5min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNAGel Extraction Kit，AXYGEN)进行回收，送济南铂尚生物技术公司测序。

2.2单倍型构建及关联分析

利用DNAMAN version 7.0和ChromasPro对突变位点进行统计分析，R软件统计基因型和基因型频率，SHEsis软件构建单倍型。

数据统计采用SAS8.1统计软件包的GLM程序进行基因型与性状(产蛋数、开产日龄)的关联分析。不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准误表示(LSM±SE)，显著水平设定P<0.05。

3结果与分析

3.1PTHLH 5′调控区2个突变位点在不同品种中基因型和等位基因频率的分布

用SHEsis在线软件分析PTHLH 5′调控区2个突变位点在隐性白洛克鸡中的连锁不平衡关系，结果表明：两个呈现完全连锁状态(附图3)。统计了白洛克、文昌鸡、济宁百日鸡和汶上芦花鸡品种的基因型和等位基因频率。分析结果见表2。

由表2到表3可知，隐性白洛克550个个体中，-1827(A>G)、-165(C>T)位点的优势等位基因分别为A、C；野生纯合基因型和杂合基因型的频率均高于突变纯合基因型。不同品种中基因型频率及等位基因频率存在差异。

表2-1827多态位点的基因型和等位基因频率在不同品种中的分布

表3-165多态位点的基因型和等位基因频率在不同品种中的分布

3.2PTHLH 5′调控区-1827(A>G)、-165(C>T)位点多态性分析及其与生产性能的关联分析

3.2.1隐性白洛克中PTHLH 5′调控区-1827(A>G)、-165(C>T)位点多态性与生产性能的关联分析

在550只隐性白洛克群体，分析PTHLH 5′调控区-1827、-165位点对开产日龄(AFE)、32周产蛋数(E32)及48周产蛋数(E48)的效应，结果48周产蛋数未达到显著水平(P>0.05),但是开产日龄与32周产蛋数均达到P<0.01的统计极显著水平，分别为AG型和CT型的个体开产较早。表明两个突变位点杂合基因型均与开产早、32周产蛋高的性状有关联。

表4白洛克中不同基因型与开产日龄及产蛋数的关联分析

注：表中数值为AFE(开产日龄)和E32(32周产蛋量)的最小二乘均值±标准误，不含相同字母最小二乘均值间差异极显著(P＜0.01)。

3.3PTHLH 5′调控区-1827和-165位点单倍型分析及其与生产性能的关联分析

3.3.1PTHLH 5′调控区单倍型在不同品种中的分布

用PHASE软件对鸡PTHLH基因5′调控区-1827和-165突变位点构建单倍型，只有三种单倍型：GT、GC和AC。由表5看出，鸡PTHLH基因5′调控区-1827和-165突变位点构建的单倍型，其频率在5个品种中存在差别，隐性白洛克鸡、汶上芦花鸡均以AC单倍型占优势，海兰褐、新杨褐和济宁白日鸡以GT单倍型占优势。

表5PTHLH 5′调控区单倍型在不同品种中的分布

3.3.2白洛克中PTHLH 5′调控区双倍型与开产日龄(AFE)、产蛋数(E32)的关联分析

统计了550个有生产记录的白洛克个体，对-1827和-165两位点基因型构建双倍型进行联合分析，结果(表6)显示基因型与开产日龄(P＝0.0008)及32周产蛋数(P＝0.0002)关系达到了极显著水平，AC/GT对应较小的开产日龄(176.46d)及较多的32周产蛋数(35.8个)，GT/GT和AC/AC对应较大的开产日龄(约179d)及较少的32周产蛋数(33个)。

表6双倍型与开产日龄及产蛋数的最小二乘均值及标准误

注：表中数值为AFE(开产日龄)和E32(32W产蛋量)的最小二乘均值±标准误，不含相同字母最小二乘均值间差异极显著(P＜0.01)。

实施例3鸡PTHLH 5′调控区多态位点对基因表达的影响

1试验材料

随机采样泰安市临溪村养殖场的高峰产蛋期的健康海兰褐鸡(3-5只)，

2试验方法

2.1PTHLH 5′调控区多态位点突变型荧光素酶表达载体的构建

1)在隐性白洛克群体中选PTHLH 5′调控区-1827和-165位点分别为野生型和突变型的个体两只，以其DNA为模板来获得wt-PTHLH和mut-PTHLH序列，扩增片段长度为2144bp，引物序列同Seq ID No.1和2。

2)PCR扩增

扩增反应采用高保真酶PrimeSTAR，反应体系(20ul)包括：2×PrimeSTARGCBuffer 10ul，1.6μL dNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，加NheI和KpnI酶切位点的上下游引物各0.5μL(10μM)，2μLPrimeSTARHSpolymerase(5U/μL，TaKaRa)，1μL基因组DNA，ddH₂O补足至20μL。扩增程序：94℃预变性4min；98℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，进行35个循环；循环结束72℃，孵育5min。

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNAGel Extraction Kit，AXYGEN)进行回收，然后进行连接转化，提取质粒后，酶切验证，选择阳性克隆菌液送济南铂尚生物技术公司测序，分析突变位点是否分别是野生型和突变型。

3)去内毒素质粒的制备

用TIANGEN公司的EndoFree Maxi Plasmid Kit去内毒素质粒大提试剂盒，按照说明书进行操作。

将构建好的wt-PTHLH和mut-PTHLH载体质粒，重新转化感受态细胞，挑取单克隆菌落，进行摇菌，用TIANGEN公司的去内毒素质粒大提试剂盒提取双荧光素酶表达载体质粒，用于原代细胞的转染。

2.2鸡卵泡膜细胞的分离培养

1)高峰期产蛋海兰褐母鸡，手术刀划开颈脉，放血处死后用灭菌剪刀刨开腹腔，剪下整个卵巢(注意不要将卵泡弄破)，然后迅速投放至盛有3％双抗的磷酸缓冲液的烧杯中，封上锡箔纸后，带入无菌间进行分离操作。

2)分离方法依据Gilbert(1997)及康丽(2009)等的文献进行。

在超净台上，将各级卵泡分为等级前卵泡(<12mm)和等级卵泡(>12mm)，用眼科剪刀从卵泡蒂处剪开取下，放至盛有3％双抗的磷酸缓冲溶液的灭菌的平皿中，左手用眼科镊子夹住卵泡蒂处，右手用眼科镊子顺着卵泡将膜细胞层剥离下来，放入磷酸缓冲溶液中，并冲洗两三次，以尽量洗去膜层上残留的血管，从而分离到纯度较高的膜细胞。

3)分离完成后，在灭菌的小烧杯中用眼科剪刀将膜细胞层充分剪碎，之后加入适量已预热的0.1％II型胶原酶，放入38℃、5％CO₂培养箱中消化25min，每5min晃动一次烧杯以充分消化组织，消化后加入含有血清的M199培养基以终止消化。

4)在超净台上用200目铜网将消化完毕的细胞混合液，过滤至100mL灭菌的烧杯中，然后分装到15mL离心管中，4000rpm离心8min，收集细胞沉淀，弃去滤液；每管再加适量M199培养基轻轻吹打，重悬细胞沉淀，离心弃滤液，共三次。

5)离心洗涤完后，吹匀细胞，取少量细胞悬液放入等体积的0.1％台盼蓝，用血球计数板进行计数，计算细胞存活率应在90％以上；按所需的细胞量接种在12孔培养板，每孔细胞数1～2×10⁶为宜，38.5℃静置培养，CO₂浓度为5％。

6)接种的细胞在12小时后进行部分换液，24小时后可进行全部换液。当细胞培养至80％以上汇合率时，方可进行转染实验。

2.3质粒DNA转染实验

1)转染前两小时换液，更换新鲜的完全培养基。

2)制备Nanofection/DNA混合液(12孔板)a.每孔1μgDNA质粒+100uL无血清高糖DMEM与1.5mL离心管中，轻轻混匀；b.按照每孔2μLNanofection加入量，轻轻蜗旋(移液枪轻轻吹打5～10s)；c.室温孵育15min，使形成Nanofection/DNA复合体。

3)每孔加入100uLNanofection/DNA复合体，轻晃培养板使其均匀分布。

4)38.5℃5％CO₂培养箱内静置培养，24小时后换液，实验组用10ng/ml>

5)阴性对照pGL3-Basic载体以相同的条件作为对照组共转染培养的细胞。相同的转染共做2次，膜细胞来自于不同的鸡个体，即做了两个独立的转染实验。

2.4双荧光素酶活性测定

用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System双荧光素酶报告基因检测试剂盒，来检测报告基因的表达水平，严格按照说明书进行如下操作：

1)细胞的裂解：用PBS缓冲液洗涤细胞2～3次，加入100μl 1×PLB细胞裂解液，充分混匀，于37℃摇床15min以保证PLB裂解液充分将细胞裂解；

2)充分裂解后，10,000～15,000×g离心3～5min，取20μl上清用于测定；

3)融解萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶检测试剂，并达到室温。按照每个样品需100μl的量加入LARII试剂，反复吸打2～3次混匀。开启荧光测定仪，开始读数，记录下萤火虫荧光素酶的活性值M1。

4)然后加入100μl的Stop&Glo Reagent，将样品管重新放入luminometer中，开始读数。记录下Renilla荧光素酶值M2。

5)在内参为Renilla荧光素酶的情况下，用测定得到的萤火虫荧光素酶RLU值除以测定得到的Renilla荧光素酶RLU值。根据所得的M1/M2值即为报告基因的相对表达水平。

2.5统计分析

数据统计采用t检验，进行两两比较，数据用平均数±标准误表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

3结果与分析

3.1多态位点突变测序

点突变过程的PCR扩增使用高保真酶，有力的保证了不同等位基因间除突变位点外其他序列的一致性，突变结果如图4。

3.2野生型和突变型报告基因的启动活性

双荧光素酶报告基因检测结果如图5和表7所示，FSH能显著提高wt-PTHLH(AC/AC)野生型和mut-PTHLH(GT/GT)突变型的启动效率(P<0.05)，mut-PTHLH(GT/GT)突变型的启动效率极显著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型(P<0.0001)，且mut-PTHLH(GT/GT)突变型对FSH的应答也极显著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型(P<0.0001)。

表7PTHLH5`调控区不同基因型对PTHLH基因启动活性的影响

综合以上结果：

通过以上5个鸡品种比较，表明PTHLH基因在-1827和-165位点存在碱基突变，且在不同品种中存在不同的连锁不平衡关系，其中，隐性白洛克鸡中该两个位点是完全连锁。在白洛克鸡中该两个位点基因型与繁殖性状相关，AC/GT基因型个体开产日龄极显著早于GT/GT和AC/AC基因型个体(P<0.001)，且32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型(P<0.001)。双荧光素酶检测结果表明FSH能显著增加GT/GT突变型和AC/AC野生型的启动效率(P<0.05)，GT/GT型的启动效率极显著高于AC/AC型(P<0.0001)，对FSH的应答也极显著高于AC/AC型(P<0.0001)。

由此，通过这种标记方法得到的AC/GT型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加AC/GT的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。具体示例如下：

白洛克鸡原属兼用型，于1937年美国着手向肉用型改良，后经不断改良，鸡的体型外貌与生产性能均有很大改变，现主要作肉鸡配套杂交母系使用。开产日龄(60％以上产蛋率)164～208天，其年产蛋数在150～160枚。表6白洛克群体的数据分析结果显示：GT/GT与AC/AC型个体的平均开产日龄约179天，32周龄平均产蛋数均为33枚；AC/GT型个体的开产日龄平均为176天，32周龄产蛋数平均为35.8枚。所以，应选育AC/GT型鸡。

通过以上育种得到的AC/GT型能兼顾开产日龄和产蛋数，可以进一步提高整个群体的产蛋性能。