一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子及在乳腺癌基因治疗中的应用

摘要

一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子及其在乳腺癌基因治疗中的应用，属于靶向基因技术领域。本发明的目的是根据编码人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)设计并构建脱氧核酶分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明所设计的脱氧核酶分子是一种能够识别并切割靶基因序列的小核酸分子，不仅具有高的靶基因序列切割能力，同时具有反义寡核苷酸的化学稳定性，合成成本低。通过脱氧核酶分子对靶基因SALL mRNA序列的有效识别和高效切割，来抑制乳腺癌的增殖、迁移与浸润，最终构建一类通过抑制SALL4表达来实现乳腺癌基因治疗的小核酸类药物。

说明书

技术领域

本发明属于靶向基因技术领域，具体涉及一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子及其在乳腺癌基因治疗中的应用。

背景技术

《全球癌症报告2014》显示，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。同时，我国肿瘤发病率多年来持续上升，已成为一个必须高度重视的社会问题。2015年，中国癌症总发病429.16万例，总死亡281.42万例。癌症的临床治疗方案目前主要包括化学疗法、放射疗法和手术治疗等。然而，长期化学治疗极易产生肿瘤的多药耐药现象，放射疗法和手术疗法难以实现肿瘤的彻底根治，同时以上策略中严重的毒副作用给患者了带来极大的痛苦。因此，构建一种高效、安全的肿瘤治疗策略，对于解决这一人类顽疾具有重要的意义。

与常规的治疗策略相比，基因治疗作为一种从根本上治疗疾病的新兴手段，成为目前国际学术界研究的焦点，有望成为未来肿瘤临床治疗中的“新宠”。基因治疗，是指通过基因转移技术将外源基因引入病变的靶细胞或者组织，通过目的基因的表达，纠正或补偿缺陷基因，关闭或抑制异常表达的基因，恢复组织或器官的正常功能，从而达到治疗目的的一种新型治疗方法。人类SALL4基因是果蝇属基因Drosophila spalt的同源异形基因，位于20号染色体的q13.2。该基因共有4个外显子，有两种亚型，即SALL4A和SALL4B，其差异是由于基因内部外显子2的不同剪接机制所导致的。通常，SALL4的表达只是在胚胎中，在成熟组织中是沉默的。近年研究显示，在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤等诸多实体瘤中均检测到SALL4的过表达。由此可见，SALL4可能是一个关键的癌基因，在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用。因此，以SALL4基因为作用靶点，开发小分子化学物、小干扰RNA等，降低该基因的表达水平，有望成为肿瘤临床治疗中的新型策略。

脱氧核酶(Deoxyribozyme,DNAzyme)是一类能够特异性地识别并切割靶基因mRNA的单链DNA片段，因而能够降低致病基因的表达水平，达到预防及治疗疾病的目的，同时不会对细胞基因组产生任何副作用。目前，已经通过人工模拟的方法，合成了几十种脱氧核酶，包括10-23型脱氧核酶、8-17型脱氧核酶、“手枪型”脱氧核酶等。其中，10-23型脱氧核酶研究最为广泛，它是由一个活性中心和两个靶基因结合臂所组成，活性中心序列高度保守，靶基因结合臂与靶基因mRNA通过碱基互补特异性结合，进而活性中心可以切割mRNA，下调靶基因的表达水平。与小干扰RNA相比，脱氧核酶具有更高的靶基因mRNA切割效率，对肿瘤生长的抑制效果更为有效，同时脱靶效率更低，副作用低，具有广阔的应用前景。同时，脱氧核酶的化学本质为脱氧寡核苷酸，其还具有如下优势：(1)分子量小，性质相对稳定，对底物的趋近性好；(2)催化效率及特异性高；(3)易于合成，价格低廉。总之，脱氧核酶由于其精准的靶基因mRNA序列识别及切割能力，已成为一类重要的肿瘤特异性抑制剂，有望成为未来肿瘤基因治疗中的一类新型小核酸基因药物。

发明内容

本发明的目的是根据编码人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)设计并构建脱氧核酶分子，通过脱氧核酶分子对靶基因SALL mRNA序列的有效识别和高效切割，来抑制乳腺癌的增殖、迁移与浸润，最终构建一类通过抑制SALL4表达来实现乳腺癌基因治疗的小核酸类药物。

本发明中所采用的脱氧核酶分子为10-23型脱氧核酶，是一类能够特异性地识别并切割靶基因mRNA的单链DNA片段，具体序列包括：一个活性中心和两个靶基因结合臂组成，活性中心序列高度保守(由15个脱氧核糖核苷酸组成，其序列为5’-GGCTAGCTACAACGA-3’)，靶基因结合臂(由9个脱氧核糖核苷酸组成)与靶基因mRNA通过碱基互补特异性结合，其切割位点为5’-R↓Y-3’(R不形成碱基配对，Y则必须与脱氧核酶形成碱基配对)。

本发明的脱氧核酶分子的序列如下之一所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：

1.5’-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3’

2.5’-CTTTAGGTA GGCTAGCTACAACGA CACCACAGA-3’

3.5’-CTTGGGGAA GGCTAGCTACAACGA TTATAGTTT-3’

4.5’-CTGGAAGGA GGCTAGCTACAACGA TGTGGTTTC-3’

本发明中脱氧核酶分子可以通过修饰来增加稳定性，组成脱氧核酶的磷酸酯基团可以在天然磷酸二酯键部分的自由单键氧位置进行修饰，其中可以是氧、或是甲氧基、或是硫。

本发明所涉及脱氧核酶能够通过对mRNA序列的识别切割，降低SALL4的表达水平，通过诱导细胞发生凋亡和周期阻滞来实现对乳腺癌增殖的抑制，同时能够降低乳腺癌细胞的迁移浸润能力。

综上，本发明所设计的脱氧核酶分子是一种能够识别并切割靶基因序列的小核酸分子，不仅具有高的靶基因序列切割能力，同时具有反义寡核苷酸的化学稳定性，合成成本低。通过对靶基因SALL4mRNA序列的高效切割，脱氧核酶能够实现对乳腺癌增殖、迁移与浸润能力的抑制，有望成为一类有效的恶性肿瘤基因治疗药物。本发明的实施，将对解决恶性肿瘤这一人类顽疾具有重要的意义，将产生重大的经济和社会效益。

附图说明

图1靶基因SALL4mRNA的二级结构模拟图；

图2靶基因SALL4mRNA潜在靶位点的二级结构模拟图；

图3脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)、MDA-MB-231(B)细胞增殖的抑制分析曲线；

图4脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)、MDA-MB-231(B)集落形成能力的抑制作用图；

图5脱氧核酶诱导乳腺癌细胞MCF7(A)、MDA-MB-231(B)凋亡的检测图；

图6脱氧核酶对乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响图；

图7脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-231(B)线粒体膜电位的影响图；图中JC-1单体的出现(图中以箭头标示)表示细胞线粒体膜电位的下降。

图8脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-231(B)细胞周期的影响图；

图9脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-231(B)迁移能力的影响图；

图10脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-231(B)细胞浸润能力的影响图。

具体实施方式

下面给出的实施例子是对本发明作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。

实施例1

根据人SALL4基因的mRNA序列，进行mRNA生理条件下的二级结构模拟，结果如图1；根据脱氧核酶设计原则，选取相应的靶位点区域，设计四条脱氧核酶寡核苷酸序列，靶位点选取位置如图2所示，每条脱氧核酶分子的两端各有3个核苷酸为硫代修饰，采用PAGE或HPLC纯化，所设计的脱氧核酶序列如下：

1.Dz-SALL4-12:5’-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3’

2.Dz-SALL4-62:5’-CTTTAGGTA GGCTAGCTACAACGA CACCACAGA-3’

3.Dz-SALL4-143:5’-CTTGGGGAA GGCTAGCTACAACGA TTATAGTTT-3’

4.Dz-SALL4-191:5’-CTGGAAGGA GGCTAGCTACAACGA TGTGGTTTC-3’

实施例2

乳腺癌细胞MCF7、三阴性乳腺癌MDA-MB-231采用含有体积分数为10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液，在37℃，体积分数为5％的CO₂条件下进行培养及传代。脱氧核酶的转染采用商业化的转染试剂GoldenTransfer^TM-D(GT-D)，以2:1(v/wt)的比例将转染试剂与实施例1中的4种脱氧核酶分子混合，在37℃中孵育20min，加入至细胞培养体系中，以无血清培养体系转染4h，并在含有血清的培养基中继续培养48h。乳腺癌细胞增殖抑制检测过程如下：以5×10³细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，每孔培养基200μL，预培养24h。将GoldenTransfer^TM-D/脱氧核酶复合物稀释至1、2、3、4μg/mL，加入至96孔板中，以DMEM细胞培养液(关于细胞存活率的测定分为4种GoldenTransfer^TM-D/脱氧核酶复合物(4条曲线)以及GoldenTransfer^TM-D(1条曲线)，仅加入细胞培养液的组别视作100％存活，在图中0μg/mL处体现，因此无曲线，共计5条曲线)和GoldenTransfer^TM-D作为阴性对照。培养至48h后，每孔加入20μL>

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample为分别加入GoldenTransfer^TM-D/脱氧核酶复合物以及仅加入GoldenTransfer^TM-D后的吸光度值，A_control为以DMEM细胞培养液正常培养细胞后的吸光度值，A_blank为无培养细胞仅加入DMEM细胞培养液后的吸光度值

研究中对GoldenTransfer^TM-D/脱氧核酶复合物进行不同浓度的稀释，作用于肿瘤细胞后48h检测，结果如图3所示。伴随脱氧核酶分子浓度的增加，脱氧核酶对两种乳腺癌细胞的增殖抑制能力明显增加。其中，针对Loop12设计的脱氧核酶分子Dz-SALL4-12作用效果最为明显，同时该脱氧核酶对乳腺癌细胞MCF7的作用效果要明显优于三阴性乳腺癌MDA-MB-231。

实施例3

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。将Dz-SALL4-12以3μg/mL的浓度无血清培养基转染4h，换成完全培养基培养至48h。使用质量体积分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞，并用血清计数板对收取的细胞计数。在新的六孔板中，每孔加入3000个经不同实验组处理后的细胞，每5天换液一次，培养14天后，弃细胞培养上清，用体积分数为75％的冰乙醇固定20min，预冷的pH7.2的磷酸缓冲液(Phosphate>

本发明中，我们通过集落形成的数量来评价脱氧核酶对细胞集落形成能力的影响，结果如图4所示。与对照组相比，脱氧核酶Dz-SALL4-12转染后，细胞集落数量明显减少，而转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组并无明显变化，可见本发明所设计的脱氧核酶分子能够显著抑制乳腺癌细胞的集落形成能力。

实施例4

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。将Dz-SALL4-12分别以1、2、3、4μg/mL的浓度无血清培养基转染4h，换成完全培养基培养至48h。根据Annexin>

从图5中我们可以清楚看到，脱氧核酶的转染对两种乳腺癌细胞都具有良好的凋亡诱导效果，同时对乳腺癌MCF7作用效果更为明显。在3μg/mL情况下早期凋亡比例即可达到26.70％，同等浓度下，脱氧核酶诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞早期凋亡为15.94％。

实施例5

以1×10⁶细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于10cm培养皿中，每皿培养基10mL，预培养24h。以3μg/mL的条件无血清培养基转染脱氧核酶Dz-SALL4-12>

从图6中我们可以看出，在乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中，脱氧核酶的作用能够显著降低SALL4蛋白的的表达水平，转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组相关蛋白表达量基本保持不变。同时，脱氧核酶的作用能够降低细胞凋亡相关蛋白pro-Caspase-3、pro-Caspase-9，细胞迁移相关蛋白MMP9蛋白的表达水平。该结果证明，转染的脱氧核酶Dz-SALL4-12可以降低SALL4的表达，下调的SALL4激活了pro-Caspase9，具有活性的Caspase9进而激活了pro-Caspase-3的活化，进而诱导细胞发生了凋亡，即脱氧核酶通过激活线粒体凋亡途径来诱导细胞发生凋亡的。

实施例6

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。以无血清培养基转染脱氧核酶Dz-SALL4-12>2培养箱中对细胞进行染色，孵育20min。用预热的孵育缓冲液将细胞进行清洗；最终向培养板中加入1mL>

从图7中我们可以看到，脱氧核酶作用后，细胞线粒体中JC-1单体明显增加，而转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组并没有明显变化。该结果进一步证明，本发明所设计的脱氧核酶分子通过激活细胞线粒体凋亡途径来诱导乳腺癌细胞的凋亡。

实施例7

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。以无血清培养基转染Dz-SALL4-12>

图8所示，与对照组相比，脱氧核酶Dz-SALL4-12的转染能够使乳腺癌MCF7细胞系G2期比率由14.7％增加到21.8％，使三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞G2期阻滞由13.8％增加到22％，而转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组细胞G2期含量并无明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶分子能够有效实现乳腺癌细胞系的G2期周期阻滞，实现对肿瘤细胞生长的抑制。

实施例8

以3×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。待培养板中的细胞生长至培养板面积的90％时，用黄枪头沿直线方向划出“伤口”，PBS清洗一次以去除细胞碎片。以无血清培养基转染脱氧核酶Dz-SALL4-12，4h后换成完全培养基培养。每隔12h用倒置显微镜拍照，并测定单细胞层中“伤口”的间隔距离。

从图9中我们可以观察到，与对照组相比，脱氧核酶Dz-SALL4-12的实验组乳腺癌细胞的迁移速率显著降低，而转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组迁移速率无明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶能够显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力。

实施例9

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。以无血清培养基转染脱氧核酶Dz-SALL4-12>4个细胞，在Transwell下室中加入600μL含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基，在培养箱中培养24h。培养至时间后，用体积分数为75％的冰乙醇4℃固定20min。用一次性的医用棉签擦除上室中未穿过的细胞，穿过半透膜的细胞用质量分数为0.2％的结晶紫/PBS溶液染色20min，PBS清洗三次后，以倒置显微镜拍照。

从图10中我们可以清楚观察到，与对照组相比，脱氧核酶Dz-SALL4-12作用后实验组下室的细胞数量明显减少，而转染无义脱氧核酶iDz实验组以及单独加入转染试剂GT-D组细胞数量并无明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶对乳腺癌细胞的浸润能力有显著的抑制作用。