甲基‑β‑环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用

摘要

甲基‑β‑环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用，用含有一定浓度MβCD处理BmNPV非宿主细胞后，能显著的提高BmNPV感染非宿主昆虫细胞效率，使BmNPV可在非宿主细胞中复制扩增，产生有感染性的病毒粒子及多角体，而对照细胞BmNPV则完全不能复制，更观察不到多角体的产生。本发明解决了BmNPV宿主域狭窄的问题，能使BmNPV在非宿主细胞复制，高效感染非宿主细胞，产生多角体。同时也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂宿主范围窄，杀虫速度慢等缺点，还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展。

说明书

技术领域

本发明属于生物杀虫剂与杆状病毒学领域，涉及甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，简称MβCD，也有表示为MBCD，Me-βCD，MeBCD)在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用。

背景技术

杆状病毒是已知昆虫病毒中的最大类群，是发现最早、研究最多的且实用意义很大的昆虫病毒，是一种闭合环状双链DNA的囊膜病毒，基因组大小约为80～180kb。由于杆状病毒又是农林业主要害虫的控制因子，因此也被广泛应用于生物杀虫剂。

杆状病毒绝大部分是从昆虫中分离得来的，都具有相对狭窄的宿主域。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)是研究的最为广泛的两种昆虫杆状病毒，虽然两个病毒基因组有很高的同源性，但是AcMNPV的宿主域比BmNPV宽得多，AcMNPV可在sf9、sf21、TN-368、CLS-79细胞系复制，但不能在家蚕BmN细胞中复制，而BmNPV则不同于AcMNPV，仅在BmN、Bm5等细胞系内复制，对非宿主细胞sf9、sf21、TN-368等几乎不能感染(吕鸿声.昆虫病毒分子生物学[M].北京：中国农业科学出版社，1998，p170-174.)。

目前已有很多利用分子生物学和基因工程手段改造杆状病毒基因组，扩大杆状病毒宿主域的报道(郭睿等，可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建，中国农业科学，2012，45(16)：3288-3296)，但是利用MβCD扩大杆状病毒宿主域方面还未见相关报道。

家蚕是我国重要的经济昆虫，而BmNPV引起的脓病是蚕桑生产中最严重的病害，BmNPV传染性很强，但是由于连续养蚕，导致病毒杀灭不完全，每年由于BmNPV感染导致脓病的发生给蚕丝业带来的巨大损失高达蚕桑生产总值16％。家蚕在幼虫期体长和体重迅速增加，到5龄期，体重每头可达5-7克，由于家蚕体积大，当BmNPV爆发性发生时可以产生大量的BmNPV病毒，目前生产中这些病毒必须经过严格的消杀处理，以避免病毒再次传播。但是如果可以把这种养蚕业避免不了的危害物加以利用，就可以变废为宝。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种甲基-β-环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用，申请人前期研究发现当MβCD浓度较高时，MβCD可以完全抑制BmNPV入侵家蚕BmN细胞，但当浓度较低时，它却可以增强BmNPV入侵非宿主细胞，比如sf9和sf21。即用含有一定浓度MβCD的细胞培养液孵育BmNPV的非宿主昆虫细胞后，再用BmNPV感染处理的细胞，即可显著提高BmNPV对非宿主昆虫细胞的感染效率，该方法简单明了，便于操作，成本低廉，易于推广，提高效率显著。

技术方案：甲基-β-环糊精在扩大家蚕核型多角体病毒宿主域中的应用。

所述甲基-β-环糊精的工作浓度为0.125-2mM。

所述宿主为sf9、sf21、high five(Hi5)、TN369、HzAM1。

扩大家蚕核型多角体病毒宿主域的组合物，有效成分包括甲基-β-环糊精。

1.MβCD(购自Sigma公司)溶液的配置及病毒准备

用1×PBS[购自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解MβCD，配制浓度为50mM的储存液。

BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[Huang JS et al.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225]。为了便于观察及统计本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因egfp及BmNPV的多角体基因(polyhedra，polh)同时转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，重组后的bacmid命名BmBac-egfp-ph，提取重组bacmid的DNA，转染家蚕细胞，荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，收获出芽病毒(Budded Virus,BV)后，继续用于感染家蚕细胞进行病毒扩增，72h后收获病毒，利用终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于本发明所有方法中。

2.不同浓度MβCD孵育细胞及随后病毒感染的细胞荧光观察

分别在细胞培养皿中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，例如sf9、sf21等，贴壁24h后，用配制好的MβCD储存液加入到细胞培养基中，使MβCD终浓度分别为0.125-2mM，孵育20-60min，孵育细胞温度为24-29℃，以0mM MβCD(即等体积1×PBS)作为对照。孵育时间到后，分别去除1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清的TC-100培养基或其它昆虫细胞培养基轻轻冲洗细胞2次(也可不洗)，接着用MOI＝5-50携带绿色荧光蛋白基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27℃感染1h后，用无血清昆虫细胞培养基轻洗2遍(也可不洗)，放置于27℃培养箱培养，培养后6-72h，即在荧光显微镜下可观察到不同处理表达荧光细胞数量的差异。在感染后期，用MβCD孵育过的细胞在光学显微镜下能看见病毒多角体的形成，而对照1×PBS孵育的细胞无多角体的形成。图1是BmBac-egfp-ph感染非宿主昆虫细胞sf21示例的结果，当用1×PBS对照孵育sf21细胞时，病毒感染效率非常低，感染后72h没有多角体的形成，但用0.25mM的MβCD处理后，感染效率显著提高，感染72h后细胞全部都有绿色荧光表达，表明BmNPV在sf21细胞中可以很好的复制，而且能看见多角体的形成(红色箭头所示)。

3.不同浓度MβCD孵育细胞对BmBac-egfp-ph感染率影响

分别在24孔细胞培养板中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，贴壁24h后，用配制好的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.125～2mM，孵育20-60min，孵育细胞温度为24-29℃，以0mM MβCD(即等体积1×PBS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清昆虫细胞培养基或者PBS轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI＝10携带绿色荧光蛋白基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27℃感染1h后，去除未吸附的病毒粒子及培养基，用无血清的昆虫细胞培养基或者PBS轻洗2遍，加入正常细胞培养基，放置于27℃培养箱培养6h后，去除细胞培养基，用PBS悬浮细胞，用流式细胞仪统计有荧光表达的细胞数，利用t测验分析不同浓度MβCD孵育细胞与对照的在病毒感效率方面的差异。实验设三个重复。统计结果显示0.125mM MβCD处理细胞时，BmNPV感染的细胞效率约为对照2.5倍，而0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM MβCD处理后的感染效率分别为对照5.5、5.6、6、6.3、6.7、5.9倍。

4.BmNPV在MβCD孵育后的细胞中病毒生长曲线测定

分别在6孔细胞培养板中接种正常培养的BmNPV非宿主昆虫细胞，贴壁后，用配制好的MβCD储存液加入到细胞培养液中，使MβCD终浓度为0.25mM，27℃孵育30min，以0mM MβCD(即等体积1×PBS)孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除1×PBS和不同浓度的MβCD孵育液，用无血清的昆虫细胞培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI＝20BmBac-egfp-ph BV病毒分别感染不同处理的细胞，27℃感染2h后去掉病毒感染液，用无血清的昆虫细胞培养基轻洗2遍(以此时间设定为0h)，加入2mL正常培养基27℃常规培养，分别在感染后0、12、24、48、72、96h取上清样品10μL，利用BmN细胞，采用终点稀释法测定每个时间点的病毒滴度，实验设三次重复，绘制病毒的一步生长曲线，以确定BmNPV病毒在sf21细胞中是否可以正常复制扩增。图3是MβCD终浓度为0.25mM和对照PBS的病毒一步生长曲线，从图中可以发现，BmNPV感染sf21后，对照在0-96h的生长曲线为一条直线，细胞没有产生病毒粒子，表明BmNPV在未处理的非宿主细胞sf21不能复制，而MβCD处理细胞后，在0与12h时间点没有病毒粒子产生，但后期病毒粒子数量开始上升，并一直持续到感染后96h，表明BmNPV感染后病毒能在非宿主细胞中复制，并产生具有感染性的病毒粒子。

有益效果：本发明首次发现MβCD的一种新用途。用含有一定浓度MβCD培养基处理BmNPV非宿主细胞后，能显著的提高BmNPV感染非宿主昆虫细胞效率，使BmNPV可在非敏感细胞中复制扩增，产生有感染性的病毒粒子及多角体，而对照细胞BmNPV则完全不能复制，更观察不到多角体的产生。该用途的发明，解决了BmNPV宿主域狭窄的问题，能使BmNPV在非宿主细胞复制，高效感染非宿主细胞，产生多角体。同时也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂宿主范围窄，杀虫速度慢等缺点，还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

附图说明

图1为利用本发明中所述方法终浓度为0.25mM MβCD处理sf21细胞(对照用PBS处理)，病毒BmBac-egfp-ph感染72h后荧光及可见光比较图：

A与B为BmBac-egfp-ph感染PBS处理细胞的荧光图片及可见光图片；C与D为BmBac-egfp-ph感染MβCD处理后细胞的荧光图片及可见光图片；D中箭头所示为BmNPV多角体。放大倍数为640×。结果显示对照细胞荧光数量非常少，而处理后的细胞几乎所有细胞均被感染，而且MβCD孵育过的细胞能观察到多角体，对照处理则观察不到多角体。

图2为利用本发明中所述方法七种不同浓度MβCD处理和对照PBS处理sf21细胞后BmNPV感染效率比较：

BmNPV对照为BmBac-egfp-ph入侵未经MβCD处理的sf21细胞感染效率，AcMNPV对照为苜蓿银纹核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)对sf21的感染效率(MOI＝1)，**表示各MβCD处理组与BmNPV对照具有显著性差异(P<0.001)。

图中数据为三次重复结果。不同浓度MβCD处理后，细胞感染率显著大于对照，并且和AcMNPV达到相近的感染效果(MOI＝1)，sf21为AcMNPV宿主细胞)。

图3为利用本发明中所述方法0.25mM MβCD处理和对照PBS处理sf21，BmBac-egfp-ph在sf21细胞中病毒生长曲线比较：

纵坐标为病毒半数组织感染剂量(TCID₅₀)Log₁₀对数，横坐标为感染后时间点。对照PBS处理细胞中没有感染性的病毒粒子释放，病毒生长曲线为一条直线，表明BmBac-egfp-ph在对照中没有复制扩增，而MβCD处理细胞在12h后开始释放出有感染性的病毒粒子，并一直持续到感染后96h，表明BmNPV在MβCD处理后细胞中可以有效复制、扩增。

具体实施方式

以BmNPV感染非宿主昆虫细胞sf21为例，说明本发明的具体实施步骤：

MβCD(购自Sigma公司)溶液的配置及病毒准备

用1×PBS[购自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解MβCD，配制浓度为50mM的储存液。

BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[Huang JS et al.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225]。为了便于观察及统计本发明所述的感染效率，将hsp70操纵下的报告基因egfp及多角体基因转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，命名BmBac-egfp-ph，提取DNA，转染家蚕细胞，收获出芽病毒后，继续用于感染家蚕细胞，荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，72h后收获病毒，终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于以下本发明所述方法中。

实施例1：终浓度为0.25mM MβCD孵育，对BmNPV感染非宿主细胞效率的提高

分别在两个35mm细胞培养皿中各接种约5×10⁵个/皿的sf21细胞，贴壁后，取配制好的MβCD储存液加入到其中一个皿细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.25mM，以0mM>

实施例2：分别用终浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM的MβCD处理后，流式细胞仪统计病毒感染效率的变化

在24孔细胞培养板中各接种约1×10⁵个/孔的sf21，贴壁24h，分别取配制好的MβCD储存液1.25μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、15μL、20μL加入到细胞培养液中(细胞培养液总体积为500μL/孔)，使MβCD终浓度分别为0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM，在BmNPV对照及AcMNPV对照中加入20μL>

实施例3：MβCD终浓度为0.25mM时，BmNPV感染后病毒生长曲线测定

分别在6孔细胞培养板中接种约5×10⁵个/孔sf21细胞，贴壁后，取配制好的MβCD储存液10μL加入到贴壁细胞sf21的细胞培养液中，使MβCD终浓度分别为0.25mM(总体积为2mL)，27℃孵育30min，以10μL1×PBS孵育液作为对照。孵育时间到后，分别去除1×PBS和MβCD孵育液，用无血清的TC-100培养基轻轻冲洗细胞2次，接着用MOI＝20携带绿色荧光蛋白基因和多角体基因的BmBac-egfp-ph病毒分别感染不同处理的细胞，27℃感染1h后，用无血清的TC-100培养基轻洗2遍，加入正常细胞培养液2mL(以此时间设定为0h)，27℃正常培养，分别在感染后0、12、24、48、72、96h收集10μL上清病毒，利用BmN细胞通过终点稀释法测定每个时间点病毒的滴度，感染及滴度测定设三次重复。根据不同时间点的病毒滴度，绘制病毒的一步生长曲线。图3结果表明，对照PBS处理细胞后，BmNPV感染后，在0-96h病毒没有感染性病毒粒子产生，而BmNPV感染MβCD处理细胞后，从12h开始释放出有感染性病毒粒子，一直持续到感染后96h，表明BmNPV病毒在MβCD处理细胞中可以复制、扩增，产生有感染性病毒粒子。

最后应当说明的是：以上所述的实施例和实施方式所述的MβCD浓度和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态或者细胞培养基理化性质等(比如酸碱度等)微小的差异，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，同时也包含其它家蚕核型多角体病毒非宿主细胞，诸如sf9、high five(Hi5)、TN369、HzAM1等非家蚕昆虫细胞和悬浮培养的上述细胞，并被包括在本申请的精神和范围之内。