一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为CyclinB1、p90、c‑myc、p53、NPM1、HCC1、14‑3‑3zeta和p62。进一步地，所述试剂盒还包括样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液、洗涤液。本发明的ELISA试剂盒用于肝癌的早期诊断具有灵敏度高，稳定性好，操作简便等优点。此外，采用本发明的ELISA试剂盒可以同时检测11个血样标本，降低了成本，提高了效率，使肝癌患者在临床症状出现前便能诊断并能够接受治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，而每年的新发肝癌病例有一半以上是在中国，严重威胁着人们的生命健康。肝癌起病很隐匿，预后差。手术切除和肝移植等方式被认为是肝癌根治性治疗的手段，但大多数患者在被初次诊断时，便已进入肝癌晚期，因而失去了治疗的机会。其中最主要的原因是早期肝癌患者通常无明显症状，或者体积很小，影象学检查较难察觉，而甲胎蛋白(AFP)作为主要的血清标记物，又存在敏感性低的缺点，以至于在美国肝病研究学会(AASLD)2010年发布的《临床肝细胞癌指南更新版》中，已不再推荐AFP作为肝癌的筛查指标。研究者们在肝癌的分子层面进行研究，为肝癌的分子诊断以及术后个体化治疗方案的制定等提供重要的理论依据。

目前最新的恶性肿瘤早期检测方法有多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统(C12芯片)、肿瘤基因突变检测试剂盒、六项肿瘤标志物测定试剂盒、人恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。但是，多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统(C12芯片)的检测假阳性较高，且没有具有针对性的肝癌检测标志物，检测效率低。肿瘤基因突变检测试剂依靠聚合酶链式反应(PCR)这样繁复的操作,且容易产生假阳性，是一种不可靠的分析方法。六项肿瘤标志物测定试剂盒和人恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，只能测出患者有肿瘤，但不能判断肿瘤的具体类型。

近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，许多研究已经发现癌症患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。这一概念的提出对肝癌早期诊断研究指引了一个新的方向。1998年，在美国Scripps研究所的张博士发现了一种新的肿瘤相关抗原p62。这种被称为p62的TAA能够激发人体产生免疫反应，产生自身抗体，具有重要意义的是抗p62自身抗体在肝癌患者循环系统出现的时间：使用从慢性肝炎发展到肝硬化再到肝癌的序列血清，发现抗p62自身抗体在患者的慢性肝炎阶段没有出现，在肝硬化的前期、中期也没有出现，而在肝硬化阶段的晚期肝癌发生前的一段时间含量急剧升高，而此时尚未出现肝癌的临床症状和体征，临床上尚不能发现肝癌，并且这一现象在多个肝癌患者的序列血清中得到重复。这就说明，抗p62自身抗体是一个有潜力的能够早期诊断肝癌的血清学标志物。随后对小样本的肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者和正常人的血清检测抗p62自身抗体进行检测，结果显示这种自身抗体的特异度很高，但是灵敏度尚不能达到20％。显然，如果单独以抗p62自身抗体作为诊断肝癌的标志物，诊断价值较低。研究者在接下来的工作中，试图寻找更加灵敏和特异的抗TAA自身抗体，可是结果不够理想。在2003年的一项使用7种抗TAA自身抗体检测肝癌的研究中，单个指标的灵敏度不超过20％，但是通过并联这7种TAA自身抗体，检测的灵敏度可以达到56.9％，而诊断的特异度仍然很高。说明联合多个TAA自身抗体具有较高的诊断价值，是一种有应用潜力的策略。

十余年来的后续研究一直试图寻找诊断肝癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断肝癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。

本研究中应用蛋白质组学技术筛选出的八种TAA组合，这八种TAA分别为CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62，研究已表明其与肝癌的发生发展密切相关。CyclinB1是一种细胞周期蛋白，是细胞周期的正性调控因子，在控制细胞进入G2/M期检测点的过程中发挥重要作用，其过量表达可导致细胞分裂增殖失控从而诱发肿瘤发生，在癌症的早期阶段，CyclinB1的异常表达还可以被人体的免疫系统所识别，机体发生免疫反应，进而产生大量的B1细胞周期蛋白抗体。p90又名CIP2A，蛋白磷酸酶2A的肿瘤抑制因子，对抑癌因子蛋白磷酸2A造成干扰，从而促进细胞增殖。c-myc转录因子蛋白，是一种转录因子，促进细胞分裂和增殖。有研究表明c-myc基因在肿瘤中无限制表达，可以使一些细胞永不死亡。p53，肿瘤抑制蛋白，控制着细胞周期的启动。p53基因突变发生于多数的肿瘤细胞中，突变后将编码突变型的p53蛋白。突变蛋白可干扰p53的功能，其过度表达和累积导致正常p53蛋白失去功能，这将引起血清中p53抗体的产生，诱发肿瘤的发生发展。NPM1是核仁磷酸蛋白，参与调节ARP/p53通路，在人类细胞癌中经常过量表达，突变，重排和删失，因此常被认为是肿瘤标志物。HCC1/CAPERα，mRNA抑制肿瘤蛋白酶抑制剂，是甾类激素受体介导的转录和选择性剪接因子，在控制Rel/NF-kB的致癌性活动方面有重要的作用。14-3-3zeta，14-3-3家族中的一员，通过结合含有磷酸丝氨的蛋白介导信号转导，与癌症起始和进展过程中的靶蛋白发生交互作用而发挥潜在的致癌作用。其机制还不是很清楚，但是，近些年，14-3-3zeta蛋白在癌症中的重要性已日趋明显。许多关于肝细胞癌与14-3-3zeta关系的研究表明，14-3-3zeta在肝细胞癌进程中发挥着重要作用。14-3-3zeta可被用来作为一个潜在的肿瘤相关抗原，14-3-3zeta抗体的发现或许能帮助肝细胞癌的早期诊断。p62/IMP2，类胰岛素生长因子2mRNA结合蛋白2，p62基因最初是cDNA表达文库中从肝细胞癌患者的血清中的自身抗体中免疫筛选而得到。p62是一种细胞质mRNA结合蛋白，结合信使RNA编码胰岛素样生长因子II(IGF-II)，参与胰岛素的信号途径和胰岛素分泌，是一种已知的在肝细胞癌中过度表达，并且在转基因动物中致癌的生长因子结合蛋白。因此，本研究将联合筛选出的八种TAA自身抗体，开发一种具有高灵敏度高和高特异性的用于肝癌早期诊断和筛查的ELISA试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，而且使用方便、廉价，检测成本低，能够在普通实验室推广使用。

本发明采用的技术方案为：

一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62。

根据上述的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒还包括样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液、洗涤液。所述样本稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为10％的浓硫酸；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

根据上述的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述第二抗体带有可检测的标记物；所述可检测的标记物优选为辣根过氧化物酶；进一步地，所述第二抗体优选为RecA蛋白(重组蛋白A)。

根据上述的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述阳性对照血清优选为p53阳性对照血清，所述阴性对照血清优选为p53阴性对照血清；其中，所述p53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测p53抗体均为阳性的肝癌患者血清，所述p53阴性对照血清是使用间接ELISA方法检测p53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。因研究已明确表明p53抗原参于肝癌的发生发展，当前大量文献也报道了抗p53抗体在肝癌患者血清中具有较高的阳性率。因此为了提高工作效率，本发明选择p53抗体阳性血清作为阳性对照。因为阳性对照血清和阴性对照血清是经过精心筛选出来的血清，因此，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述固相载体优选为96孔酶标板；所述96孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图2)包被CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62这八种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于11个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本发明ELISA试剂盒的96孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中八种TAA抗体的表达水平的目的。进一步地，所述96孔酶标板上还设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被p53抗原。

根据上述的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。同一血清样品经过稀释后加入96孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中八种TAA抗体的表达水平。

本发明取得的积极有益效果：

(1)本发明首次采用CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62作为一个组合用于肝癌的早期筛查和诊断，具有较高的准确率。

(2)本发明根据间接酶联免疫法制备了多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，而且使用方便，操作步骤简单、快捷，极大地提高了临床检测效率；此外，检测成本低，能够在普通实验室推广使用。

(3)本发明的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒使用RecA蛋白做为第二抗体，其可以与抗体结构中的Fc段特异结合，相对于传统的辣根过氧化物酶标记的IgG，以RecA蛋白做为第二抗体具有特异性强、背景值低的特点，能够提高抗体检测的准确率，降低假阳性率。

(4)采用本发明的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒，可以实现同时检测11个待测血清样品中8种TAA抗体的表达水平，可用于大规模的样本检测，极大地提高了检测和诊断效率。

附图说明

图1 间接酶联免疫试验原理图。

图2 本发明多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒中96孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表的是包被了此抗原，最终检测的是待测血清样品中相应抗体表达水平；“+”即阳性对照孔，代表血清样本孵育反应时加入的是阳性对照血清；“-”即阴性对照孔，代表血清样本孵育反应时加入的是阴性对照血清；“空白”即空白对照孔，即血清样本孵育反应时加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，空白对照反映了实验过程中的背景值。

图3 8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组血清中的分布图；由图可知这8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值均远小于0.25，而OD值大于0.5的血清也比较少。

图4 8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌组血清中的分布图；由图可知这8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌组中平均表达水平比较高，平均OD值在0.25附近浮动，并且OD值大于0.5的血清也比较多，部分血清的OD值甚至超过了1.0。

图5 8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌组和对照组中的阳性率结果。(结果显示肝癌组中8种肿瘤相关抗原自身抗体阳性率在20.2％-41.4％，而这8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中的阳性率均不超过10％。经统计学检验，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌中的阳性率均高于对照组。)

图6 8种肿瘤相关抗原自身抗体检测肝癌的ROC曲线(受试者工作特征曲线)；纵坐标为真阳性率(灵敏度)，横坐标为假阳性率。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但并不限制本发明的保护范围。

实施例1：八种肿瘤相关抗原的制备

通过使用原核表达系统，原核表达和纯化8种肿瘤相关抗原(CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62)，以便为下步实验做准备。具体抗原制备过程如下：

1)使用基因克隆技术构建八种肿瘤相关蛋白(CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62)的重组原核表达质粒。

2)表达目的蛋白：将构建的重组原核表达质粒分别转化到大肠杆菌Bl21(DE3)中，使用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达。

3)纯化目的蛋白：根据目的蛋白所携带的标签，采用传统的相应的纯化方案对目的蛋白进行纯化；其中，对于携带组氨酸标签的c-myc、p53、p62、14-3-3zeta、NPM1和HCC1蛋白采用Ni-NTA柱进行纯化，而对于携带GST标签的Cyclin B1和p90蛋白则采用谷胱甘肽S-转移酶进行纯化。

4)使用Bradford法测定蛋白浓度(索莱宝试剂盒)，使用Western blot的方法对纯化蛋白的免疫学活性进行鉴定。

鉴于原核系统表达纯化重组蛋白技术已比较成熟，具体过程不再详述，通过以上制备步骤，成功获取了8种有活性的目的蛋白(即8种肿瘤相关抗原)，为后续实验做准备。

实施例2：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

1、试剂和材料

(1)八种肿瘤相关蛋白(CyclinB1、p90、c-myc、p53、NPM1、HCC1、14-3-3zeta和p62蛋白)；

(2)抗原包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(3)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白，购自Invitrogen公司；

(5)96孔酶标板：购自Jet Biofil公司；

(6)显色液A：0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，配制：称取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中。

(7)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲素，配制：称取柠檬酸4.665g、Na₂HPO₄·12H₂O>

2、制备抗原包被的酶标板

(1)制备八种肿瘤相关抗原溶液：

将八种肿瘤相关蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配置成8种不同浓度的抗原溶液，其中，NPM1溶液的浓度为0.125μg/ml，p53溶液的浓度为0.25μg/ml，p90溶液的浓度为0.25μg/ml；p62溶液的浓度为0.5μg/ml，HCC1溶液的浓度为0.5μg/ml；CyclinB1溶液的浓度为1.0μg/ml，14-3-3zeta溶液的浓度为1.0μg/ml，c-myc溶液的浓度为1.0μg/ml。

(2)包被酶标板：按照图2所示的布局进行点样将制备好的八种肿瘤相关抗原溶液分别加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，4℃孵育过夜后去除包被液。

(3)封闭：向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液，室温孵育2小时，然后除去封闭剂。

(4)将经过步骤(3)处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，4℃保存备用。

3、本发明试剂盒的组成如下：

(1)抗原包被的96孔酶标板；

(2)样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：为含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白，购自Invitrogen公司；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；

(6)终止液：10％的浓硫酸；

(7)洗涤液：含0.05％吐温-20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

实施例3：本发明试剂盒的检测方法

1、血清样本孵育：

将待检测的血清样本用1％BSA溶液按1：100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本按照图2所示的布局图加入已包被抗原的96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤5次。

2、酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用1％BSA溶液按1：8000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤5次。

3、显色及终止反应

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃水浴避光显色15min，然后向每个点样孔中再加入50μl终止液，终止显色反应，然后用自动酶标仪在450nm和595nm处读取OD值，并用空白孔调零。

4、结果判定：

以所有正常对照组的OD值的平均数加两个标准差(Mean+2SD)作为截断值(Cut-off值)，高于此值判定为阳性，低于此值判定为阴性。

实施例4：用本发明实施例2的试剂盒的检测肝癌患者和正常人的血清样本

样本准备：根据流行病学分析，本研究收集了84例原发性肝癌患者的血清(肝癌组)，以及89例正常人的血清(对照组)。84例原发性肝癌患者中，男性56例，女性28例，平均年龄为57.0±11.3岁，年龄范围为23-77岁；89例正常人中，男性59例，女性30例，平均年龄为57.2±10.9，年龄范围为25-79岁。所有肝癌患者血清都是在患者最初诊断为肝癌尚未接受任何放化疗时收集的，被诊断的时间为2011年10月至2013年10月。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤相关疾病的体检人群。

采用本发明实施例2所述的试剂盒和实施例3所述的检测方法分别对84例肝癌患者血清(肝癌组)和89例正常人血清(对照组)中8种肿瘤相关抗原自身抗体的含量进行检测。以对照组血清中8种肿瘤相关抗原自身抗体含量的平均值加两个标准差作为截断值，分别计算肝癌组和对照组中8种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率。应用MedCalc软件绘制8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图3和图4)，以及其在两组中阳性率的柱形图(结果见图5)。本研究还应用SPSS21.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较肝癌组与对照组抗体阳性率，检验水准α取0.05，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测肝癌的诊断价值(结果见表1和图6)。

表1不同TAAs(肿瘤相关抗原)组合并联检测结果集真实性评价

注：约登指数：约登指数是灵敏度和特异度之和减去1，综合评价了该方法用于肝癌的诊断价值，该数值大于0小于1，越接近于1诊断价值越大。

由图3和图4可知，在对照组中，8种肿瘤相关抗原自身抗体平均表达水平较低，平均OD值均远小于0.25，OD值大于0.5的血清较少；而在肝癌组中，血清中8种肿瘤相关抗原自身抗体平均水均较高，平均OD值在0.25附近浮动，并且OD值大于0.5的血清较多，有的血清检测肿瘤相关抗原自身抗体OD值甚至超过了1.0；由此说明这8种肿瘤相关抗原自身抗体可以用于肝癌的诊断。由图5可知，肝癌组8种肿瘤相关抗原自身抗体阳性率在20.2％-41.4％，而这8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组阳性率均不超过10％，而且经统计学检验，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在肝癌中的阳性率均明显高于对照组，由此证明这8种肿瘤相关抗原自身抗体可以作为肝癌早期诊断的检测指标，用于肝癌的早期诊断。

由表1可知，随着抗原组合数目的增加，诊断的灵敏度也随之增加，当8种肿瘤相关抗原组合时，诊断的灵敏度最终达到了86.9％，即是肝癌患者中应用该种方法被正确的诊断为肝癌的百分比为86.9％。而特异度虽然降低，但是能够达到73％，这表明了非肝癌患者应用该种方法被正确的诊断为未患肝癌的百分比为73％。使用这8种肿瘤相关抗原组合对肝癌进行诊断，可以在保证诊断特异度的前提下较大幅度的提高诊断的灵敏度，该组合对待测对象是否为肝癌患者的判定正确率非常高，为79.8％，由此也可以证明这8种肿瘤相关抗原组合是较为理想的肝癌早期诊断和筛查方法和手段。

由图6可知，本方法的ROC曲线下面积为0.800，说明使用该多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒对于肝癌具有较高的判定正确性和较高的诊断价值，进一步证实了我们所开发出的这个多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒是较为理想的肝癌早期诊断和筛查方法和手段。