一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法

摘要

为解决以往手工过分析柱收集或淀粉与非淀粉成分分离纯化过程中预糊化对淀粉的损失的技术问题，本发明提供一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法。一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法，该方法包括如下步骤：步骤1：稻米粉的前处理：碾精度为85‑95%的精米磨成过0.42 mm或0.59 mm细度筛的精米粉；步骤2：淀粉纯化:脱去脂肪和可溶性糖；步骤3:糊化淀粉和直、支链分离，步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数，采用pH=4.75的0.05 mol/L 乙酸铵溶液作为流动相，流速为1.0 ml/min；步骤5：系列标样设置和标准曲线绘制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉的测定方法，特别涉及一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法。

背景技术

食用稻米胚乳中的最主要成分是淀粉，约为80％。稻米淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉是D-葡萄糖基以a-(1,4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，分子量1～2×10⁵，聚合度990，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基,为直链状分子，很少分枝。支链淀粉分子中除有a-(1，4)糖苷键的糖链外，还有a-(1，6)糖苷键连接的分支，分子中含300～400个葡萄糖基，分子量>2×10⁷，聚合度7200；是高度分枝的葡萄糖苷链，支链平均长度约为20个葡萄糖残基。淀粉级分的比例及其分子量、分子结构等对天然淀粉的特性((Lic>6g/mol(籼稻)～235×10⁶g/mol(糯稻)，直链淀粉的分子量为0.44×10⁶g/mol(籼稻)～1.62×10⁶g/mol(粳稻)；且淀粉分子特性与碘兰值、特征粘度有较大相关性((熊善柏等，中国粮油学报，2003，18(2)：5-8))。大米淀粉主要由支链淀粉、中间级分和直链淀粉组成，大米 支链淀粉的平均相对分子质量为49.67×10⁶g/mol～957.69x10⁶g/mol，大米直链淀粉的平均相对分子质量为1.9x10⁶g/mol～5.91x10⁶g/mol，支链淀粉的分子量分布比直链淀粉窄。大米淀粉的各级分含量不同，其中中间级分含量最大，在研究范围内，支链淀粉含量为11.52-48.62％，中间级分含量为28.74-69.33％，直链淀粉含量为6.26-40.77％。天然淀粉的特征粘度与直链淀粉及支链淀粉的平均分子量、摩尔比之间呈较好的指数模型(程科，2006，大米淀粉物化特性、分子结构及其相关性研究，硕士论文)。李玥等2007年得到不同品种的大米淀粉中分离出的直链淀粉的重均分子量范围为3.29×10⁵～2.75×10⁶((农业工程学报，2007，23(11)：36-41))。但已报道的前处理方法步骤多，容易带来淀粉损失或污染，尤其有些方法采用磁性搅拌子搅拌会破坏淀粉结构而影响淀粉结构分子量测定结果。Ward等(2006)(Biomacromolecules,2006,7:866-876)(报道用的多角度激光散色仪来测定热水溶性淀粉的分子量，但此检测器价格昂贵，测定的绝对分子质量。张卫东等(2015)(药物分析杂志，2015，35(7)：1213-1216)报道多角度激光散色仪法测定普鲁兰糖的重均相对分子质量结果与凝胶渗透法测定结果接近，后者只需配示差检测器和标样，因此成本低也易操作。2013年杨小雨等(中国农业科学，46(6):3488-3495)报道用高效液相提几排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量，用的是Shodex>

发明内容

为解决以往手工过分析柱收集或淀粉与非淀粉成分分离纯化过程中预糊化对淀粉的损失的技术问题，本发明提供一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法，该方法包括如下步骤：

步骤1：稻米粉的前处理：碾精度为85-95％的精米磨成过0.42mm或0.59mm细度筛的精米粉；

步骤2：淀粉纯化:脱去脂肪和可溶性糖

精米粉与100％色谱纯甲醇混匀并于100℃加热10分钟后于10,000g离心5分钟后收集沉淀物，此步骤重复2-3次，并合并沉淀物；精米粉与甲醇的用量比为0.6mg/1.0ml；

步骤3:糊化淀粉和直、支链分离

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数

采用Ultrahydrogel 120和250串联柱子，采用pH＝4.75的0.05mol/L乙 酸铵溶液作为流动相，流速为1.0ml/min,柱保温箱温度为40℃和示差检测器；

步骤5：系列标样设置和标准曲线绘制

采用系列分子量的糖多聚物为标样(varian,Polysaccaride calibration kit)，绘制标准曲线和预测所测样品直链淀粉和支链淀粉的相对分子量大小。

作为优选，所述步骤3的具体参数是：取沉淀物加入0.25mol/L NaOH溶液中，沉淀物与NaOH溶液的比例为50mg：1.0ml，糊化完全，混匀后加入适量pH＝4.0的0.5mol/L醋酸钠溶液，再入适量异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃反应2hr以上，直至反应完全；然后，沸水加热5分钟，10,000g离心5-10分钟，取上清液；加入适量离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后进行凝胶渗透色谱进样测定。

作为优选，糊化的方法是沸水浴5-10分钟或50℃烘箱2-3小时或室温过夜至溶液清澈。

作为优选，所述步骤5的具体参数是：采用Mp为344000,107000,47100,9600和5900五点标准曲线，得到标准曲线，并由此预测所测样品的直链淀粉和支链淀粉的相对分子量。

本发明利用凝胶渗透色谱仪，简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量，克服以往手工过分析柱收集或淀粉与非淀粉成分分离纯化过程中预糊化对淀粉的损失，或是分析柱子串联多而导致分析时间过长，基线漂 移等问题。本新型提供了简化淀粉纯化步骤，用异淀粉酶分离直、支淀粉，利用Ultrahydrogel 120和250串联水溶性色谱柱子和分布范围较广的系列不同相对分子量的普鲁兰多糖标样，该方法快速高效，数据重复性好,在水稻品质改良和食品淀粉加工等中均有很好的应用前景。

附图说明

图1是水稻样本一的直链淀粉和支链淀粉图；

图2是水稻样本二的直链淀粉和支链淀粉图；

图3是水稻样本三的直链淀粉和支链淀粉图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法，步骤如下：

步骤1:稻米粉的前处理：采用精米粉过0.42mm细度筛的米粉；

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

精米粉称样量为50mg入10ml离心管，加入30ml 100％色谱纯甲醇， 于沸水浴10分钟，10,000g离心5分钟，倒去悬浮液。沉淀物重复步骤2，2-3次，合并沉淀物。

步骤3：称10mg沉淀物于2ml离心管后加入0.2ml 0.25mol/L NaOH,50℃烘箱2小时。混匀后加入80μl 0.5mol/L醋酸钠(pH＝4.0)，再加入20μl异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒温水浴摇床反应2hr。后，沸水加热5分钟，10,000g离心5分钟，取上清液；加入0.2g左右离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后直接进样测定。

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数采用Ultrahydrogel 120和250串联柱子，采用0.05mol/L乙酸铵(PH＝4.75)，0.02％叠氮化钠，流速为1.0ml/min,柱保温箱温度为40℃和示差检测器。

步骤5：糖多聚糖的标样，采用质均相对分子量Mp为344000,107000,47100,9600和5900五点标准曲线，得到的直链淀粉的质均相对分子量Mp为253252，支链淀粉的长链和短中链的质均相对分子量分别为6345和1053。经18度激光散色的检测器测定比较，两者的直链淀粉和支链淀粉的质均相对分子量之间的相对相差4.3％。数据结果可靠。

图1是水稻样本一的直链和支链淀粉图，其中第一峰，保留时间在14.8min为直链淀粉；第二和第三峰均为支链淀粉部分，保留时间分别为18.4050min和19.65min，分别为支链淀粉的长链和中短链部分。

实施例2

一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法，步骤如下：

步骤1:稻米粉的前处理：采用精米粉过0.42mm细度筛的米粉；

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

精米粉称样量为100mg入10ml离心管，加入60ml 100％色谱纯甲醇，于沸水浴10分钟，10,000g离心5分钟，倒去悬浮液。沉淀物重复步骤2，2次，合并沉淀物。

步骤3：称20mg沉淀物于2ml离心管后加入0.4ml 0.25mol/L NaOH,50℃烘箱2小时。混匀后加入80μl 0.5mol/L醋酸钠(pH＝4.0)，再加入20μl异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒温水浴摇床反应2hr。后，沸水加热5分钟，10,000g离心5分钟，取上清液；加入0.35g左右离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16,000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后直接进样测定。

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数采用Ultrahydrogel 120和250串联柱子，采用0.05mol/L乙酸铵(pH＝4.75)，0.02％叠氮化钠，流速为1.0ml/min,柱保温箱温度为40℃和示差检测器。

步骤5：糖多聚糖的标样，采用Mp为344000,107000,47100,9600和5900五点标准曲线。此样品为糯稻，没有直链淀粉含量，得到支链淀粉的长链和短中链的质均相对分子量分别为5429和951。经18度激光散色的检测器测定比较，两者的直链淀粉和支链淀粉的质均相对分子量之间的相对相差5.3％。数据结果可靠。图2是水稻样本二的直链和支链淀粉图。

实施例3

一种简化测定水稻直链淀粉和支链淀粉相对分子量的凝胶渗透色谱法，步骤如下：

步骤1:稻米粉的前处理：采用精米粉过0.42mm细度筛的米粉；

步骤2：精米粉脱除脂肪和可溶性糖

精米粉称样量为100mg入10ml离心管，加入60ml 100％色谱纯甲醇，于沸水浴10分钟，10,000g离心5分钟，倒去悬浮液。沉淀物重复步骤2，3次，合并沉淀物。

步骤3：称20mg沉淀物于2ml离心管后加入0.4ml 0.25mol/L NaOH,50℃烘箱2小时。混匀后加入80μl 0.5mol/L醋酸钠(PH＝4.0)，再加入20μl异淀粉酶(酶活大于250U)于40℃恒温水浴摇床反应2hr。后，沸水加热5分钟，10,000g离心5分钟，取上清液；加入0.35g左右离子交换树脂AG501-X8，于50℃水浴摇床30min,后16,000g离心10分钟，过0.45μm PVDF小柱，保持40℃后直接进样测定。

步骤4:凝胶渗透色谱仪器参数采用Ultrahydrogel 120和250串联柱子，采用0.05mol/L乙酸铵(PH＝4.75)，0.02％叠氮化钠，流速为1.0ml/min,柱保温箱温度为40℃和示差检测器。

步骤5：糖多聚糖的标样，采用Mp为344000,107000,47100,9600和5900五点标准曲线。得到的直链淀粉质均相对分子量为221657，，得到支链淀粉的长链和短中链的质均相对分子量分别为7428和1420。经18度激光散 色的检测器测定比较，两者的直链淀粉和支链淀粉的质均相对分子量之间的相对相差4.8％。数据结果可靠。图3是水稻样本三的直链和支链淀粉图。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。