活细胞分析设备、分析活细胞的方法、分析活细胞的系统和非暂态数据存储介质

摘要

描述了与活细胞分析设备关联的方法和结构。一种活细胞分析设备可包括：至少一个数据处理器，其被构造成处理活细胞的一系列图像，以确定所述一个或多个活细胞的运动。所述运动可以是响应于施加的电刺激。可使用所述设备和所述方法用确定的运动来确定心肌细胞的不应期。

说明书

技术领域

本技术涉及细胞评价设备、细胞评价方法、数据分析设备和数据分析方法。更特别地，本技术涉及评价心肌细胞的状态和特性的技术。

背景技术

近年来，已经开发出在使用根据细胞培养技术制成的心肌细胞和心肌细胞层开发心脏疾病(诸如，心律失常)的新药物和模型测试时评价效果和安全性的技术。特别地，需要针对所有药物执行用于评价对心脏和心肌的毒性和副作用的心脏毒性测试，并且期望用使用培养细胞的非临床测试方法作为替换涉及动物实验的测试方法的替代方法。

心肌细胞评价方法的示例包括电极阵列(微电极阵列：EMA)方法(参见例如PTL1)和诸如钙成像方法的使用图像处理技术的方法(参见例如PTL2)。MEA方法是以下的方法：利用通过进出细胞的Na⁺、Ca²⁺、K⁺的流入物和流出物控制心肌细胞的收缩和舒张运动的事实并且评价因这个离子流入物和流出物造成的膜电势变化来执行评价。另一方面，钙成像方法是使用通过与钙离子键合而发射荧光的颜料(钙荧光指示剂)将细胞染色并且使用荧光显微镜等观察荧光的方法。

[引用列表]

[专利文献]

PTL1：JP 2013-94168 A

PTL2：JP 2013-21961 A

发明内容

根据一些实施例，一种活细胞分析设备可包括：电刺激器，其被布置成向一个或多个活细胞施加第一电刺激；以及图像采集设备，其被布置成采集所述一个或多个活细胞的一系列图像。所述活细胞分析设备还可包括至少一个数据处理器，所述数据处理器被构造成处理所述一系列图像，以确定响应于施加的所述第一电刺激的所述一个或多个活细胞的运动。

在一些实施例中，一种分析活细胞的方法包括以下动作：向一个或多个活细胞施加第一电刺激，用图像采集设备采集所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及通过至少一个数据处理器，用所述一系列图像，确定响应于施加的所述第一电刺激的所述一个或多个活细胞的运动。

根据一些实施例，一种分析活细胞的系统包括：电刺激器，其被布置成向一个或多个活心肌细胞施加第一电刺激；以及图像采集设备，其被布置成采集所述活心肌细胞的一系列图像。所述系统还可包括数据分析设备，所述数据分析设备连接到所述图像采集设备并且被构造成处理所述一系列图像，以确定响应于施加的第一电刺激的所述一个或多个活细胞的运动并且确定所述活心肌细胞的不应期。

一些实施例包括一种非暂态数据存储介质，所述非暂态数据存储介质存储机器可读指令，所述机器可读指令当在活细胞分析设备的至少一个数据处理器上执行时，致使所述活细胞分析设备：向一个或多个活心肌细胞施加电刺激，用图像采集设备采集所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及通过至少一个数据处理器，用所述一系列图像，确定响应于施加的所述电刺激的所述一个或多个活细胞的运动，并且基于确定的运动，计算所述一个或多个心肌细胞的不应期。

根据一些实施例，一种活细胞分析设备包括：电刺激控制器，其被构造成控制施加到一个或多个活细胞的电刺激；图像处理器，其被构造成从图像采集设备接收所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及至少一个数据处理器，其被构造成处理所述一系列图像以确定所述一个或多个活细胞的运动，其中，所述运动响应于施加的所述电刺激，并且其中，所述至少一个数据处理器被进一步构造成当所述一个或多个活细胞是心肌细胞时用确定的运动来确定心肌细胞的不应期。

[技术问题]

过去，使用心肌细胞的QT间隔来评价药物对心肌细胞造成的效果。作为对应于这个QT间隔的新指标，所谓的“不应期”受到关注。“不应期”是在心肌细胞开始收缩之后的一定时间段内抑制Na⁺流。然而，当前，还没有通过实验提出方法。

在以上说明的MEA方法中，使用被称为FDP(场电势持续时间)的指标作为类似于不应期的值来评价心肌细胞，但并不清楚这个FPD值是否匹配不应期。在MEA方法中，数据的数量取决于电极的数量，具有64个电极(数据的最大数量是64)的当前使用的设备难以随着观察范围变大确保有充足数量的数据。另外，在钙成像方法中，必须将细胞染色，因此，钙成像方法不适于长期测量。

因此，本公开的主要目的是提供能够在不进行染色的情况下推导心肌细胞的不应期的细胞评价设备、细胞评价方法、数据分析设备和数据分析方法。

[问题的解决方案]

根据本公开的一种活细胞分析设备包括：图像采集单元，其被构造成采集被施加电刺激的心肌细胞的运动图像；运动量计算单元，其被构造成用所述图像采集单元采集的图像数据来计算对应于电刺激施加的心肌信号的运动量；以及不应期计算单元，其被构造成基于指示心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算心肌细胞的不应期。

所述设备可包括电刺激控制单元，所述电刺激控制单元被构造成控制提供到心肌细胞的电刺激的施加条件。在该情况下，例如，所述电刺激控制单元将用于同步可刺激性的第一电刺激施加到心肌细胞的任何给定位置。

所述电刺激控制单元向心肌细胞施加所述第一电刺激，此后，可将与所述第一电刺激具有任何给定相位差的第二电刺激施加到与所述第一电刺激相同或不同的位置。

另外，所述电刺激控制单元可基于心肌细胞开始响应于所述第一电刺激而收缩的时间到心肌细胞保持最大舒张的时间来确定所述第一电刺激和所述第二电刺激之间的相位差。

此外，所述电刺激控制单元可在改变所述第一电刺激和所述第二电刺激之间的相位差的情况下向心肌细胞施加电刺激，直到心肌细胞不再起反应或者直到心肌细胞起反应。

另一方面，所述电刺激控制单元可基于在所述第一电刺激和所述第二电刺激之间具有不同相位差的两个或更多个波形信息来计算心肌细胞的不应期。

所述设备还可包括传播特性计算单元，所述传播特性计算单元被构造成用心肌细胞的运动量数据来计算心肌细胞的搏动的传播特性。

例如，所述传播特性是传播速度和传播方向中的至少一个。

根据本公开的一种细胞评价方法包括：向心肌细胞施加电刺激，由此采集所述心肌细胞的运动的图像；用采集的图像数据来计算与电刺激施加对应的心肌细胞的运动量；以及基于指示心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算心肌细胞的不应期。

所述细胞评价方法还可包括：用心肌细胞的运动量数据来计算心肌细胞的搏动的传播特性；以及使用相同的图像数据来计算传播特性并且计算不应期。

根据本公开的一种数据分析设备包括：运动量计算单元，其被构造成用被施加电刺激的心肌细胞的运动的图像数据来计算对应于电刺激施加的所述心肌细胞的运动量；以及不应期计算单元，其被构造成基于指示所述心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算所述心肌细胞的不应期。

所述设备还可包括传播特性计算单元，所述传播特性计算单元被构造成用所述心肌细胞的运动量数据来计算所述心肌细胞的搏动的传播特性。

根据本公开的一种数据分析方法包括：用被施加电刺激的心肌细胞的运动的图像数据来计算对应于电刺激施加的所述心肌细胞的运动量；以及基于指示所述心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算所述心肌细胞的不应期。

所述数据分析方法还可包括用所述心肌细胞的运动量数据来计算所述心肌细胞的搏动的传播特性，并且使用所述图像数据来计算所述传播特性并且计算所述不应期。

根据本公开的一种细胞评价系统包括：图像采集设备，其被构造成采集被施加电刺激的心肌细胞的运动；以及数据分析设备，其包括运动量计算单元，其被构造成用所述图像采集单元采集的图像数据来计算对应于电刺激施加的所述心肌细胞的运动量；以及不应期计算单元，其被构造成基于指示所述心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算所述心肌细胞的不应期。

一种根据本公开的程序，所述程序致使实现：用被施加电刺激的心肌细胞的运动的图像数据来计算对应于电刺激施加的所述心肌细胞的运动量的功能；以及基于指示所述心肌细胞的运动量的时间改变的波形信息来计算所述心肌细胞的不应期的功能。

[本发明的有利效果]

根据本公开，可在不进行染色的情况下，推导待评价的心肌细胞的不应期。应该注意的是，这里描述的效果不一定受限制，并且可仅仅实现本公开中描述的效果中的任一个。

附图说明

图1是示出根据本公开的第一实施例的细胞评价设备的构造示例的图。

图2A和图2B是示出具有电极的容器的构造示例的示意图。

图3是示出在使用没有任何电极的容器的情况下的电刺激施加方法的示意图。

图4是示出数据分析单元3的构造示例的图。

图5是示出电刺激施加单元4的构造示例的框图。

图6是示出使用如图1中所示的细胞评价设备10测量心肌细胞的不应期的方法的流程图示图。

图7是示出时间和运动量即数据分析单元计算出的运动量数据之间的关系的图。

图8A至图8D是示出施加电刺激的方法的图。

图9A是当电刺激S1-S2的相位差是335毫秒时的运动量数据，图9B是当相位差是340毫秒时的运动量数据。

图10是示出待评价心肌细胞的搏动的传播特性的等时指示上的电刺激S1、S2的施加位置的图。

图11A是当电刺激S1-S2的相位差是370毫秒时的运动量数据，图11B是当相位差是380毫秒时的运动量数据。

图12是示出待评价心肌细胞的搏动的传播特性的等时指示上的电刺激S1、S2的施加位置的图。

图13A是当电刺激S1-S2的相位差是390毫秒时的运动量数据，图13B是当相位差是395毫秒时的运动量数据。

图14A是当电刺激S1-S2的相位差是335毫秒时的运动量数据，图14B是当相位差是340毫秒时的运动量数据。

图15是示出当经过不应期的时间点的估计结果的图，该估计结果示出在待评价心肌细胞的搏动的传播特性的等时指示上。

图16是示出根据本公开的第二实施例的细胞评价设备的数据分析单元30的构造示例的图。

图17是示出同时执行心肌细胞不应期测量和传播特性测量的根据本公开的第二实施例的使用细胞评价设备的方法的流程图。

图18是示出传播速度计算方法的图。

图19是示出另一种传播速度计算方法的图。

图20是示出另一种传播速度计算方法的图。

图21是示出用于估计螺旋折返现象的出现条件的估计方法的图。

图22是示出各向异性可刺激性传播的图。

图23是示出根据本公开的第三实施例的细胞评价系统的示意性构造的图。

具体实施方式

下文中，将参照附图详细地说明用于执行本公开的实施例。应该注意，本公开不限于以下示出的实施例。将按以下次序说明实施例。

1.第一实施例(执行心肌细胞的不应期测量的细胞评价设备的示例)

2.第二实施例(同时执行心肌细胞的不应期测量和传播特性测量的细胞评价设备的示例)

3.第三实施例(执行心肌细胞的不应期测量的细胞评价系统的示例)

<1.第一实施例>

整体构造

首先，将说明根据本公开的第一实施例的细胞评价设备。图1是示出根据本实施例的细胞评价设备的构造示例的图。根据本实施例的细胞评价设备10被构造成测量心肌细胞的不应期并且基于结果来评价心肌细胞，并且如图1中所示，根据本实施例的细胞评价设备10包括图像拍摄单元1、图像数据生成单元2、数据分析单元3、电刺激施加单元4、评价单元5、指示单元6等。如上所述，“不应期”是在心肌细胞开始收缩之后的一定时间段内抑制Na⁺流的时间段。当以比不应期长的间隔施加诸如电力的刺激时，Na⁺流入并且心肌细胞中有响应。另一方面，当以比不应期短的间隔施加诸如电力的刺激时，Na通道被禁用，因此，抑制Na⁺流入，在心肌细胞中没有响应。在本实施例的示例中，以多个间隔施加电刺激，用运动量数据的改变来分析心肌细胞存在/不存在响应，并且计算不应期。

评价细胞

根据本实施例的细胞评价设备10评价的细胞可以是包括心肌细胞的细胞，不仅包括通过细胞培养技术制成的心肌细胞、心肌细胞团、心肌细胞层和心肌组织，而且包括心脏部分等。

图像采集单元1

图像采集单元1被构造成采集已经被施加电刺激的心肌细胞的运动图像，图像采集单元1包括图像采集装置11、物镜12、样本台13、照射光源14、容器15等。图1示出使用倒置显微镜采集图像的情况下的构造示例，但本公开不限于此，并且还可使用诸如立体显微镜和正置显微镜的其他类型的显微镜。可供选择地，在不使用显微镜的情况下，可通过包括镜头和图像采集装置的相机采集图像。

另一方面，容器15可以是能够容纳待评价心肌细胞并且向其施加电刺激的容器。例如，可使用具有内嵌多个微电极的电极的容器。图2A和图2B是示出具有电极的容器的构造示例的示意图。容器15中的电极的数量和电极的安装不特别限于此。如图2A中所示，多个电极15a可被设置成端部部分之间有一定间隔，或者如图2B中所示，一对电极15a、15b可设置在任何给定位置。

另外，容器15可以是没有内嵌电极的容器。图3是示出在使用没有电极的容器的情况下的电刺激施加方法的示意图。在这种情况下，例如，如图3中所示，可通过将一对微电极41a、41b与保持在培养液8中的心肌细胞7的任何给定部分接触来施加电刺激。

图像数据生成单元2

图像数据生成单元2基于图像采集单元1提供的图像信号来生成评价目标图像数据，并且将生成的评价目标图像数据记录和保存到例如内部记录介质。这里生成的评价目标图像数据是例如从施加电刺激的时间到经过一定时间段的时间得到的运动图片数据。

图像数据生成单元2可只从图像采集单元1提供的多个帧图像中提取有限时间段内的帧图像，并且可生成评价目标图像数据。图像数据生成单元2可提取图像采集单元1提供的各帧图像的区域的一部分作为小帧图像，并且将包括小帧图像的运动图片转变成评价目标图像数据。

另外，图像数据生成单元2可对图像采集单元1提供的各帧图像应用任何给定的图像处理，并且可将其图像处理结果转变成评价目标图像数据。图像处理的示例包括放大、减小、旋转、变形、校正亮度和色度、锐度、图像中的降噪、中间帧图像生成等，但图像处理不限于此。可应用各种类型的图像处理。

数据分析单元3

图4是示出数据分析单元3的构造示例的图。数据分析单元3被构造成基于图像数据生成单元2生成的评价目标图像数据来检测心肌细胞的运动，并且用运动矢量的大小(运动量)来计算初始相位差X(毫秒)和不应期。然后，如图4中所示，数据分析单元3设置有运动检测单元31、运动量计算单元32、不应期计算单元33等。

运动检测单元31对图像数据生成单元2生成的评价目标图像数据的各块执行运动检测，并且将检测结果(运动矢量)作为运动检测数据输出到运动量计算单元32。运动检测单元31检测心肌细胞所依照的运动检测方法不特别受限制，但是例如可以使用以下方法：使用块匹配，检测图像中的任何给定点已经在预定时间段内移动多远。

运动量计算单元32基于运动检测单元31检测到的各个运动检测数据来计算运动量，并且将结果作为运动量数据输出到电刺激施加单元4或不应期计算单元33。运动量计算单元32的运动量计算方法不受特别限制，但是例如存在将接收到的运动检测数据划分成新块并且计算各块中的平均运动量的方法。

不应期计算单元33被构造成用运动量计算单元32计算出的运动量数据来推导评价目标心肌细胞的不应期。将不应期计算单元33计算出的结果作为不应期数据输出到评价单元5、指示单元6、打印机(未示出)、存储单元(未示出)等。

电刺激施加单元4

图5是示出电刺激施加单元4的构造示例的图。电刺激施加单元4被构造成向评价目标心肌细胞施加电刺激，并且如图5中所示，电刺激施加单元4包括相位差确定单元42、电刺激控制单元43、电源44和电极41等。在这种情况下，电极41可以是能够向心肌细胞施加电刺激的任何东西，并且可以是内嵌容器15中的微电极15a、15b、与容器15分开设置的微电极41a、41b等。

相位差确定单元42被构造成基于接收到的运动量数据，检测初始相位差X和施加到心肌细胞的两种类型的电刺激S1、S2的相位差。相位差确定单元42确定的结果(相位差)被输出到电刺激控制单元43。在正常状态下，不应期指示接近从开始收缩到最大舒张的相位差的值，因此，初始相位差X可以是例如从评价目标心肌细胞的开始收缩到最大舒张的相位差(毫秒)，并且在这种情况下，不必彻底分配刺激相位差，并且可在较短时间内检测到不应期。

电刺激控制单元43被构造成基于相位差确定单元42确定的结果(相位差)等来控制施加到容器15中容纳的心肌细胞的电刺激的条件。由电刺激控制单元43控制的施加条件包括施加位置、施加点的数量、施加时间、电压等。

评价单元5

评价单元5被构造成基于数据分析单元3计算出的不应期来评价心肌细胞。由评价单元5评价的心肌细胞的评价内容不受特别限制，但是例如是不应期区域的估计、心肌毒性评价、当制成心肌细胞层时层同源性的评价、螺旋折返现象的出现条件的估计等。

指示单元6

指示单元6被构造成指示不应期计算单元33计算出的不应期数据、与其相关的信息和评价单元5得到的评价结果。

操作

随后，将说明本实施例的细胞评价设备10的操作。更具体地，将说明使用细胞评价设备10测量心肌细胞的不应期的方法。图6是示出使用细胞评价设备10来评价心肌细胞不应期的方法的流程图示图。如图6中所示，当细胞评价设备10测量心肌细胞的不应期时，将容纳待评价的心肌细胞、心脏部分等的容器15布置在图像采集单元1的样本台13上。

然后，电刺激施加单元4将同步电刺激S1施加到心肌细胞的任何给定位置，图像采集单元1采集因电刺激S1造成的心肌细胞的运动图像，并且图像数据生成单元2生成图像数据。使用图像数据的数据分析单元3分析心肌细胞的搏动，并且基于得到的运动量数据，电刺激施加单元4确定初始相位差X(毫秒)。

图7是示出时间和运动量即数据分析单元计算出的运动量数据之间的关系的图。如图7中所示的运动量数据指示通过块匹配处理计算出的相对于时间的移动量，块匹配处理用于检测上述图像中的任何给定点在预定时间段内移动多远。例如，可用如图7中所示的舒张峰值时间和收缩开始时间之间的差异来计算初始相位差X。

随后，电刺激施加单元4从任何给定位置施加同步电刺激S1一次或多次，此后，施加具有与初始相位差X相同的相位差的电刺激S2，并且根据与上述方法相同的方法，数据分析单元3分析心肌细胞的搏动。更具体地，通过使用图像采集单元1采集的并且由图像数据生成单元2生成的图像，数据分析单元3计算心肌细胞的运动量。

图8A至图8D是示出电刺激的施加位置和施加方法的图。电刺激S1、S2可如图8A中所示施加到同一部分，或者可如图8B中所示从不同部分施加。可供选择地，电刺激S1、S2可被施加到多个位置，并且在这种情况下，多个电刺激S1、S2可如图8C中所示被施加到同一部分，但电刺激S2可如图8D中所示被施加到与电刺激S1不同的多个部分。

当确定由于搏动分析而导致心肌细胞响应于电刺激S2起反应时，电刺激施加单元4再施加电刺激S1一次或多次，此后，电刺激施加单元4施加具有(X-10)毫秒的相位差的电刺激S2，并且数据分析单元3分析心肌细胞的搏动。在改变相位差时，进行电刺激S2的施加和搏动分析，直到心肌细胞不再对电刺激S2起反应，并且推导不再使心肌细胞起反应的细胞不应期差异Y₁(毫秒)。

另一方面，当心肌细胞不对电刺激S2起反应时，电刺激施加单元4再施加电刺激S1一次或多次，此后，电刺激施加单元4施加具有(X+10)毫秒的相位差的电刺激S2，并且数据分析单元3分析心肌细胞的搏动。在改变相位差时，进行电刺激S2的施加和搏动分析，直到细胞对电刺激S2起反应，并且推导使心肌细胞起反应的细胞反应期差异Y₂(毫秒)。在这种情况下，可通过分析心肌细胞的运动量数据，自动地确定心肌细胞的反应存在与否。例如，推导电刺激之前和之后波形的相关性，并且当相关性高时，确定心肌细胞没有起反应，而当相关性低时，确定心肌细胞起反应。

此后，不应期计算单元33用上述的细胞不应期差异Y₁(毫秒)和细胞反应期差异Y₂(毫秒)来计算评价目标心肌细胞的不应期。图9A是在电刺激S1-S2的相位差是335毫秒的情况下的运动量数据。图9B是在相位差是340毫秒的情况下的运动量数据。如图9A中所示，在电刺激S1-S2的相位差被构造成是335毫秒的情况下的搏动分析结果中，似乎没有因电刺激S2而造成心肌细胞起反应。

相比之下，在如图9B中所示的电刺激S1-S2的相位差是340毫秒的情况下的搏动分析结果中，似乎存在因电刺激S2而造成心肌细胞起反应。因此，对于这个心肌细胞，经计算，细胞不应期差异Y₁是335毫秒，并且经计算，细胞反应期差异Y₂是340毫秒。然后，用这些计算结果推导出，心肌细胞的不应期是335ms至340ms。根据以上方法计算出的不应期数据由指示单元6进行指示，并且用于评价心肌细胞的同源性，评价心脏毒性等。例如，当评价心肌细胞层的同源性时，在改变同一心肌细胞层内的电刺激施加位置时，执行不应期测量，并且指示位置信息以及不应期数据，使得以可视化方式指示同源性。当评价因施药造成的心肌毒性时，比较施药时的心肌细胞和不施药时的心肌细胞的不应期时间数据，使得以定量方式评价因施药造成的不应期延长。

根据以上方法计算出的不应期数据可在指示单元6上指示，或者可被输出到评价单元5，以被用于评价心肌细胞。例如，当以单层方式培养心肌细胞时，心肌细胞可部分地包括不执行可刺激性传播的细胞，并且层内的不应期会有所不同。因此，可在改变同一心肌细胞层内的电刺激施加位置时，执行不应期测量，使得可评价心肌细胞层内的不应期的变化。

图10和图12是示出评价目标心肌细胞的搏动的传播特性的等时指示上示出的电刺激S1、S2的施加位置的图。图11A和图11B是示出当向如图10中所示的位置施加电刺激时的搏动分析结果的图，图13A和图13B是当向如图12中所示的位置施加电刺激时的搏动分析结果的图。

在如图10和图12中所示的等时指示中，识别波形信息中的各波形的上升时间，其差异在预定范围内的波形被转变成相等时间框，并且以相同颜色指示相等时间框中的每个。在图10和图12中，用较暗颜色指示上升时间较早的框，并且当上升时间处于随后时间点时，用较亮颜色指示框。等时指示允许容易地理解搏动在心肌细胞层中如何传播。可针对每个搏动得到这个等时指示，因此，可更详细地评价搏动的稳定性。

例如，图10中示出的等时线指示施加到点A的电刺激S1造成的可刺激性花费6毫秒到达电刺激S2的施加位置(点B)。如图11A中所示，当电刺激S1-S2的相位差是370毫秒时，搏动分析结果表明没有因电刺激S2造成心肌细胞起反应。另一方面，如图11B中所示，当电刺激S1-S2的相位差是380毫秒时，搏动分析结果表明因电刺激S2造成心肌细胞起反应。

因此，在这个心肌细胞层中，经计算，细胞不应期差异Y₁是370毫秒，并且经计算，细胞反应期差异Y₂是380毫秒。不应期是等于或大于(细胞不应期差异Y₁-传播从S1前进至S2的时间)和等于或小于(细胞反应期差异Y₂-传播从S1前进至S2的时间)的范围内，因此，推导出不应期是365ms至375ms。

另一方面，用图12中示出的等时线，要理解，施加到点C的电刺激S1造成的可刺激性到达电刺激S2的施加位置(点D)所花费的时间是6毫秒。如图13A中所示，当电刺激S1-S2的相位差是390毫秒时，搏动分析结果表明没有因电刺激S2造成心肌细胞起反应。另一方面，如图13B中所示，当电刺激S1-S2的相位差是395毫秒时，搏动分析结果表明因电刺激S2造成心肌细胞起反应。

因此，在这个心肌细胞层中，经计算，细胞不应期差异Y₁是390毫秒，并且经计算，细胞反应期差异Y₂是395毫秒，并且推导出点D的心肌细胞的不应期是384ms至389ms。评价目标心肌细胞层上的点B和点D之间的距离是900微米。根据以上结果，确认在这个心肌细胞层中的不应期中存在变化。

当使用不应期测量结果时，可以估计在施加电刺激S1之后理论上哪个区域是处于不应期和在施加电刺激S1之后心肌细胞在哪个时间点接受外部刺激。图14A是当电刺激S1-S2的相位差是335毫秒时的运动量数据，图14B是当相位差是340毫秒时的运动量数据。根据图14A和图14B中示出的结果，要理解，评价目标心肌细胞的不应期是335至340毫秒。

图15是示出当经过评价目标心肌细胞的搏动的不应期的时间点的估计结果的图。根据图15中示出的等时线评价结果，传播从电刺激S1的施加位置前进至点A至E中的各点所花费的时间如下：推导出到点A的时间是25毫秒，推导出到点B的时间是20毫秒，推导出到点C的时间是15毫秒，推导出到点D的时间是20毫秒，并且推导出到点E的时间是25毫秒。以上结果指示，当对于点A至E中的每个处的电刺激S1而言在点A以360至365毫秒的相位差、在点B以355至360毫秒的相位差、在点C以350至355毫秒的相位差、在点D以355至365毫秒的相位差和在点E以360至365毫秒的相位差施加电刺激S2时，经估计，各点处的细胞正处于不应期。基于估计值，实际在各点施加电刺激S2，使得可评价心肌细胞层中的不应期的变化。

可通过执行用于实现信息处理设备的各功能的计算机程序并且实现个人计算机上的计算机程序等，实现计算上述心肌细胞的运动量的步骤和计算心肌细胞的不应期的步骤。此计算机程序可被存储于例如记录介质(诸如，磁盘、光盘、磁-光盘和闪存存储器)或借助网络进行分布。

如详细描述的，根据本实施例的细胞评价设备使用运动矢量分析等，并且可在不进行染色的情况下，推导心肌细胞的不应期。因此，可以以比过去更简单的方式和更高的准确度来评价开发心脏疾病的新药物和模型测试时的效果和安全性。可采用心肌细胞层中的不应期的变化作为指标，使得可评价心肌细胞的均匀性。另外，根据本实施例的细胞评价设备可在长时间段内评价心肌细胞。

<2.第二实施例>

整体构造

随后，将说明根据本公开的第二实施例的细胞评价设备。近年来，在致心律失常评价中，提出仅具有QT延长的评价是不足的，特别地，已知当特别地出现诸如心室纤颤的严重危重症时，出现心肌细胞之间的电信号的传播异常(传播速度、传播方向)。出于此原因，还没有报告与如上所述的不应期测量的同时评价心肌细胞传播异常的技术。因此，本申请的发明人使用利用运动矢量分析的运动检测技术，并且可同时执行心肌细胞的传播评价和不应期测量。

更具体地，在根据本实施例的细胞评价设备中，数据分析单元同时执行评价目标心肌细胞的不应期计算和传播特性计算。图16是示出根据本实施例的细胞评价设备的数据分析单元30的构造示例的框图。图17是示出使用根据本实施例的细胞评价设备同时执行心肌细胞不应期测量和传播特性测量所依照的方法的流程图。在图16中，用相同的参考标号指代与图4中示出的数据分析单元3的构成元件相同的构成元件，并且省略对其的详细描述。

数据分析单元30

如图16中所示，根据本实施例的细胞评价设备，数据分析单元30设置有传播特性计算单元34，并且被构造成能够在进行不应期测量的同时计算传播特性(诸如，传播速度和传播方向)。在根据本实施例的细胞评价设备中，除了以上外的构造与以上说明的第一实施例相同。

操作

随后，将说明根据本实施例的细胞评价设备用于同时执行心肌细胞的不应期测量和传播特性测量的方法。当根据本实施例的细胞评价设备测量心肌细胞的不应期和传播特性时，将容纳待评价的心肌细胞、心脏部分等的容器15布置在图像采集单元1的样本台13上，如同以上说明的第一实施例。

然后，电刺激施加单元4将同步电刺激S1施加到心肌细胞的任何给定位置，图像采集单元1采集因电刺激S1造成的心肌细胞的运动图像，并且图像数据生成单元2生成图像数据。使用图像数据，数据分析单元30分析心肌细胞的搏动，并且基于得到的运动量数据，计算可磁性的传播速度，并且电刺激施加单元4确定初始相位差X(毫秒)。

图18至图20是示出传播速度计算方法的图。传播速度的计算方法不受特别限制，并且可以是全局传导速率、局部传导速率、平均传导速率等。如图18中所示，全局传导速率是以下方法：将图像数据划分成任何给定大小，找到在细胞层中的最终传输可刺激性的地方，测量可刺激性前进到一定位置所花费的时间并且计算速度。

如图19中所示，本地传导速率是以下方法：将图像数据划分成任何给定大小，选择任何给定位置，测量可刺激性传播到各位置所花费的时间，并且计算速度V_i(＝距离/传播时间)。如图19中所示，平均传导速率是以下的方法：将图像数据划分成任何给定大小并且提取与刺激施加位置相距距离的点，然后推导可磁性传播至各位置的传播速度V₁至V₈，并且推导平均值及其标准偏差。

在这些计算方法之中，特别地，平均传导速率是优选的，因为依据传播速度的变化来执行评价，从而能够评价传播的各向异性。

随后，电刺激施加单元4从任何给定位置施加同步电刺激S1一次或多次，此后，施加具有与初始相位差X相同的相位差的电刺激S2，并且根据与上述方法相同的方法，数据分析单元30根据与上述方法相同的方法，分析心肌细胞的搏动。更具体地，图像采集单元1采集图像，并且通过使用图像数据生成单元2生成的图像，数据分析单元30计算心肌细胞的运动量。

当确定由于搏动分析而导致心肌细胞响应于电刺激S2起反应时，电刺激施加单元4再施加电刺激S1一次或多次，此后，电刺激施加单元4施加具有(X-10)毫秒的相位差的电刺激S2，并且数据分析单元30分析心肌细胞的搏动。在改变相位差时，进行电刺激S2的施加和搏动分析，直到心肌细胞不再对电刺激S2起反应，并且推导不再使心肌细胞起反应的细胞不应期差异Y₁(毫秒)。

另一方面，当心肌细胞不对电刺激S2起反应时，电刺激施加单元4再施加电刺激S1一次或多次，此后，电刺激施加单元4施加具有(X+10)毫秒的相位差的电刺激S2，并且数据分析单元3分析心肌细胞的搏动。在改变相位差时，进行电刺激S2的施加和搏动分析，直到细胞不再对电刺激S2起反应，并且推导不再使心肌细胞起反应的细胞反应期差异Y₂(毫秒)。

此后，不应期计算单元33用上述的细胞不应期差异Y₁(毫秒)和细胞反应期差异Y₂(毫秒)来计算评价目标心肌细胞的不应期。根据以上方法计算出的不应期数据和传播特性数据可在指示单元6上指示，或者可被输出到评价单元5，以被用于评价心肌细胞。

根据本实施例的细胞评价设备使用数据并且可评价传播速度、传播方向和不应期，因此，对于诸如心肌毒性测试的药物安全测试而言，根据本实施例的细胞评价设备是特别有效的。另外，根据本实施例的细胞评价设备还可应用于已知是致命心室纤颤成因的螺旋折返(spiral re-entry)的出现条件估计。

在这种情况下，考虑螺旋折返的成因如下。

(1)当存在心肌细胞层的部分中的细胞不处于不应期时，在此时施加外部刺激。

(2)可刺激性传播到仅仅不处于不应期的部分，使得出现各向异性可刺激性传播。

(3)可刺激性传播接连地传播到不处于不应期的部分，因此，当传播速度满足一定条件时，可刺激性传播一直持续。

如可从上文中明白的，要理解，在出现螺旋折返的阶段中，各向异性可刺激性传播的出现是重要的。

图21是示出螺旋折返现象的出现条件估计方法的图。图22是示出各向异性可刺激性传播的图。例如，当使用如图21中所示的不应期区域的估计结果并且在整个心肌细胞层不处于不应期之前施加电刺激S2时，可造成各向异性可刺激性传播。然后，可通过评价各向异性可刺激性传播的传播速度来预测是否出现螺旋折返。

更具体地，当在与电刺激S1的相位差是360毫秒的位置(点E)向图21中示出的心肌细胞层施加电刺激S2时，发现图22中示出的各向异性可刺激性传播。在这个评价中，电刺激S2造成的可刺激性返回已经被施加电刺激S2的位置(点E)所花费的时间是35毫秒，细胞的不应期是335至340毫秒，因此，没有出现螺旋折返。然而，当传播速度显著下降并且因为某种原因使不应期减少时，有可能可出现螺旋折返。

如上所述，通过使用根据本实施例的细胞评价设备，可同时评价传播速度、传播方向和不应期，可预测有危害的外部刺激，并且可执行模拟条件下的药物评价。在根据本实施例的细胞评价设备中，除了以上外的构造与以上说明的第一实施例相同。

以上说明的根据第一实施例和第二实施例的细胞评价设备以一系列操作执行电刺激施加和搏动分析，但本公开不限于此。例如，通过预先改变条件来施加电刺激，并且将其结果存储于设备的存储单元或单独设置的存储介质。然后，与测量设备不同的设备或数据分析设备中的数据分析单元分析图像数据，计算心肌细胞的不应期，计算传播速度和传播方向，并且还可评价它们。

<3.第三实施例>

随后，将说明根据本公开的第三实施例的细胞评价系统。图23是示出根据本实施例的细胞评价系统的示意性构造的图。如图23中所示，根据本实施例的细胞评价系统包括：图像采集设备50，其被构造成采集已经被施加电刺激的心肌细胞的运动的图像；以及数据分析设备，其包括运动量计算单元和不应期计算单元。另外，根据本实施例的细胞评价系统可连接到服务器、显示设备等。

图像采集设备50

图像采集设备50可以是能够采集已经被施加电刺激的心肌细胞的运动图像的任何设备，并且可以是具有图像采集装置的各种类型的显微镜和相机。可用于以上说明的第一实施例相同的方式来构造容器等。

数据分析设备60

数据分析设备包括：运动量计算单元，其被构造成用图像采集设备50采集的图像数据来计算对应于电刺激施加的心肌细胞的运动量；以及不应期计算单元，其被构造成基于指示心肌细胞运动量的时间变化的波形信息来计算心肌细胞的不应期。除了以上外的构造与以上说明的第一实施例和第二实施例的构造相同。

服务器

服务器借助网络连接到图像采集设备50、数据分析设备60、显示设备等，并且设置有信息存储单元等。服务器管理从图像采集设备50和数据分析设备60上传的各种类型的数据，并且在请求时将数据输出到显示设备和数据分析设备60。

显示设备

显示设备显示图像采集设备50测得的电特性的数据和数据分析设备60计算出的各种类型的数据等。应该注意，显示设备可设置有允许用户选择并且输入显示数据的信息输入单元。在这种情况下，用户输入的信息借助网络传输到服务器和数据分析设备60。

根据本实施例的细胞评价系统还可同时评价传播速度、传播方向和不应期，可预测有危害的外部刺激，并且可在不进行染色的情况下推导评价目标心肌细胞的不应期。在根据本实施例的细胞评价系统中，除了以上外的构造和优点与第一实施例和第二实施例的构造和优点相同。

本公开还可如下进行构造。

(1)一种活细胞分析设备，所述活细胞分析设备包括：电刺激器，其被布置成向一个或多个活细胞施加第一电刺激；图像采集设备，其被布置成采集所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及至少一个数据处理器，其被构造成处理所述一系列图像，以确定响应于施加的所述第一电刺激所述一个或多个活细胞的运动。

(2)根据(1)所述的设备，其中，所述至少一个处理器被进一步构造成当所述一个或多个活细胞是心肌细胞时用确定的运动来确定心肌细胞的不应期。

(3)根据(1)或(2)所述的设备，其中，所述电刺激器被构造成施加用于同步心肌细胞的第一电刺激，所述至少一个数据处理器被进一步构造成处理心肌细胞的一系列图像，以确定心肌细胞的初始收缩和心肌细胞的舒张时间之间的第一相位延迟。

(4)根据(3)所述的设备，其中，所述电刺激器被构造成在与所述第一电刺激相比延迟了选择性变化的第二相位延迟的第二时间施加第二电刺激。

(5)根据(4)所述的设备，其中，所述第二相位延迟被初始设置成等同于所述第一相位延迟。

(6)根据(4)或(5)所述的设备，其中，所述至少一个处理器被进一步构造成用至少确定的运动和所述第二相位延迟的值来确定心肌细胞的不应期。

(7)一种分析活细胞的方法，所述方法包括以下动作：向一个或多个活细胞施加第一电刺激，用图像采集设备采集所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及通过至少一个数据处理器，用所述一系列图像，确定响应于施加的所述第一电刺激所述一个或多个活细胞的运动。

(8)根据(7)所述的方法，所述方法还包括：当所述一个或多个活细胞是心肌细胞时用确定的运动来确定心肌细胞的不应期。

(9)根据(8)所述的方法，所述方法还包括：当没有用药物治疗第一心肌细胞时用第一确定运动数据来确定所述第一心肌细胞的第一不应期，当用药物治疗第二心肌细胞时用第二确定运动数据来确定所述第二心肌细胞的第二不应期，并且将所述第一不应期和所述第二不应期进行比较。

(10)根据(7)至(9)中的任一项所述的方法，所述方法还包括：施加用于同步心肌细胞的所述第一电刺激并且通过所述至少一个数据处理器来确定心肌细胞的初始收缩和心肌细胞的舒张时间之间的第一相位延迟。

(11)根据(10)所述的方法，所述方法还包括：在与所述第一电刺激相比延迟了选择性变化的第二相位延迟的第二时间施加第二电刺激。

(12)根据(11)所述的方法，所述方法还包括将第二相位延迟初始设置成等同于所述第一相位延迟。

(13)根据(11)或(12)所述的方法，所述方法还包括用至少确定的运动和所述第二相位延迟的值来确定心肌细胞的不应期。

(14)根据(8)至(13)中的任一项所述的方法，其中，计算所述不应期包括生成代表确定的运动的至少一个波形，并且分析所述至少一个波形来计算所述不应期。

(15)根据(11)至(14)中的任一项所述的方法，其中，计算所述不应期包括改变所述第二相位延迟，直到心肌细胞不再响应于所述第二电刺激和/或直到心肌细胞响应于所述第二电刺激。

(16)根据(8)至(15)中的任一项所述的方法，所述方法还包括：用心肌细胞的确定的运动来确定传播速度和/或传播方向。

(17)根据(16)所述的方法，其中，用相同的所述一系列图像来确定传播速度和/或传播方向和不应期。

(18)根据(8)至(17)中的任一项所述的方法，所述方法还包括：将至少所述第一电刺激的位置变成一个或多个位置，确定对应于所述一个或多个位置的不应期，并且用确定的与所述一个或多个位置关联的不应期来确定响应于心肌细胞的同源性。

(19)一种分析活细胞的系统，所述系统包括：电刺激器，其被布置成向一个或多个活心肌细胞施加第一电刺激；图像采集设备，其被布置成采集所述活心肌细胞的一系列图像；以及数据分析设备，其连接到所述图像采集设备并且被构造成处理所述一系列图像，以确定响应于施加的第一电刺激的所述一个或多个活细胞的运动并且确定所述活心肌细胞的不应期。

(20)一种非暂态数据存储介质，所述非暂态数据存储介质存储机器可读指令，所述机器可读指令当在活细胞分析设备的至少一个数据处理器上执行时，致使所述活细胞分析设备向一个或多个活心肌细胞施加电刺激，用图像采集设备采集所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及通过至少一个数据处理器，用所述一系列图像，确定响应于施加的所述电刺激所述一个或多个活细胞的运动，并且基于确定的运动，计算所述一个或多个心肌细胞的不应期。

(21)一种活细胞分析设备，所述活细胞分析设备包括：电刺激控制器，其被构造成控制施加到一个或多个活细胞的电刺激；图像处理器，其被构造成从图像采集设备接收所述一个或多个活细胞的一系列图像；以及至少一个数据处理器，其被构造成处理所述一系列图像以确定所述一个或多个活细胞的运动，其中，所述运动响应于施加的所述电刺激，并且其中，所述至少一个数据处理器被进一步构造成当所述一个或多个活细胞是心肌细胞时用确定的运动来确定心肌细胞的不应期。

本说明书中描述的优点仅仅是示例，实施例不限于此，而是可具有其他优点。

本领域的技术人员应该理解，根据设计要求和其他因素，可出现各种修改形式、组合形式、子组合形式和替代形式，只要他们在随附权利要求书或其等同物的范围内。

[参考符号列表]

1 图像采集单元

2 图像数据生成单元

3、30 数据分析单元

4 电刺激施加单元

5 评价单元

6 指示单元

7 心肌细胞

8 培养液

10 细胞评价设备

11 图像采集装置

12 物镜

13 样本台

14 照射光源

15 容器

15a、15b、41、41a、41b 电极

31 运动检测单元

32 运动量计算单元

33 不应期计算单元

42 相位差确定单元

43 电刺激控制单元

44 电源

50 图像采集设备

60 数据分析设备。